Dit protocol beschrijft een nieuwe methode om te maken een ruimtelijk gedetailleerde eindige elementen-model van de intracellulaire architectuur van cardiomyocytes van elektronenmicroscopie en confocale microscopie afbeeldingen. De kracht van dit ruimtelijk gedetailleerd model wordt aangetoond door middel van case-studies in calcium signalering en Bioenergetica.
Met de komst van driedimensionale (3D) imaging-technologieën zoals Elektronentomografie, seriële-blok-face scanning elektronen microscopie en confocale microscopie, de wetenschappelijke gemeenschap tot ongekende toegang tot grote gegevenssets sub micrometer resolutie die kenmerkend zijn voor de architecturale remodelleren die begeleidt wijzigingen in functie van de cardiomyocyte in gezondheid en ziekte. Echter, deze datasets zijn onderbezet voor het onderzoeken van de rol van cellulaire het platform remodelleren in cardiomyocyte functie. Het doel van dit protocol is te schetsen hoe maak je een nauwkeurige eindige elementen-model van een cardiomyocyte met behulp van hoge resolutie elektronenmicroscopie en confocale microscopie beelden. Een gedetailleerd en nauwkeurig model van cellulaire het platform heeft aanzienlijke mogelijkheden om te bieden van nieuwe inzichten in cardiomyocyte biologie, meer dan alleen experimenten kunnen garner. De kracht van deze methode ligt in zijn vermogen om te fuseren computationeel informatie van twee ongelijksoortige beeldvormende modaliteiten van cardiomyocyte ultrastructuur te ontwikkelen van een uniforme en gedetailleerd model van de cardiomyocyte. Dit protocol schetst stappen Elektronentomografie en confocale microscopie beelden van volwassen mannelijke (naam voor een specifiek hondenras albino rat) Wistar rat cardiomyocytes te ontwikkelen van een model van de half-Sarcomeer eindige elementen van de cardiomyocyte te integreren. De procedure genereert een 3D eindige elementen-model dat een nauwkeurige, high-resolution voorstelling bevat (over de volgorde van ~ 35 nm) van de verdeling van de mitochondriën, de myofibrils en de ryanodine receptor clusters die de nodige calcium voor cardiomyocyte vrijgeven samentrekking van het sarcoplasmic reticulaire netwerk (SR) in de myofibril en cytosolische compartiment. Het model gegenereerde hier als een illustratie niet details van de transverse-zaadvormende architectuur of het sarcoplasmic reticulaire netwerk opgenomen en daarom een minimale model van de cardiomyocyte is. Niettemin, het model al kan worden toegepast in simulatie gebaseerde onderzoek naar de rol van de celstructuur in calcium, signalering en mitochondriaal Bioenergetica, die wordt geïllustreerd en besproken met behulp van de twee case-studies die zijn ingediend na de gedetailleerde protocol.
Excitatie-contractie koppeling (ECC) in het hart verwijst naar de belangrijke en ingewikkelde koppeling tussen elektrische excitatie van de cardiomyocyte membraan en de latere mechanische contractie van de cel tijdens elke hartslag. Wiskundige modellen hebben een belangrijke rol bij de ontwikkeling van een kwantitatief begrip van de onderling met elkaar verbonden biochemische processen die regelen de actiepotentiaal1, cytosolische calcium signalering2, Bioenergetica3, en de daaropvolgende contractiele strijdkrachtgeneratie. Dergelijke modellen hebben ook met succes voorspelde veranderingen in de hartslag wanneer één of meerdere van deze biochemische processen ondergaan veranderingen4,5. De zeer georganiseerde ultrastructuur van de cardiomyocyte is steeds meer erkend om te spelen een cruciale rol in de normale contractiele functie van de cel en het hele hart. Inderdaad, de morfologie en de organisatie van onderdelen van cardiale ultrastructuur wordt gewijzigd in parallel aan biochemische veranderingen in ziekten zoals hypertrofie6, hartfalen7en diabetische cardiomyopathie8. Of deze structurele veranderingen zijn kleine, adaptieve of pathologische reacties aan de veranderende biochemische voorwaarden is nog grotendeels onbekend9. De intrinsiek nauwe koppeling tussen vorm en functie in de biologie betekent dat de experimentele studies alleen meer inzicht dan correlaties tussen structurele remodelleren en cardiomyocyte functie niet kunnen bieden. Een nieuwe generatie van wiskundige modellen die de structurele samenstelling van de sub cellulaire componenten samen met de goed bestudeerde biochemische processen, kunt opnemen zijn nodig om een uitgebreide, kwantitatief begrip van de relatie tussen structuur, biochemie en contractiele kracht in cardiomyocytes. Dit protocol wordt beschreven methoden die kunnen worden gebruikt voor het genereren van structureel nauwkeurige eindige elementen modellen van cardiomyocytes, die kunnen worden gebruikt voor dergelijke onderzoeken.
Het laatste decennium heeft gezien aanzienlijke vooruitgang in 3D elektronenmicroscopie10, confocal11en super resolutie microscopie12 die ongekende, high-resolution inzicht verwerven in de vergadering van de nano-schaal en micro-schaal van de sub cellulaire componenten van de cardiomyocyte. Onlangs, deze datasets werden gebruikt voor het genereren van rekenmodellen cardiomyocyte ultrastructuur13,14,15,16. Deze modellen gebruiken een gevestigde engineering simulatie methode, genaamd de eindige elementen methode17, maken van eindige elementen computationele mazen over welke biochemische processen en cardiomyocyte contracties kunnen worden gesimuleerd. Deze modellen zijn echter beperkt door de resolutie en de gedetailleerdheid die een microscopie methode in de dataset van een afbeelding bieden kan. Bijvoorbeeld, elektronenmicroscopie nanometer niveau detail van celstructuur kunt genereren, maar het is moeilijk vast te stellen specifieke proteïnen binnen het beeld dat zou nodig zijn om een model te maken. Aan de andere kant, super resolutie optische microscopie biedt contrastrijke beelden met hoge resoluties over de volgorde van 50 nm van slechts een select aantal moleculaire componenten van de cel. Alleen door de integratie van aanvullende informatie van deze beeldvormende modaliteiten kan een realistisch verkennen de gevoeligheid van de functie aan veranderingen in de structuur. Oereenstemming licht- en elektronenmicroscopie is nog steeds niet een routineprocedure en het zou nog steeds lijden de beperking dat slechts een beperkt aantal onderdelen kon worden gekleurd in de immunofluorescentie weergave en gecorreleerd met de weergave van elektronenmicroscopie.
Dit protocol biedt een nieuwe benadering van18 die gebruikmaakt van statistische methoden19 te analyseren en rekenkundig fuse de lichte microscopie van informatie over de ruimtelijke spreiding van ion-kanalen met elektronenmicroscopie informatie over andere cardiale ultrastructuur de componenten, zoals myofibrils- en mitochondriën. Dit levert een eindige elementen-model dat kan worden gebruikt met biofysische modellen van biochemische processen te bestuderen van de rol van cardiomyocyte sub cellulaire organisatie op de biochemische processen die cardiomyocyte contractie regelen. Bijvoorbeeld, dit protocol kan worden gebruikt om modellen van gezonde en streptozotocin-geïnduceerde diabetische cardiale myocytes te bestuderen van het effect van structurele remodelleren op cardiale cel functie die wordt waargenomen bij diabetische dier8modellen. Een bijkomend voordeel van de statistische aard van de onderhavige methode wordt ook geïllustreerd in het protocol: genereert de methode kan meerdere exemplaren van eindige elementen geometrieën die nauw na te de experimenteel waargenomen variaties in de celstructuur bootsen.
Als een overzicht, het protocol stappen omvatten: (i) voorbereiding cardiac weefsel voor elektronenmicroscopie voor het genereren van 3D-beelden met voldoende resolutie en contrast; (ii) de wederopbouw en segmentatie van 3D afbeeldingsstapels van elektronenmicroscopie gegevens met behulp van een 3D-elektronenmicroscopie wederopbouw- en beeldanalyse software genaamd IMOD20; (iii) het gebruikmaken van iso2mesh21 voor het genereren van een maaswijdte van eindige elementen met behulp van de gesegmenteerde gegevens als invoer; (iv) het gebruikmaken van de nieuwe algoritme en codes toewijzen van de verdeling van de ionenkanalen op de Maas van eindige elementen.
Het uitgangspunt van de aanpak van elke stap wordt beschreven in het protocol, en representatieve resultaten vindt u in de bijbehorende cijfers. Een overzicht geeft een overzicht geven van hoe de gegenereerde ruimtelijk gedetailleerde modellen kunnen worden gebruikt voor het bestuderen van de ruimtelijke dynamiek van calcium tijdens ECC, evenals de mitochondriale Bioenergetica. Sommige van de huidige beperkingen van het protocol worden besproken, evenals nieuwe ontwikkelingen die gaande zijn te overwinnen en verder een kwantitatief begrip van de rol van de celstructuur te cardiale systeembiologie. Hoe deze methoden kunnen worden gegeneraliseerd om te maken van eindige elementen modellen van andere celtypes wordt ook behandeld.
Gebruikers van dit protocol kunnen stap 1 en het deel van de wederopbouw van stap 2 overslaan als zij over een reeds bestaande elektronenmicroscopie afbeeldingsstapel beschikken. Gebruikers die willen verwerven hun gegevens in samenwerking met meer ervaren electron microscopists desgewenst te bespreken en de fixatie en kleuring procedures in stap 1 met de deskundige te bepalen van een optimale protocol voor de verwerving te vergelijken.
Het bovenstaande protocol worden belangrijke stappen voor het genereren van een roman eindige elementen geometrische model van cardiomyocyte ultrastructuur beschreven. De methode kunt computationele fusie van verschillende microscopie (of, in principe, andere gegevens) modaliteiten te ontwikkelen van een meer omvattende computational model van cardiomyocyte dynamiek waarin details van ruimtelijke cel het platform. Er is momenteel geen andere protocol beschikbaar voor het maken van een dergelijk model van een cardiomyocyt…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gesteund door de Koninklijke Maatschappij van Nieuw-Zeeland Marsden snel starten subsidie 11-UOA-184, de menselijke grenzen Science programma Research grant RGP0027/2013 en de Australische onderzoek Raad Discovery Project Grant DP170101358.
Materials | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
Equipment | |||
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
Retort stand | Proscitech | T752 | |
Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
Software | |||
SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
spatstat | R-project | install via R program | |
rgl | R-project | install via R program | |
doparallel | R-project | install via R program | |
foreach | R-project | install via R program | |
doSNOW | R-project | install via R program | |
iterators | R-project | install via R program |