Summary
Este protocolo descreve um método novo para criar um modelo de elementos finitos espacialmente detalhada da arquitetura intracelular do cardiomyocytes de imagens de microscopia confocal e microscopia eletrônica. O poder deste modelo espacialmente detalhada é demonstrado usando estudos de caso em sinalização de cálcio e Bioenergética.
Abstract
Com o advento das tecnologias de imagem tridimensionais (3D) como a tomografia computadorizada do elétron, serial-bloco-rosto varredura, microscopia eletrônica e microscopia confocal, a comunidade científica tem acesso sem precedentes aos grandes conjuntos de dados no sub-micrônicas resolução que caracterizam a remodelação arquitectónica que acompanha as alterações em função de casos na saúde e na doença. No entanto, esses conjuntos de dados tem sido subutilizado para investigar o papel da arquitetura celular remodelação em função de casos. O propósito do presente protocolo é delinear como criar um modelo de elementos finitos precisos de um casos usando imagens de microscopia confocal e microscopia eletrônica de alta resolução. Um modelo detalhado e preciso de arquitetura celular tem um potencial significativo para fornecer novos insights sobre biologia de casos, mais do que podem reunir experiências sozinhos. O poder deste método reside na sua capacidade de fundir computacionalmente informações de duas modalidades de imagens díspares da ultraestrutura de casos para desenvolver um modelo unificado e detalhado dos casos. Este protocolo descreve etapas para integrar o tomography do elétron e imagens de microscopia confocal de cardiomyocytes masculino adulto do rato Wistar (nome de uma raça específica de rato albino) para desenvolver um modelo de elementos finitos de metade-sarcômero dos casos. O procedimento gera um modelo de elementos finitos 3D que contém uma representação exata, de alta resolução (da ordem de ~ 35 nm) da distribuição das mitocôndrias, miofibrilas e clusters de receptor de ryanodine que liberam o cálcio necessário para casos contração da rede reticular sarcoplasmic (SR) no compartimento citosólico e Miofibrilha. O modelo gerado aqui como uma ilustração não incorporar detalhes da arquitetura do túbulo transverso- ou a rede reticular sarcoplasmic e, portanto, é um modelo mínimo dos casos. No entanto, o modelo já pode ser aplicado em investigações baseada em simulações sobre o papel da estrutura celular em bioenergética mitocondrial e sinalização cálcio, que é ilustrada e discutido usando dois estudos de caso apresentados a seguir o Protocolo detalhado.
Introduction
Acoplamento excitação-contração (ECC) no coração refere-se a importante e intrincada de acoplamento entre a excitação elétrica da membrana casos e a subsequente contração mecânica da célula durante cada batimento cardíaco. Modelos matemáticos têm desempenhado um papel chave no desenvolvimento de uma compreensão quantitativa dos processos bioquímicos interligados que regulam o potencial de ação1, cálcio citosólico sinalização2, bioenergética,3e subsequente geração de força contrátil. Tais modelos previram também com êxito as alterações para o batimento cardíaco quando um ou vários destes processos bioquímicos sofrem alterações4,5. A ultraestrutura altamente organizado dos casos cada vez mais tem sido reconhecida a desempenhar um papel crítico na função contrátil normal da célula e de todo o coração. Com efeito, alterações da morfologia e organização dos componentes da ultraestrutura cardíaca ocorrem em paralelo com as alterações bioquímicas em condições de doença como hipertrofia6, insuficiência cardíaca7e cardiomiopatia diabética8. Se essas mudanças estruturais são menores, adaptáveis ou patológicas respostas à mudança da condições bioquímicas ainda é em grande parte desconhecido9. O acoplamento inerentemente apertado entre forma e função em biologia significa que estudos experimentais sozinhos não podem fornecer percepções mais profundas do que as correlações entre remodelação estrutural e função de casos. Uma nova geração de modelos matemáticos que pode incorporar a montagem estrutural dos componentes sub celulares, juntamente com os processos bioquímicos bem estudados, são necessários para desenvolver uma compreensão abrangente da relação quantitativa entre estrutura, bioquímica e força contrátil em cardiomyocytes. Este protocolo descreve métodos que podem ser usados para gerar modelos de elementos finitos estruturalmente precisos dos cardiomyocytes que pode ser usado para tais investigações.
A última década viu avanços significativos em microscopia 3D10confocal11e de microscopia de super-resolução12 que fornecem insights sem precedentes, de alta resolução em Assembleia nano-escala e micro escala do componentes sub celulares dos casos. Recentemente, esses conjuntos de dados têm sido utilizados para gerar modelos computacionais de casos ultraestrutura13,14,15,16. Estes modelos de usam um método de simulação engenharia bem estabelecida, chamado o método de elementos finitos17, para criar elementos finitos malhas computacionais sobre quais processos bioquímicos e casos contrações podem ser simuladas. No entanto, estes modelos são limitados pela resolução e detalhe que um método de microscopia pode fornecer um conjunto de dados de imagem. Por exemplo, microscopia eletrônica pode gerar nanômetros-nível detalhe de estrutura celular, mas é difícil identificar proteínas específicas dentro da imagem do que seria necessário para criar um modelo. Por outro lado, a microscopia óptica de super-resolução pode fornecer imagens de alto contraste em resoluções da ordem de 50 nm de somente um seleto poucos molecular componentes da célula. Somente integrando informações complementares a partir dessas modalidades de imagem um pode realisticamente explorar a sensibilidade da função de mudanças na estrutura. Correlativo luz e microscopia eletrônica ainda, não é um procedimento de rotina, e ele ainda iria sofrer a limitação que apenas um número limitado de componentes pode ser manchado na exibição de imunofluorescência e correlacionado com a exibição de microscopia eletrônica.
Este protocolo apresenta uma nova abordagem18 que usa métodos estatísticos19 para analisar e computacionalmente fusível fotomicroscopia informações sobre a distribuição espacial dos canais iônicos com microscopia eletrônica informações sobre outro cardíaco componentes de ultraestrutura, como miofibrilas e mitocôndrias. Isso produz um modelo de elementos finitos que pode ser usado com modelos biofísicos de processos bioquímicos para estudar o papel da organização sub celular de casos sobre os processos bioquímicos que regulam a contração de casos. Por exemplo, este protocolo pode ser usado para criar modelos de saudável e induzido por estreptozotocina diabéticos miócitos para estudar o efeito da remodelação estrutural em função de célula cardíaca que é observada em animais diabéticos modelos8. Uma vantagem adicional da natureza estatística do método apresentado também é ilustrada no protocolo: o método pode gerar várias instâncias de geometrias de elementos finitos que imitam de perto as variações observadas experimentalmente na estrutura celular.
Como uma visão geral, as etapas do protocolo incluem: (i) preparação do tecido cardíaco por microscopia eletrônica de varredura gerar imagens 3D com suficiente resolução e contraste; (ii) reconstrução e segmentação de pilhas 3D imagem de microscopia eletrônica de dados usando uma reconstrução 3D de microscopia eletrônica e software de análise de imagem chamaram IMOD20; (iii) usando iso2mesh21 para gerar uma malha de elementos finitos usando os dados segmentados como entrada; (iv) usando o algoritmo de romance e códigos para mapear a distribuição de canais de íon para a malha de elementos finitos.
A premissa da abordagem de cada passo é descrita dentro do protocolo, e resultados representativos são fornecidos nas figuras que acompanha. Uma visão geral é descrita especificando como os modelos espacialmente detalhados gerados podem ser usados para estudar a dinâmica espacial de cálcio durante o ECC, bem como a bioenergética mitocondrial. Algumas das limitações atuais do protocolo são discutidas, bem como novos desenvolvimentos que estão em andamento para superá-los e avançar ainda mais uma compreensão quantitativa do papel da estrutura celular para a biologia de sistemas cardíaco. Como esses métodos podem ser generalizados para criar modelos de elementos finitos de outros tipos de célula também é abordado.
Usuários do presente protocolo podem ignorar a etapa 1 e a parte da reconstrução da etapa 2 se eles têm acesso a uma pilha de imagem de microscopia eletrônica pre-existente. Usuários que pretendem adquirir seus dados em colaboração com os mais experientes microscopistas elétron podem desejar discutir e comparar a fixação e coloração procedimentos na etapa 1, com o perito para determinar um protocolo ideal para aquisição.
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Protocol
Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pela Universidade de Auckland Comitê de ética Animal e o Comité de uso, onde o protocolo de tecido foi originalmente desenvolvido e Universidade da Califórnia em San Diego cuidados institucionais do Animal.
1. preparação experimental
- Prepare soluções estoque de 0,15 M e 0,3 M de sódio buffers de cacodylate em pH 7,4, de acordo com a tabela 1.
-
Preparar o fixador de glutaraldeído (2% paraformaldeído (PFA) + glutaraldeído 2,5% + 0,2% ácido tânico no buffer de cacodylate de sódio 0,15 M pH 7,4) usar componentes listados na tabela 1.
- Dissolva 2 g de pó PFA em 20 mL de água destilada a 60 ° C em uma placa de aquecimento com agitação constante.
- Adicione solução de NaOH 1 M até que a solução é clara.
- Espere até que a temperatura da solução está abaixo de 40 ° C e, em seguida, adicionar 10 mL de glutaraldeído e 20 mL de cacodylate de sódio 0,3 M.
- Adicionar 0,2 g de ácido tânico e dissolvê-lo na solução.
- Adicione 50 mL de cacodylate de sódio 0,15 M.
- Loja três ou quatro frascos de cintilação de 20 mL de fixador na geladeira a 4 ° C, ou no gelo, se usado no mesmo dia.
- Prepare a solução de Tyrode com 20mm 2,3-butanodiona monoxime (BDM), de acordo com a receita na tabela 1.
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Construa um aparelho de Langendorff dentro de uma hotte.
- Prenda dois tubos de seringa plástica de 100 mL a dois stands diferentes retorta, cerca de 70 cm de altura desde a base do carrinho.
- Conecte os tubos de seringa de plástico e um tubo conector usando 3 mm-diâmetro interno de tubos e uma torneira de três vias, conforme mostrado na Figura 1.
- Cabe uma cânula de diâmetro externo de 3 mm para o fundo do conector do tubo, onde o coração vai ser amarrado para fixação de perfusão.
-
Encher os tubos de seringa com solução de Tyrode e soluções fixador a 37 ° C.
- Remova as bolhas de ar dentro da tubulação passando as soluções da seringa através deles.
2. adquirir dados de microscopia eletrônica da ultraestrutura de casos
- Prepare o animal para excisão e fixação química do coração.
Nota: Este protocolo detalha os passos para processar adultos machos Wistar (nome de uma raça específica de rato albino) rato tecido cardíaco. O protocolo pode exigir modificações quando o tecido cardíaco é originária de outras espécies.- Anestesia o animal, tratando o rato (200-250 g de peso corporal) com 0,5 mL de heparina de U/mL 250 através da injeção intraperitoneal. Aguardar 10 min e, em seguida, tratar o rato com injeção intraperitoneal de pentobarbital (210 mg/kg de peso corporal).
- Confirme um grau adequado de anestesia por testar o reflexo de pitada de dedo do pé.
- Eutanásia do animal por deslocamento cervical.
- Colheita do coração usando dissecação procedimentos semelhantes a artigos previamente publicados de JoVE22,23, coloque-o em solução salina gelada.
- Isolar a aorta ascendente e Canule. Certifique-se de que a ponta da cânula senta-se logo acima da válvula semi lunar, onde se ramificam das artérias coronárias. Amarre um fio firmemente em torno da aorta ascendente.
- Ligar a cânula ao aparelho movido a gravidade Langendorff operado a ~ 70 cm acima da base do sistema (Figura 1).
- Gire a torneira no sistema Langendorff para perfundir o coração com solução de Tyrode, incluindo 20 mM BDM (um inibidor de miosina) por 2-3 min.
- Gire a torneira para iniciar a perfusão com fixador de 2% paraformaldeído, glutaraldeído 2,5% e 0,2% ácido tânico em cacodylate de sódio 0,15 M a 37 ° C por 10 min. Se for bem-sucedido, o coração girará marrom pálido e tornar-se duro e emborrachada.
- Usando uma lâmina de barbear, dissecar blocos de tecido da parede ventricular esquerda (lateral) livre e obter tecido bloqueia cerca de 1 mm3 no tamanho.
- Armazenar as amostras em frascos de 20ml pre-cooled cintilação do mesmo fixador no gelo por 2 h. armazenam tantas amostras quanto possível, os frascos e assegurar que as amostras estão submersos na solução.
Atenção: É importante manter amostras frio até após a etapa de desidratação 100% abaixo.
- Mais fixação e coloração de amostras para microscopia eletrônica.
- Despeje 100 mL de tampão de cacodylate de sódio 0,15 M num copo de vidro e resfriá-lo no gelo.
- Prepare-se volumes iguais de cacodylate de sódio tetróxido de ósmio e 0,3 M 4%, seguido pela adição de 0,08 g de ferrocianeto de potássio para fazer uma heavy metal mancha solução de ferrocianeto de potássio 2% em 2% tetróxido de ósmio e 0,15 M de sódio cacodylate. Legal a solução no gelo.
- Pipetar o fixador para fora e substituí-lo com bastante frio 0,15 M de sódio cacodylate o buffer para submergir as amostras em frascos. Coloca os frascos no gelo por 5 min.
- Repita a etapa 2.2.3 quatro vezes mais com cacodylate de sódio 0,15 M para remover o excesso fixador.
Atenção: Não utilize pipetas de vidro porque pequenos pedaços podem entrar a amostra e podem arruinar bisturis de diamante durante o corte de bloco de tecido. É importante arrefecer pre-todas as soluções no gelo antes de adicioná-los à amostra. Também é importante que a amostra permanece coberta pela solução de todos os tempos (muito breves períodos de cobertura parcial, durando não mais que alguns segundos podem ser brevemente tolerados durante as trocas de solução). Quando lavar ou substituição de soluções, adicione a nova solução rapidamente após a remoção da solução anterior. Manter os frascos de cintilação no gelo entre lavagens. Note que este passo não é tempo sensível, os blocos de tecido podem ser lavados ligeiramente mais longos, se necessário. - Substituir o buffer de cacodylate de sódio com solução de mancha gelada de heavy metal e armazená-lo no gelo durante a noite. Certifique-se de que o ferrocianeto é bem misturado, agitando o frasco com a mão; a solução deve ficar preta.
Cuidado: Trabalho na coifa ao realizar essa etapa porque o ósmio é tóxico. - Dilua 4% solução aquosa de uranilo acetato (UA) (tabela 1) para 2% usando volumes iguais de estoque solução UA e água bidestilada e esfriá-lo no gelo.
- Substituir a mancha de heavy metal com buffer de cacodylate de sódio 0,15 M resfriado e deixar a amostra incubar durante 5 min no gelo.
- Repita a etapa 2.2.7 quatro vezes mais no gelo para enxaguar qualquer solução de mancha de excesso de heavy metal.
- Lavar as amostras quatro vezes, com um período de espera de 2 min entre em água purificada (bidestilada é suficiente).
- Substituir a água purificada com gelada 2% UA e deixar a amostra incubam por 60-120 min no gelo.
- Arrefecer cinco frascos de cintilação de 20 mL de etanol (o suficiente para submergir amostras) no gelo que será usado na etapa de desidratação. Os seis frascos têm percentagens crescentes de etanol em água destilada: 20%, 50%, 70%, 90% e 100%.
- Despeje acetona pura outro frasco de 20 mL cintilação e cool no gelo junto com os frascos de etanol.
- Lave as amostras em água purificada quatro vezes com períodos de espera de 2 min no gelo para lavar o excesso UA.
- Desidrata-se amostras em etanol.
- Desidratar em série de álcool etílico frio substituindo sucessivamente solução dentro do frasco de amostra da seguinte forma, no gelo: etanol 20% por 10 min; etanol a 50% por 10 min; etanol a 70% por 10 min; etanol a 90% por 10 min; em seguida, duas vezes em 100% de etanol por 10 min.
- Amostra à temperatura de transição, substituindo o final 100% de etanol com refrigeração acetona pura e coloque o frasco da amostra em uma bancada de laboratório de temperatura por 10 min.
- Realize uma lavagem mais de 10 min em acetona pura à temperatura ambiente para remover a condensação que é observável dentro os frascos. Durante a incubação, compõem as soluções acetona/resina.
- Substitua a acetona pura em frascos com 50: 50 pura acetona e resina epóxi (com proporções de componentes da resina epóxi conforme indicado pelo fabricante). Use todos os componentes do mesmo lote. Deixe os frascos de amostra cheio de resina durante a noite em um rotor.
- Incorpore amostras em resina.
- Substituir a resina de 50: 50 com 75% de resina (25% de acetona) e incube por 3 h, seguido de incubação adicional/infiltração em 100% resina para 4 h à temperatura ambiente.
- Substitua a resina 100% fresco 100% de resina e deixar os frascos de amostra durante a noite para uma penetração mais profunda da resina para as amostras de tecido.
- Tirar amostras os frascos e colocá-los em recipientes que são forno-amigáveis e tem uma superfície plana; alumínio ou folha de prata copos de cozimento pode ser usada para essa finalidade, por exemplo.
- Despeje delicadamente (para evitar o deslocamento das amostras) fresco resina sobre as amostras (assim, a incorporação de amostras em resina) e polimerizar a resina e amostras em estufa a 60 ° C por 48 h.
- Reoriente os blocos de resina para células de imagem em corte transversal.
- Obter 1 µm teste espessas seções de blocos de resina usando um ultramicrotome com uma faca de vidro para avaliar célula orientação24.
- Manchar as seções do teste de espessura por 20 s com 1% de tolueno azul e 1% de bórax.
- Examine a orientação de célula muscular sob um microscópio de campo claro.
- Com base na orientação inferida a partir das imagens das seções manchadas de teste, re-orientar longitudinalmente ou obliquamente orientada (semelhante a Figura 2A) blocos para garantir que as células são expostas a faca o vidro para que eles serão cortados em corte transversal (de resina semelhante a Figura 2B).
- Secções de tecido imagem usando tomografia de elétrons.
- Obter cortes semifinos (~ 300 nm) do tecido reorientado blocos usando um diamante de faca e transferir as seções em grelhas de cobre25.
- Manche as seções espessas com 2% UA e Sato chumbo25.
- Aplicam-se as partículas de ouro coloidais em ambos os lados das seções25.
- Obter conjuntos de série único ou duplo eixo de inclinação de imagens projetadas de-70 ° a + 70 °25.
- Usar o IMOD20 para reconstruir a pilha de imagem 3D (uma série de imagens em 2D que fornecem as informações 3D da seção de tomografia computadorizada por um único elétron) da célula. Esta pilha reconstruída vai ser segmentada na próxima etapa.
3. segmento de miofibrilas e mitocôndrias regiões do conjunto de dados EM imagem 3D
- Execute o programa IMOD "3dmod".
- Dentro da interface do usuário gráfica 3dmod, digite o endereço do "REC" ou ".mrc" arquivo que contém o 3D reconstruída imagem dataset da célula (gerada na etapa 2.7) na caixa de entrada rotulada "arquivo (s) da imagem:", em seguida, pressione "Okey".
- No menu "File", selecione o novo modelo e, em seguida, salve o arquivo com um nome apropriado, usando o modelo como "salvar"... item do menu "Arquivo".
Nota: Um objeto em IMOD pode conter uma coleção de componentes segmentados que compõem o "objeto". Por padrão, um novo modelo contém um novo objeto com o id "#1". - Sob o menu "Especial", selecione "Ferramentas de desenho". Isto irá abrir uma nova barra de ferramenta semelhante ao mostrado na Figura 3A.
Nota: Existem várias ferramentas que podem ser usadas para criar contornos em torno dos limites de organela diferente. Mais ajuda sobre maneiras de usar estas ferramentas encontram-se na documentação do20 IMOD. - Escolha a opção "Sculpt" no menu "Ferramentas de desenho" e mova o mouse sobre a janela de imagem; um contorno circular centrado sobre o ponteiro do mouse aparecerá.
- Pressionando o botão do meio do mouse sobre uma mitocôndria (as regiões mais escuras dos arquivos de imagem, como ilustrado por demarcações com linhas de contorno verdes na Figura 3A), arraste o perímetro do contorno do círculo para a forma do seu limite.
- Concluído o contorno do limite da mitocôndria, solte o botão do meio e repita as etapas de 3.6 para cada mitocôndria nos dados. Cada contorno será automaticamente reconhecido pelo IMOD como um novo contorno dentro do mesmo objeto.
- Sob o "Editar | Objeto "no menu, selecione"Novo"para criar um novo objeto. Isto irá automaticamente incrementar o número total de objetos por um e atribuir este número para o novo objeto.
- Repita as etapas de 3.6 e 3.7 para segmentar e salvar Miofibrilha contornos.
- Repita a etapa 3,8, seguida pelo passo 3.6, segmentar o limite da célula também.
- Salve o arquivo de modelo no menu "File".
- Execute os seguintes comandos em uma janela de linha de comando para converter cada objeto de agrupamento em uma máscara binária, conforme ilustrado na Figura 4A C.
- Extrair um objeto específico a partir do modelo "imodextract objeto modelfile outputmodelfile" onde o "objeto" é o número do objeto a ser extraído.
- Criar uma máscara para esse objeto: imodmop-máscara 255 outputmodelfile imagefile outputmask.mrc
- Converter o arquivo em uma pilha de tif: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. criar uma malha de elementos finitos de componentes segmentados
- Iso2mesh é um programa MATLAB livremente disponível para converter pilhas de imagem TIFF em malhas de elementos finitos tetraédrica volumétrico. Faça o download e adicionar iso2mesh para o caminho do MATLAB de iso2mesh.sourceforge.net.
- Baixe os códigos-fonte e dados para simular RyR aglomerados na malha do github site https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
- Inicie o aplicativo CardiacCellMeshGenerator MATLAB (Figura 5).
- Carrega as máscaras de componente de organela diferente em MATLAB usando os três botões no lado superior esquerdo do GUI.
- Crie uma outra pilha de imagem binária que demarca as lacunas entre as miofibrilas e mitocôndrias, como mostrado na figura 6A.
- Abra o ImageJ.
- Usando o arquivo | Abrir caixa de diálogo, carregar as pilhas de tiff miofibrilas e mitocôndrias para o programa.
- Iniciar o plugin de adição de imagem selecionando "processo | Calculadora mais ".
- Selecione a pilha de imagem Miofibrilha como i1, as mitocôndrias pilha como i2 de imagem e escolha o operador de "Adicionar". Clique em "Okey".
- Depois de uma nova pilha de imagem que representa o resultado de 4.5.4 aparece, selecione "Editar | Inverta"para produzir uma pilha de imagem semelhante à figura 6A.
- Carrega o arquivo que contém a pilha de imagem binária das lacunas entre miofibrilas e mitocôndrias pressionando o botão de "RyRGapsFile" sobre o programa de CardiacCellMeshGenerator.
- Pressione "Gerar malha" o GUI. Isto irá disparar o iso2mesh v2m de comando com a opção 'cgalmesh' para gerar uma malha tetraédrica similar a Figura 4E. Três arquivos será saída no final desta etapa: um arquivo de .ele, um arquivo de face e um arquivo de .node que irá conter a listagem de nós que compõem os elementos, os nós que compõem as faces e as coordenadas de nós , respectivamente.
5. matematicamente mapear espacialmente diferentes densidade de canais iônicos de interesse para a malha de elementos finitos.
-
Gere os insumos necessários para o simulador RyR pressionando o botão rotulado entradas de gerar RyR-simulador na GUI.
Nota: O botão irá acionar uma função generateRyRsimulatorInputs.m, que usa as seguintes informações da etapa 4 para gerar as entradas:
(1) outDir: a localização de arquivos de saída que são necessárias para a simulação de cluster RyR.
(2) imres: a resolução do pixel nas três direções de pilhas de imagem.
(3) myofibril_file: o arquivo que contém a pilha de imagem binária como o mostrado na Figura 4B.
(4) sarcolemma_file: o arquivo que contém a pilha de imagem binária como o mostrado na Figura 4A.
(5) ryrgaps_file: o arquivo que contém a pilha de imagem binária como o mostrado na Figura 5A.- Após esta função executa, verificar que foram criados os seguintes arquivos dentro do diretório especificado como o caminho outDir:
- d_axial_micron.txt, que representa a distância axial entre a posição do disco-z e o restante dos pixels na pilha de imagem.
- d_radial_micron.txt, que representa a distância euclidiana (excluindo a componente axial) de cada pixel no conjunto de possíveis locais de cluster RyR para os pixels no avião z-disco.
- W_micron.txt, que representa a lista de coordenadas espaciais de todas as posições disponíveis para clusters de RyR para estar presente.
- Os restantes 3 arquivos na pasta contêm o sufixo "_pixel" ao invés de "_micron" para indicar que os valores dentro desses arquivos foram escritos para fora em forma de coordenadas de pixel.
-
Simule distribuições de cluster RyR na pilha de imagem binária de miofibrilas.
- Aperte o botão rotulado "Open RyR-simulador em R" para iniciar o programa de R.
- Sobre o R-gui, selecione "arquivo | Open"e localize o arquivo"configurações. R"dentro do pacote de RyR-simulador (RyR-simulador/fonte/configurações. R).
- Também Abra o arquivo ryr-simulador-paralelo. R (localizado em RyR-simulador/fonte/ryr-simulador-paralelo. R). ambientes como Rstudio (https://www.rstudio.com) ou uma simples interface de linha de comando pode ser usado, por exemplo, usando o comando R64 em uma janela de comando ou casca.
- Altere os parâmetros nas configurações. R arquivo conforme detalhado abaixo:
- Como o endereço da pasta que contém arquivos listados em 5.1.2 para uma pilha de imagem confocal experimentalmente adquirida de RyR clusters e miofibrilas, Path2.
Nota: O github repositório pasta entrada arquivos/mestre-células já contém arquivos que foram gerados para uma pilha de imagem previamente coletados. - Conjunto Path4 para um endereço da pasta onde os arquivos que foram gerados na etapa 5.1.2 são armazenados.
- Defina ponto de Path3 para uma pasta onde o usuário quer os locais de cluster RyR simulados para ser salvo.
- Conjunto de N para o número de clusters RyR para ser simulado no modelo (tipicamente na faixa de 200 a 300).
- Definir etol, uma tolerância que fixa, para a diferença entre a distribuição espacial experimentalmente medida de RyR clusters e a distribuição espacial do modelo simulado de clusters RyR.
- Conjunto numIter para limitar o número de tentativas que o simulador RyR deve tomar para encontrar um padrão de cluster RyR simulado que satisfaz o valor etol.
Nota: Valores para etol e numIter tem sido definidos como valores típicos dentro as configurações. Arquivo R. - Conjunto de numPatterns para o número de diferentes padrões de cluster RyR que o usuário deseja simular (normalmente, é útil prática simulando 99 padrões para confiança estatística).
- Conjunto numCores para habilitar o uso de vários segmentos de CPU (núcleos) para processamento com R para simular os padrões de ponto de paralelo mais rápido.
- Como o endereço da pasta que contém arquivos listados em 5.1.2 para uma pilha de imagem confocal experimentalmente adquirida de RyR clusters e miofibrilas, Path2.
- Verifique se os seguintes pacotes estão instalados usando o instalador do pacote gui na neve, doSNOW, doparallel, foreach, iteradores e rgl r:.
- Executar o simulador, digitando o seguinte comando na janela de comando R: fonte (' caminho para ryr-simulador-paralelo. R', chdir = TRUE)
Nota: A saída do programa RyR-simulador é uma lista de arquivos. txt (um arquivo de numPatterns será gerado) que contêm listas de coordenadas em linhas de N e 3 colunas, que representam o x, y e z coordenadas do N simularam RyR aglomerados.
-
Mapa de pontos como densidades espaciais em um modelo computacional usando o CardiacCellMeshGenerator.
- Selecionando o botão rotulado "Selecione RyR pontos arquivo", escolha um arquivo de texto de distribuição de cluster simulado RyR daqueles que estavam de saída pelo RyR-simulador.
- Execute "RyR densidade Mapper" o GUI em MATLAB. Isto irá mapear a localização espacial dos clusters RyR simulados no arquivo. txt no passo 5.3.1 para a malha de elementos finitos que foi gerado na etapa 4.8 usando um método chamado um núcleo esférico intensidade estimador método26.
Nota: A saída desta etapa é um arquivo com extensão. txt que contém uma lista de valores para a densidade numérica do canal iônico por unidade de volume esférico em cada um de nós da malha computacional.
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Representative Results
Figura 2 a Figura 7 fornecem resultados representativos de várias etapas-chave neste protocolo: (i) Visualizar e reorientando blocos de tecido para exibições de microscopia eletrônica de varredura transversal; (ii) gerando uma pilha de imagem 3D microscopia eletrônica; (iii) segmentação ultraestrutura celular sub para organelas de interesse; (iv) a geração de uma malha de elementos finitos usando iso2mesh; (v) simulando uma distribuição realista de clusters RyR na malha; (vi) seguido pelo mapeamento esta distribuição espacial como uma densidade espacial ao longo da malha computacional.
Figura 2 exibe imagens típicas de campo brilhante que mostram como as células aparecem quando orientado no sentido longitudinal (Figura 2A, rotulados L), obliquamente (Figura 2A, rotulados O) e transversalmente (Figura 2B) com respeito à plano de corte. Amostras orientadas no sentido longitudinal e oblíquas apresentam estrias, enquanto amostras orientadas transversalmente não apresentam estrias. Os capilares também aparecem mais circulares em vista transversal do que em oblíqua.
A figura 3A mostra uma imagem representativa de uma pilha de tomografia de boa qualidade que pode ser adquirida quando o protocolo de preparação do tecido na etapa 1 é seguido. Deve ter cuidado ao realizar reconstrução 3D da série de inclinação da imagem de microscópio. Localização incorreta de partículas de ouro coloidal, ou falta de partículas de ouro suficientes pode afetar a qualidade — foco imagem e contraste da imagem — da tomografia consideravelmente. Isso afeta a capacidade de segmentar diferentes estruturas significativamente. Cuidados e experiência são necessárias para assegurar que os blocos de tecido estão manchados suficientemente e que há uma distribuição uniforme de partículas de ouro coloidal através do volume de tecido. Em caso de dúvida, pode ser útil consultar com um especialista em laboratório ou instalação na instituição local. Se a geração do modelo é tentada com baixo contraste ou reconstruída incorretamente dados, modelos ainda podem ser gerados mas a correspondência de modelagem resultados com as propriedades dos sistemas biológicos para ser simulada pode ser pobre. Figura 3B mostra uma imagem representativa de como se parece um modelo segmentado de miofibrilas e mitocôndrias.
Figura 4E mostra uma renderização 3D da malha tetraédrica que é produzida pela iso2mesh. Enquanto a original imagem de pilha e segmentação de tarefas é de boa qualidade, esta etapa é bastante robusta. Figura 6B e a Figura 6 mostram uma distribuição típica de cluster RyR (em vermelho) dentro da topologia celular 3D. Nesta fase, a malha em si não é a entrada no simulador RyR. Uma pilha de imagem do limite da célula e as lacunas entre as miofibrilas e mitocôndrias — gerados a partir das imagens segmentadas na Figura 4 — formam as entradas principais para o simulador de RyR. Deve ter cuidado para segmentar os limites das miofibrilas e mitocôndrias, tão fielmente quanto possível; Segmentações imprecisas resultaria em uma representação imprecisa da topologia da célula dos dados, o que consequentemente afetará RyR colocação dentro da malha. Então, isso afetaria a dinâmica espaço-temporal de cálcio sinalização nos casos (aplicação 1).
A Figura 7 mostra a topologia de malha 3 instâncias de clusters de RyR simulados no mesmo depois de usar o algoritmo de estimador de intensidade esférico do kernel. Observe a variação na organização dos clusters RyR. Estas variações foram medidas para situar-se a variabilidade encontrada nos dados experimentais de18. Deve ter cuidado na escolha do raio da esfera do kernel e o tamanho de etapa sobre a qual o kernel amostras da densidade do aglomerado de RyR. Esses dois fatores afetam como agudamente ou difusamente uma representação da densidade de clusters de RyR vai ser retratada na malha. Uma análise do efeito de diferentes valores para esses parâmetros vai ajudar a diminuir nas escolhas parâmetro para uma malha razoável.
A malha resultante de RyR aglomerados miofibrilas e mitocôndrias é um modelo mínimo da estrutura de casos. Esta malha foi aplicada, bem como variações do mesmo que foram derivadas de outros dados de estrutura celular, para o estudo da bioenergética e dinâmica de cálcio. Uma visão geral desses dois aplicativos é descrita abaixo para ilustrar o poder da modelagem de elementos finitos de estrutura celular em dar ideias sobre as relações estrutura-função.
Aplicação 1 18 : Spatiotemporal dinâmica de cálcio liberam em cardiomyocytes. Este modelo tem sido usado para examinar o papel da distribuição heterogênea de RyR aglomerados miofibrilas e mitocôndrias na sinalização de cálcio. A Figura 8 mostra a spatiotemporal dinâmica de cálcio citosólico durante a fase ascendente do transiente quando simulada sobre a topologia de malha gerada a partir deste protocolo. Figura 8B mostra o cálcio livre heterogêneo e concentração de cálcio-fluoróforo-limite ao longo do tempo. As setas apontam para pequenas manchas de cálcio elevado devido a uma maior densidade de RyR conjuntos ou mitocôndrias nessas regiões. Figura 8 mostra imagens de linha-varredura simulado que podem ser comparadas a imagens de linha-verificação experimental da dinâmica de cálcio que normalmente é coletada usando microscopia confocal ao vivo. A simulação do modelo fornece uma maior resolução vista muito da heterogeneidade espacial de cálcio do que uma imagem adquirida experimentalmente. Além disso, devido ao modelo sendo derivado de dados estruturais de microscopia, o número de clusters que deve permanecer inativada (~ 4-6), após ativação elétrica para heterogeneidades a ocorrer na imagem confocal de varredura de linha poderia ser precisamente determinada. Heterogeneidades semelhantes são observadas experimentalmente adquiridos linha-digitalizar imagens da dinâmica de cálcio em modelos animais de insuficiência cardíaca18
Aplicação 2 27 : Spatiotemporal dinâmica de bioenergética mitocondrial em cardiomyocytes. O objetivo geral deste trabalho é estudar a relação entre a dinâmica de cálcio, bioenergética mitocondrial e contração muscular. Como primeiro passo, foram realizadas simulações da fosforilação oxidativa mitocondrial isoladamente dentro os casos. Como tal, a distribuição de RyR clusters não é necessária, e pode-se simplesmente usar a malha no passo 3.4. Como uma aplicação mais complexa, a bioenergética (aplicação 2) poderia ser acoplada com dinâmica de cálcio (aplicação 1) em um modelo que usa todos os componentes considerados em malha e construção do modelo, ou seja, as mitocôndrias, miofibrilas e ryanodine receptores.
Figura 9 representa os resultados dessas simulações espaciais metabolismo ao longo de diferentes regiões de uma malha gerada usando passo 3.4. Figura 9A retrata a concentração de oxigênio em toda a seção transversal de célula, enquanto Figura 9B mostra a concentração de ADP somente no compartimento Miofibrilha da célula. Figura 9 mostra a distribuição do potencial de membrana mitocondrial através da rede mitocondrial. Estes números revelam a distribuição não uniforme da mitocôndria e miofibrilas em secção transversal de célula. Eles também revelam a paisagem metabólica não-homogênea resultante desta ultra-estrutura não-uniforme. Isto demonstra o poder dos dados de microscopia com base em simulações de elementos finitos para dar ideias sobre as relações estrutura-função que são difíceis de obter através de métodos experimentais sozinhos.
Figura 1: preparação de Langendorff do coração por fixação química. (A) esquema de aparelho de perfusão de Langendorff. A torneira contém uma válvula para alternar entre a Tyrode e soluções fixador. O copo na base é usado para capturar soluções que perfundir através do coração. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: examinando a orientação da célula sob microscopia de campo claro. Vista de campo claro (A) da seção de tolueno azul manchado grossa do tecido cardíaco, ilustrando as células que são orientados no sentido longitudinal (L) e obliquamente orientado (O) no que diz respeito ao plano de imagem. Observe as estrias na célula longitudinalmente orientada, por exemplo. (B) vista de campo brilhante de uma secção de tecido que tem a secção transversal, da célula alinhada com o plano de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: segmentação dos dados de microscopia eletrônica. (A) instantâneo de segmentação manual de mitocôndrias usando a ferramenta sculpt. (B) uma vista 3D dos completos manualmente segmentado mitocôndrias, miofibrilas (em uma variedade de cores) e sarcolema (em rosa). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: conversão de pilhas de imagem binária em malha 3D tetraédrica. (A-C) Máscaras binárias do sarcolema, miofibrilas e mitocôndrias, respectivamente. (D) mesclada Ver os das máscaras binárias de miofibrilas (em vermelho) e as mitocôndrias (em verde). (E) representante malha tetraédrica que foi gerada a partir da pilha de imagem em (D) usando iso2mesh. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: CardiacCellMeshGenerator. Um screenshot da interface gráfica do usuário que acompanha esta publicação de protocolo para que os usuários executar as etapas 4 e 5. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: simulando uma distribuição de cluster RyR realista para uma pilha de imagem segmentada de microscopia eletrônica de ultraestrutura cardíaca. (A), A pilha de imagem binária representando as lacunas entre as miofibrilas e mitocôndrias, que representam o conjunto de todos os pixels onde clusters de RyR poderiam ser encontrados. (B) um 3D renderização (imagem não desenhada por escala) de um do simulado RyR cluster distribuições (mostradas como esferas vermelhas) dentro da geometria 3D retratado na pilha de imagem 3D; as superfícies verdes representam as mitocôndrias na pilha de imagem. (C) A maior ampliação (assim, uma pequena porção é cortar fora a seção transversal de célula nas fronteiras) vista da sobreposição do RyR de clusters da etapa 4 e da malha computacional da etapa 3 para uma fatia da pilha de imagem de tomografia computadorizada 3D elétrons. (B) e (C) foram modificados de Ribeiro et al. 18 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: distribuição espacial da densidade numérica de RyR clusters de três simulados de padrões do aglomerado de RyR. Todos os nós da malha são cor codificada de branco para densidade numérica de 0.0 RyR aglomerados/µm3 para vermelho para um máximo de densidade numérico 0.99 RyR aglomerados/µm3. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8: Heterogeneidade espacial em [Ca2 +]i , durante a fase de aumento da transientes de Ca2 + . Ligado (A) a média citosólica difundir livremente [Ca2 +]eu (à esquerda) e Fluo-4 Ca2 +, [F4Ca]eu (à direita). (B) e (C) mostrar o lapso de tempo instantâneos de difundir livremente Ca2 + e F4Ca no z-disco, plano transversal; setas pretas marcam regiões de alta [Ca2 +]eu devido ao cluster mitocondrial; setas vermelhas marcam regiões de alta [Ca2 +]i devido a vários clusters RyR nas proximidades. (C) exames de linha simulada de [Ca2 +]eu (meio) [F4Ca]eu (à direita). A posição de linha é mostrada na secção transversal de célula à esquerda. A dimensão horizontal de secção transversal de célula foi fornecida como um indicador da escala espacial na secção transversal da imagem. Esta figura foi modificada de Ribeiro et al. 18 Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9: distribuição espacial dos metabolitos e potencial de membrana mitocondrial, gerada a partir da simulação espacial do metabolismo energético cardíaco. (A) concentração de oxigênio em toda a seção transversal de célula em unidades de µM, (B) concentração de ADP somente na parte Miofibrilha da célula em unidades de µM. (C) distribuição de potencial através da mitocondrial de membrana mitocondrial rede em unidades da mV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10: visualização de um padrão de ponto de cluster RyR simulado no pacote estatístico R. Esta janela aparece na conclusão das simulações RyR aglomerados, retratando o primeiro dos padrões de ponto simulado. Isso pode ser usado como um indicador de que o simulador RyR concluiu também e pode interrogar a qualidade dos padrões simulados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Produtos químicos | Quantidades |
| 0,2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Água destilada | 20 mL |
| 0,15 M de sódio cacodylate depósito regulador | |
| Cacodylate de sódio | 32,1 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Compõem 1 L com água destilada | |
| pH 7,4 | |
| 0,3 M de sódio cacodylate depósito regulador | |
| Cacodylate de sódio | 64,2 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Compõem 1 L com água destilada | |
| pH 7,4 | |
| Composição da solução de Tyrode | |
| NaCl | 139 mM |
| KCl | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glicose | 12 mM |
| NaHCO3 | 17 mM |
| Probenecida | 1 mM |
| BDM | 20 mM |
| Solução de NaCl/KCl/NaHCO3 1 L | |
| NaCl (Peso Molecular 58.44 g/mol) | g 81,2 |
| KCl (Peso Molecular 74.55 g/mol) | 2,24 g |
| NaHCO3 (84.01 Peso Molecular g/mol) | g 14,28 |
| Dissolver em água destilada de 1L | |
| Solução de MgCl2/CaCl2 1 L | |
| CaCl2 (2H2O) (Peso Molecular 147 g/mol) | g 1,764 |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) | 0,814 g |
| Dissolver em água destilada de 1L | |
| 1 M 200 mL de solução de glicose | |
| Glicose (Peso Molecular 180.16 g/mol) | g 36,03 |
| Dissolver em 200 mL de água destilada dobro | |
| Solução de Tyrode solução 500 mL | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 mL |
| Glicose | 6 mL |
| Água bidestilada | 400 mL |
| Oxigênio de bolha na solução por 5 min | |
| 2% PFA + 2,5% glutaraldeído + 0,2% tanic ácido fixador de 0,15 M de sódio cacodylate | |
| Paraformaldeído em pó (PFA) | 2 g |
| Tanic ácido | 0,2 g |
| Água destilada | 20 mL |
| 25% glutaraldeído | 10 mL |
| 0,3 cacodylate de sódio M | 20 mL |
| Cacodylate de sódio 0,15 M | 50 mL |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 mL de água destilada |
| 4% acetato de uranilo solução estoque | |
| Acetato de uranilo | 4G |
| Perto de ebulição duplo água destilada | 96 mL |
| Dissolva UA na água perto de bioling, utilizando um agitador em um fumehood. | |
| Filtro UA através de um filtro Whatman #1 garrafa de 200 mL marrom para proteção de luz | |
| Cap firmemente e rotular, armazenar a 4 ° C | |
Tabela 1: Reagentes e quantidades para a preparação de tecidos para microscopia eletrônica.
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Discussion
O protocolo acima descreve etapas chaves para gerar um modelo geométrico de romance de elementos finitos de casos ultraestrutura. O método permite que as modalidades de fusão computacional de microscopia diferente (ou, em princípio, outros dados) desenvolver um modelo computacional mais abrangente da dinâmica de casos que inclui detalhes da arquitetura espacial cell. Não há atualmente nenhum outro protocolo disponível para criar um modelo de um casos.
Etapa 1 descreve um protocolo para fixação de perfusão. Alternativamente, o coração poderia ser extirpado, dissecado em partes menores e imerso no fixador. No entanto, este processo tem que ser feito rapidamente e pode ter resultados, dependendo do tamanho das amostras variados. Na experiência dos autores, perfusão garante infiltração minuciosa do fixador para os tecidos e células. Os autores também anteriormente tem perfundidos coração com solução de Krebs-Henseliet para fazer o coração bater antes de fixação. Isto permitiu medições sobre o coração de trabalho antes de fixação.
As etapas de processamento de microscopia eletrônica na etapa 2 são típicas de tomografia de elétrons. As quantidades de solução de processamento, particularmente de coloração soluções e horários podem ser diferentes quando usando outras técnicas de imagem como serial-bloco-face microscopia eletrônica ou concentrado de microscopia de feixes de iões28. As imagens de microscopia de elétron adquiridos devem ser segmentadas em regiões diferentes das organelas, como mitocôndrias, miofibrilas e túbulos transversais. Isto pode ser realizado manualmente ou em uma forma automatizada. O contraste na pilha de imagem depende em parte o sucesso do protocolo de coloração, mas alguns deste contraste é perdido quando realizar tomografia computadorizada. Este protocolo descreve etapas manuais para segmentar as diferentes estruturas, embora novos métodos para realizar a segmentação automática29 será mais favoráveis em geral para melhorar a taxa de transferência de dados.
As qualidades mais importantes para examinar no dataset microscopia eletrônica são a preservação de estrutura e contraste da imagem. A receita de coloração e a incorporação de misturas no presente protocolo de resina foram refinados de alto contraste entre miofibrilas, mitocôndrias e os z-discos da célula cardíaca. Por exemplo, os autores utilizou anteriormente no lugar de ácido tânico, de cloreto de cálcio na etapa 1.2 para demarcar a rede reticular sarcoplasmic. Isto ajudou com identificando os limites exteriores de feixes Miofibrilha durante a segmentação das organelas. Vezes e componentes químicos coloração adicionais também podem ser utilizados para a visualização de estruturas de membrana, como o retículo sarcoplasmático ou túbulos transversos-axial30.
As imagens também devem ser examinadas para degradação estrutural. Processamento de fixação ou microscopia eletrônica de má qualidade pode resultar em perda grave de cristas mitocondriais, alta proporção de mitocôndrias desalojadas ou inchadas e desintegração de porções da membrana celular (sarcolema). Um exame mais atento e cuidadoso também pode apresentar perda do t-tubular e membranas de SR, mas são menos óbvio para o olho destreinado. Soluções para este problema incluem: (i) assegurar a perfusão minuciosa; (ii) dissecando o tecido em pequenas amostras que também garantem alta penetração do fixador e manchas; (iii) garantir que microscopia eletrônica o processamento é feito em soluções de frias ou no gelo onde especificado; e (iv) assegurar que os timings para coloração e desidratação (desidratação em particular) são estritamente seguidos.
Um típico casos é ~ 20 µm de diâmetro de corte transversal e ~ 100 µm de comprimento. Isto faz com que células de imagem de todo o coração um desafio significativo. Além disso, a orientação da mudança das fibras musculares dentro o coração31 mais complica a aquisição de um volume de imagem cujos eixos estão alinhados com os eixos longitudinais e transversais de uma célula de interesse. Programas de análise de imagem como o IMOD permitem sintético re-alinhamento dos dados em uma orientação desejada. Avanços recentes em bloco-rosto serial varredura microscopia eletrônica28 e associada imagem processamento de algoritmos29 também ajudam a resolver esses problemas. No entanto, um exame cuidadoso das seções espessas sob um microscópio de luz e subsequente re-orientação do bloco (etapa 2.5) aumentará a probabilidade de células com razoável alinhamento dos eixos longitudinais e transversais com a imagem de imagem eixos. Isto irá assegurar que a maioria do volume da célula será capturada dentro do campo de visão.
Etapas do protocolo 3, 4 e 5 requerem software listado na Tabela de materiais a serem instalados. IMOD, o pacote R-estatísticas, iso2mesh e FiJi (uma versão do ImageJ para dados de microscopia) tem extensa documentação e tutoriais sobre como usá-los. CardiacCellMeshGenerator é um aplicativo MATLAB foi desenvolvido para tornar mais fácil para o usuário criar o modelo em um fluxo de trabalho simples. Os usuários podem transferir o código-fonte inteiro e pacote de aplicativos do link de repositório github RyR-simulador (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). O aplicativo, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, pode ser instalado em MATLAB como um app. As entradas para a malha gerada no presente protocolo podem ser encontradas dentro RyR-simulador/entrada-arquivos /-tomo-célula-alvo /, enquanto as entradas adicionais para o simulador de RyR-cluster pode ser encontrado dentro RyR-simulador/entrada-arquivos/mestre-célula /. Antes de iniciar o aplicativo, os usuários devem certificar-se de que a pasta de iso2mesh instalado e suas sub-pastas foram adicionadas para o caminho do MATLAB. Da mesma forma, certifique-se de que os R-pacotes necessários (Tabela de materiais) para o simulador de cluster também foram instalados dentro R.
Uma barra de progresso foi incluída no app ao gerar a malha, ao gerar as entradas para o simulador de cluster RyR e ao mapeamento de densidades de cluster RyR na malha usando o mapeador de densidade RyR; o app processará a malha 3D na GUI, quando concluiu a etapa de geração de malha. Ao completar as simulações de cluster RyR na interface de usuário R, vai aparecer uma janela gráfica (Figura 10), retratando um dos padrões simulados em 3D RyR ponto de cluster.
O botão "Gerar malha" no GUI aciona a função iso2mesh para gerar uma malha tetraédrica. A resolução do modelo pode ser ajustada, definindo os parâmetros"iso2mesh" sobre a GUI que ajustar o comprimento máximo elemento tetraédrica de volume e borda. O programa atualmente distingue elementos que compõem a região de Miofibrilha e as regiões de mitocôndrias; Esse recurso será alargado para incluir outros componentes da célula no futuro.
Os usuários podem usar o renderização 3D de malha e os clusters RyR para solucionar estas etapas. O RyR definições de simulação de cluster, etol e numIter, dentro de configurações. R afetam a exatidão das simulações RyR cluster; Estes dois parâmetros determinam quando termina uma simulação de padrão de cluster RyR. Esses parâmetros podem ser ajustados após a inspeção da distribuição dos aglomerados RyR na janela de R (Figura 10) para assegurar que: (i) todos os clusters são perto do z-discos; e (ii) os clusters são espalhados a secção inteira, ao invés de agregar numa qualquer região. Uma análise de sensibilidade ad hoc das simulações para estes dois parâmetros pode ser conduzida para determinar uma combinação apropriada de etol e numIter.
O estimador de intensidade do kernel esférico na etapa 5 utiliza uma esfera de diâmetro escolhido como uma semente, que é passada sobre o volume de interesse (modelo espacial 3D neste contexto). Esses parâmetros podem ser ajustados para este alisamento algoritmo sobre o GUI na Figura 5: (1) r_sphere define o raio do núcleo esférico suavização; (2) hval define o tamanho de iterativo passo espacial sobre a qual o kernel esférico deve ser iterativamente passado sobre o volume.
É uma abordagem simples para determinar se os parâmetros de densidade espacial são suficientes para inspecionar a distribuição dos valores de densidade de cluster RyR como mostrado na Figura 7. Os valores de densidade devem ser distribuídos, que o bairro dos valores de alta densidade é um tamanho similar ao tamanho de um cluster de RyR em dados de microscopia.
O protocolo atual produz um modelo de elementos finitos que contém apenas a distribuição realista de miofibrilas, mitocôndrias e clusters de RyR. Uma extensão para esta etapa seria para simular a distribuição de outros canais iônicos que desempenham um papel no ECC, tais como bombas de cálcio reticular sarco-endoplasmic (SERCA2a), trocadores de sódio-cálcio (NCX) e as bombas de cálcio mecanismos. A chave para estas extensões é uma análise da distribuição espacial dos canais de íon de dados de imunofluorescência. Por exemplo, canais NCX foram medidos para ser distribuído uniformemente sobre as membranas t-tubular com uma distância média de 0.67 µm, mas sua relação aos clusters de RyR não é tão claro32. Por outro lado, SERCA2a segmentação anticorpos anteriormente foram usados para marcar o SR33, mas a densidade espacial de SERCA2a não foi relatada na literatura. Portanto, nesta fase, pode presumir-se uma distribuição uniforme de 2A SERCA pela rede de SR e NCX sobre os túbulos-t com cautela.
Como demonstrado nos resultados do representante, a malha de elementos finitos resultante pode ser usada com elementos finitos solucionadores34 para simular processos bioquímicos, tais como cálcio18 e bioenergética27 como reação-difusão de sinalização processos. Para o efeito, canais iônicos são representados como locais de reação em nós dentro da topologia de malha. Os sites de reação atuam como fontes ou sumidouros de espécies químicas diferentes para representar o fluxo de espécies químicas através destes canais de íon em diferentes compartimentos da célula. A malha de saída e RyR arquivos de densidade do presente protocolo podem ser usados com qualquer outro integrador ou em qualquer outro ambiente, desde que o software tem a característica de reconhecer esses arquivos de texto. Os arquivos de texto também podem ser manipulados por scripts ou software de terceiros para satisfazer os requisitos de formato de arquivo de entrada do ambiente de escolha. A primeira aplicação na dinâmica de cálcio só demonstra a utilidade desse modelo para o movimento ascendente de cálcio, mas isso não indica que a malha não pode ser usada para escalas de tempo mais longos. As densidades da malha e cluster podem ser usadas para simular vários ciclos de cálcio, com a manutenção da homeostase e estabilidade apenas dependente do solucionador de elementos finitos que é usado.
Um objectivo a longo prazo é melhorar esse pipeline do modelo de construção para tornar mais fácil para criar modelos de elementos finitos estruturalmente precisos dos cardiomyocytes e outros tipos de células. Um algoritmo de segmentação automatizada foi desenvolvido recentemente, que pode ser aplicado a dados de microscopia eletrônica digitalização serial-bloco-rosto de cardiomyocytes para criar um modelo de distribuição miofibrilas e mitocôndrias na célula inteira com mínima do usuário entrada29. Esse método será estendido para segmento do túbulo-t e redes de membrana SR no futuro. Uma versão mais generalizada do algoritmo RyR-simulador que permitirá aos usuários analisar e simular co locais entre canal iônico e organelas, bem como entre tipos diferentes de canais de íon, forma um alto throughput também está em desenvolvimento. Um protocolo sem emenda para a construção de um modelo completo da célula iria permitir aos cientistas realizar testes de hipóteses com base em modelo na relação entre estrutura e função da célula mais rotineiramente do que é atualmente possível com abordagens experimentais sozinho.
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Disclosures
Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pela Royal Society de Nova Zelândia Marsden rápido começar Grant 11-UOA-184, a concessão de pesquisa de programa de ciência humana fronteiras RGP0027/2013 e o australiano pesquisa Conselho Discovery Project Grant DP170101358.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
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- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
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