Summary
Detta protokoll skisserar en ny metod för att skapa en rumsligt detaljerad finita element modell av intracellulära arkitekturen av hjärtmuskelceller från elektronmikroskopi och konfokalmikroskopi bilder. Kraften i denna rumsligt detaljerad modell demonstreras med hjälp av fallstudier i Kalciumsignalering och blockeringar.
Abstract
Med tillkomsten av tredimensionella (3D) avbildningstekniker såsom elektron tomografi, serial-block-face scanning electron microscopy och konfokalmikroskopi, det vetenskapliga samfundet har oöverträffad tillgång till stora datamängder på sub mikrometer upplösning som kännetecknar arkitektoniska ombyggnaden som medföljer förändringar i hjärtmuskelcellen funktion vid hälsa och sjukdom. Dessa datamängder har emellertid varit underutnyttjade för att undersöka rollen av cellulära arkitektur ombyggnad i hjärtmuskelcellen funktion. Syftet med detta protokoll är att beskriva hur man skapar en exakt finita element modell av en hjärtmuskelcellen med högupplöst elektronmikroskopi och konfokalmikroskopi bilder. En detaljerad och korrekt modell av cellulära arkitekturen har betydande potential att ge nya insikter i hjärtmuskelcellen biologi, mer än experiment ensam kan samla. Kraften i denna metod ligger i dess förmåga att beräkningsmässigt säkring information från två olika avbildningsmetoder för hjärtmuskelcellen ultrastruktur att utveckla ett enhetligt och detaljerad modell av hjärtmuskelcellen. Detta protokoll beskriver stegen för att integrera elektron tomografi och konfokalmikroskopi bilder av vuxna manliga Wistar (namn för en viss ras av albino råtta) råtta hjärtmuskelcellerna att utveckla en halv-sarcomere finita element modell av hjärtmuskelcellen. Förfaranden som genererar en 3D finita element-modell som innehåller en korrekt, högupplösta skildring (storleksordningen ~ 35 nm) av fördelningen av mitokondrier, myofibrils och ryanodine receptor kluster som frigör behövs kalcium för hjärtmuskelcellen kontraktion från sarkoplasmatiska retikulära nätverket (SR) in i myofibril och cytosoliska fack. Den modell som genereras här som en illustration inbegriper inte detaljer tvärgående-tubuli arkitekturen eller det sarkoplasmatiska retikulära nätverket och är därför en minimal modell av hjärtmuskelcellen. Modellen kan dock redan tillämpas i simuleringsbaserad utredningar in i rollen av cellstrukturen i calcium signalering och mitokondrie blockeringar, vilket illustreras och diskuteras med två fallstudier som presenteras efter den detaljerade protokoll.
Introduction
Excitation-contraction koppling (ECC) i hjärtat refererar till den viktiga och intrikata koppling mellan elektrisk magnetisering av hjärtmuskelcellen membranet och efterföljande mekaniska sammandragning av cellen under varje hjärtslag. Matematiska modeller har spelat en nyckelroll i utvecklingen av en kvantitativ förståelse av de sammanlänkade biokemiska processer som reglerar de potentiella åtgärder1, cytosoliska calcium signalering2, bioenergetik3, och efterföljande kontraktila styrkebidrag. Sådana modeller har också framgångsrikt förutsagt ändringar hjärtslag när en eller flera av dessa biokemiska processer genomgå förändringar4,5. Den mycket organiserade ultrastruktur av hjärtmuskelcellen har alltmer erkänts att spela en avgörande roll i den normala kontraktila funktionen av cellen och hela hjärtat. Faktiskt, ändringar i morfologi och organisation av komponenterna i hjärt ultrastruktur ske parallellt att biokemiska förändringar i sjukdomstillstånd såsom hypertrofi6, hjärtsvikt7och diabetiker kardiomyopati8. Huruvida dessa strukturella förändringar är mindre, adaptiv eller patologiska svar på de förändrade biokemiska förhållanden är fortfarande till stor del okända9. Inneboende snäva kopplingen mellan form och funktion i biologi innebär att experimentella studier enbart kan ge djupare insikter än korrelationer mellan strukturella remodeling och hjärtmuskelcellen funktion. En ny generation av matematiska modeller som kan integrera den strukturella församlingen av sub cellulära komponenter, tillsammans med de väl studerat biokemiska processerna, är nödvändiga för att utveckla en heltäckande, kvantitativ förståelse av förhållandet mellan struktur, biokemi och kontraktila kraft i hjärtmuskelceller. Det här protokollet beskriver metoder som kan användas för att generera strukturellt korrekt finita element modeller av hjärtmuskelceller som kan användas för sådana utredningar.
Det senaste decenniet har sett betydande framsteg i 3D elektronmikroskopi10, confocal11och super-resolution mikroskopi12 som ger oöverträffad, högupplösta insikter i nano-skala och mikroskala monteringen av den sub cellulära komponenter i hjärtmuskelcellen. Dessa datamängder har nyligen använts för att generera beräkningsmodeller hjärtmuskelcellen ultrastruktur13,14,15,16. Dessa modeller använder en väletablerad engineering simulering-metod, som kallas de finita element metod17, för att skapa finita element computational maskor över vilka biokemiska processer och hjärtmuskelcellen sammandragningar kan simuleras. Dessa modeller är dock begränsad av den upplösning och detaljrikedom som en metod för mikroskopi kan ge i en bild datamängd. Till exempel elektronmikroskopi kan generera nanometer-nivå detalj av cellens struktur, men det är svårt att identifiera specifika proteiner i bilden som skulle vara nödvändigt att skapa en modell. Däremot, super-resolution optisk mikroskopi kan ge hög kontrast bilder med upplösningar på order av 50 nm av endast en Välj några molekylära komponenter av cellen. Endast genom att integrera kompletterande information från dessa avbildningsmetoder kan man utforska realistiskt känslighet funktion till förändringar i strukturen. Korrelat ljus- och elektronmikroskopi är fortfarande inte ett rutinmässigt förfarande och det skulle fortfarande lida begränsning att endast ett begränsat antal komponenter kan vara målat i vyn immunofluorescens och korrelerade med vyn elektronmikroskopi.
Detta protokoll presenterar en ny metod18 som använder statistiska metoder19 att analysera och beräkningsmässigt säkring ljusmikroskopi information på rumslig distribution av jonkanaler med elektronmikroskopi på andra hjärt ultrastruktur komponenter, till exempel myofibrils och mitokondrier. Detta producerar en finita element-modell som kan användas med biofysiska modeller av biokemiska processer för att studera roll hjärtmuskelcellen sub cellulära organisation på de biokemiska processer som reglerar hjärtmuskelcellen kontraktion. Till exempel detta protokoll kan användas för att skapa modeller från friska och streptozotocin-inducerad diabetes hjärt myocyter att studera effekten av strukturella remodeling hjärt cell funktion som observeras i diabetiska djur modeller8. En ytterligare fördel av statistiska naturen av den presenterade metoden illustreras också i protokollet: metoden kan generera flera instanser av finita element-geometrier som nära efterlikna experimentellt observerade variationerna i cellstrukturen.
Som en översikt, protokollstegen omfattar: (i) beredning av hjärtvävnad för elektronmikroskopi att generera 3D bilder med tillräcklig upplösning och kontrast; (ii) återuppbyggnad och segmentering av 3D bildstaplar från elektronmikroskopi data med hjälp av en 3D elektronmikroskopi återuppbyggnad och bildanalys programvara kallas IMOD20; (iii) använda iso2mesh21 för att generera ett finita element mesh med segmenterad data som indata; (iv) med romanen algoritm och koder för att kartlägga fördelningen av jonkanaler på finita element mesh.
Förutsättningen för en strategi för varje steg beskrivs i protokollet och representativa resultat finns i medföljande siffrorna. En översikt beskrivs anger hur de genererade rumsligt detaljerade modellerna kan användas för att studera rumslig dynamik av kalcium under ECC, liksom mitokondriell bioenergetik. Några av de nuvarande begränsningarna av protokollet diskuteras, liksom nya utvecklingen som pågår för att övervinna dem och vidareutveckla en kvantitativ förståelse av cellens struktur roll till hjärt systembiologi. Hur dessa metoder kan generaliseras för att skapa finita element modeller av andra celltyper tas också upp.
Användare av detta protokoll kan hoppa över steg 1 och återuppbyggnad delen av steg 2 om de har tillgång till en redan existerande elektronmikroskopi bildstapel. Användare som avser att förvärva sina data i samarbete med mer erfarna elektron microscopists vilja att diskutera och jämföra fixering och färgning procedurerna i steg 1 med expert att avgöra en optimal protokoll för förvärvet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av University of Auckland djur etikkommittén och University of California San Diego institutionella djurens vård och användning kommittén, där vävnad protokollet utvecklades ursprungligen.
1. experimentell förberedelse
- Förbereda stamlösningar 0,15 M och 0.3 M natrium cacodylate buffertar vid pH 7,4 enligt tabell 1.
-
Förbereda glutaraldehyd fixativ (2% PARAFORMALDEHYD (PFA) + 2,5% glutaraldehyd + 0,2% garvsyra i 0,15 M natrium cacodylate buffert vid pH 7,4) med komponenter som anges i tabell 1.
- Lös upp 2 g PFA pulver i 20 mL destillerat vatten vid 60 ° C på en värmeplatta med ständig omrörning.
- Tillsätt 1 M NaOH-lösning tills lösningen är klar.
- Vänta tills temperaturen av lösningen är under 40 ° C och tillsätt 10 mL av glutaraldehyd och 20 mL 0,3 M natrium cacodylate.
- Tillsätt 0,2 g av Garvsyra och Lös det i lösningen.
- Tillsätt 50 mL 0,15 M natrium cacodylate.
- Lagra tre eller fyra 20 mL scintillation injektionsflaskor med fixativ i kylskåp vid 4 ° C eller på is om används samma dag.
- Förbereda Tyrodes lösning med 20 mM 2,3-butandion monoxime (BDM), enligt receptet i tabell 1.
-
Konstruera en av apparat inuti ett dragskåp.
- Klämma två 100 mL spruta av plast rör till två olika retorten står, ca 70 cm hög från basen stativ.
- Anslut Plastspruta rören och en koppling slang med 3 mm-inner-diameter slangar och en tre-vägs Avstängningskranen som visas i figur 1.
- Passa en 3 mm ytterdiameter kanyl till botten av kopplingen slangar, där hjärtat kommer att bindas för perfusion fixering.
-
Fyll sprutan rören med Tyrodes lösning och fixativ lösningar vid 37 ° C.
- Avlägsna luftbubblor i slangen genom att passera de spruta lösningarna genom dem.
2. förvärva elektronmikroskopi Data av hjärtmuskelcellen ultrastruktur
- Förbereda djuret för excision och kemiska fixering av hjärtat.
Obs: Detta protokoll Detaljer stegen för att behandla vuxna manliga Wistar (namn för en viss ras av albino råtta) råtta hjärtvävnad. Protokollet kan kräva ändringar när hjärtvävnad hämtas från andra arter.- Söva djuret genom att behandla råtta (200-250 g av kroppsvikt) med 0,5 mL av 250 U/mL heparin via intraperitoneal injektion. Vänta i 10 min, sedan behandla råtta med intraperitoneal injektion av pentobarbital (210 mg/kg kroppsvikt).
- Bekräfta en korrekt grad av anestesi genom att testa den tå nypa reflexen.
- Avliva djuret av cervikal dislokation.
- Skörden hjärtat med dissektion procedurer liknar tidigare publicerade JoVE artiklarna22,23, sedan placera den i iskall saltlösning.
- Isolera aorta ascendens och hål. Se till att spetsen på kanylen sitter precis ovanför semi lunar ventilen, där kranskärlen förgrenar sig. Knyt en tråd tätt runt aorta ascendens.
- Anslut kanylen på allvar-driven av apparaten drivs på ~ 70 cm ovanför basen av systemet (figur 1).
- Twist Avstängningskranen på av systemet att BEGJUTA hjärtat med Tyrodes lösning, inklusive 20 mM BDM (en myosin-hämmare) för 2-3 min.
- Twist avstängningskranen för att påbörja perfusion med fixativ 2% paraformaldehyd, 2,5% glutaraldehyd och 0,2% garvsyra i 0,15 M natrium cacodylate vid 37 ° C i 10 min. Om det lyckas, kommer hjärtat slå blekbrun och bli stel och seg.
- Med ett rakblad, dissekera vävnad block från den vänstra ventrikulära (lateral) gratis väggen och erhålla vävnad blockerar cirka 1 mm3 i storlek.
- Store proverna i nedkylda 20 mL scintillation injektionsflaskor med den samma fixativ på is för 2 h. lagra så många prover som möjligt i skålarna, och se till att proverna är nedsänkt i lösningen.
Varning: Det är viktigt att hålla prover kall tills efter den 100% uttorkning stegen nedan.
- Ytterligare fixering och färgning av prover för elektronmikroskopi.
- Häll 100 mL 0,15 M natrium cacodylate buffert i en glasbägare och kyla det på is.
- Laga lika stora volymer av 4% osmium vanligtvis och 0.3 M natrium cacodylate, följt av tillägg av 0,08 g kaliumferrocyanid att göra en tungmetall fläcken lösning innehållande 2% kaliumferrocyanid i 2% osmium vanligtvis och 0,15 M natrium cacodylate. Kyl lösningen på is.
- Pipettera fixeringsvätskan ut och ersätta den med tillräckligt kallt 0,15 M natrium cacodylate buffert att dränka prover i skålarna. Placera rören på is för 5 min.
- Upprepa steg 2.2.3 fyra gånger med 0,15 M natrium cacodylate att ta bort överflödig fixativ.
Varning: Använd inte glas pipetter eftersom små skärvor kan få i provet och kan förstöra diamond knivar under vävnad block snittning. Det är viktigt att kyla före alla lösningar på is innan du lägger dem i provet. Det är också viktigt att provet fortfarande omfattas av lösning hela tiden (mycket korta perioder med partiell täckning som varar mer än ett par sekunder kan tolereras kort under lösning utbyten). När tvätt eller ersätta lösningar, lägga till den nya lösningen snabbt efter flyttande den föregående lösningen. Hålla scintillation injektionsflaskorna på isen mellan tvättarna. Observera att detta steg inte är dags känsliga, vävnad blocken kan tvättas något längre, om det behövs. - Ersätta natrium cacodylate buffert med iskall tungmetall fläcken lösning och lagra den på isen över natten. Se till att kaliumferrocyanid är väl blandat genom att skaka flaskan för hand; lösningen ska vända svart.
FÖRSIKTIGHET: Arbete i dragskåp när du utför det här steget eftersom osmium är giftigt. - Späd 4% vattenlösning uranyl acetat (UA) stamlösning (tabell 1) till 2% använder lika stora volymer av materiel UA lösning och dubbel destillerat vatten och kyla ner på isen.
- Ersätta tungmetall fläcken med iskylda 0,15 M natrium cacodylate buffert och låt provet Inkubera i 5 min på is.
- Upprepa steg 2.2.7 fyra gånger på is att skölja bort någon överflödig tungmetall fläcken lösning.
- Skölj proverna fyra gånger, med en 2-minuters vänta-period i mellan i renat vatten (dubbeldestillerat räcker).
- Byt ut renat vatten med iskall 2% UA och låt provet Inkubera 60-120 min på is.
- Kyla ner fem 20 mL injektionsflaskor av scintillation etanol (nog att dränka prover) på is som kommer att användas i steget uttorkning. De sex flaskorna har ökande andelen etanol i destillerat vatten: 20%, 50%, 70%, 90% och 100%.
- Häll ren aceton i en annan 20 mL injektionsflaska av scintillation och cool på isen tillsammans med etanol injektionsflaskorna.
- Skölj prover i renat vatten fyra gånger med 2 minuters väntetider på is att tvätta överskott UA.
- Torkar ut prover i etanol.
- Torka i kall etanol-serien genom att successivt ersätta lösning inom provet flaskan som följer, på is: 20% etanol i ca 10 min; 50% etanol under 10 minuter; 70% etanol för 10 min; 90% etanol för 10 min; sedan två gånger i 100% etanol i 10 min.
- Övergång prov till rumstemperatur genom att ersätta den sista 100% etanolen med kyld ren aceton och placera injektionsflaskan med prov på en rumstemperatur lab bänk i 10 min.
- Utföra en mer 10 min tvätt i ren aceton i rumstemperatur ta bort kondens som är observerbart inom injektionsflaskorna. Samtidigt ruvning, se upp lösningarna som aceton/kåda.
- Ersätta ren aceton i injektionsflaskorna med 50: 50 ren aceton och epoxi harts (med proportioner för epoxi harts komponenter som anges av tillverkaren). Använd alla komponenter från samma parti. Lämna harts fyllda prov injektionsflaskorna över natten på en rotor.
- Bädda in prover i kåda.
- Ersätta 50: 50 harts med 75% harts (25% aceton) och inkubera i 3 h, följt av ytterligare inkubation/infiltration i 100% harts för 4 h i rumstemperatur.
- Ersätt den 100% hartsen med fräsch 100% harts och lämna prov injektionsflaskorna över natten för djupare penetration av kådan i vävnadsproverna.
- Ta prover ur skålarna och placera dem i behållare som är ugn-vänliga och har en platt bas; aluminium eller silver folie bakning koppar kan användas för detta ändamål, t.ex.
- Häll försiktigt (för att undvika förskjutning av proverna) färsk kåda över proverna (således inbäddning prover i kåda) och polymerisera den harts och prover i en ugn vid 60 ° C för 48 h.
- Omorientera harts block till bildcellerna i tvärsnitt.
- Få 1 µm tjock test sektioner från harts block med en ultramicrotome med en glas-kniv för att bedöma cell orientering24.
- Fläcken avsnitten tjock test för 20 s med 1% toluen blå och 1% borax.
- Undersöka muskel cell orientering i ljusa fält Mikroskop.
- Baserat på orienteringen utläsas bilder av avsnitten färgade test, rikta längdriktningen eller snett orienterade (liknande figur 2A) harts block för att se till att celler utsätts för glaskniven så att de kommer att skäras i tvärsnitt ( liknande figur 2B).
- Bild vävnadssnitt använda electron tomografi.
- Erhålla semi tunna snitt (~ 300 nm) av omorienteras vävnad block med en diamant kniv och överföra avsnitten på koppar nät25.
- Färga de tjocka sektioner med 2% UA och Sato bly25.
- Applicera Kolloidalt guld partiklar på båda sidor av avsnitt25.
- Få uppsättningar av enkel- eller dubbel-axel tilt serie av projicerade bilder från-70 ° till + 70 °25.
- Använda IMOD20 att rekonstruera den 3D bildstapel (en serie 2D-bilder som ger den 3D-informationen i en enda elektron tomografi avsnitt) av cellen. Denna rekonstruerade stack kommer segmenteras i nästa steg.
3. segmentet Myofibrils och mitokondrier regioner från EM 3D bild datamängden
- Kör programmet IMOD ”3dmod”.
- Inom det grafiska användargränssnittet för 3dmod, ange adressen till den ”.rec” eller ”.mrc”-fil som innehåller 3D rekonstruerade bilden datamängd i cellen (som genereras i steg 2,7) i rutan märkt ”bild arkivera()”:, tryck sedan på ”OK”.
- Under ”Arkiv”-menyn väljer ny modell och sedan spara filen med ett lämpligt namn med hjälp av ”Spara modell som”... menyalternativ under ”fil”.
Obs: Ett objekt i IMOD kan innehålla en samling segmenterade komponenter som utgör ”objektet”. Som standard innehåller en ny modell ett nytt objekt med id ”nr 1”. - Under 'Speciella' menyn, Välj ”verktyg”. Detta kommer att öppna en ny verktyg bar liknar den som visas i figur 3A.
Obs: Det finns flera verktyg som kan användas för att skapa konturer runt olika organell gränserna. Mer hjälp om sätt att använda dessa verktyg kan hittas i IMOD20 dokumentationen. - Välj alternativet ”skulptera” i menyn ”verktyg” och flytta musen till bildfönstret; en cirkulär kontur centrerad på muspekaren visas.
- Genom att hålla den mittersta musknappen ned över en mitokondrie (de mörka regionerna av bildfiler, som illustreras av avgränsningar med gröna konturlinjer i figur 3A), dra omkretsen av cirkeln kontur i form av dess gräns.
- När konturering av mitokondrien gränsen är klar, släppa på mitten-knappen och upprepa steg 3.6 för mitokondrien i data. Varje kontur kommer automatiskt kännas igen av IMOD som en ny kontur inom samma objekt.
- Under den ”Redigera | Objekt ”menyn, Välj” nytt ”för att skapa ett nytt objekt. Detta kommer att öka det totala antalet objekt med ett och tilldela detta nummer till det nya objektet automatiskt.
- Upprepa steg 3.6 och 3.7 att segmentera och spara myofibril konturer.
- Upprepa steg 3.8, följt av steg 3.6, att segmentera cellkanten samt.
- Spara modellfilen under ”Arkiv”-menyn.
- Kör följande kommandon i ett kommandorads fönster att konvertera varje objekt gruppera i en binär mask som illustreras i figur 4A-C.
- Extrahera ett specifikt objekt från den modell ”imodextract objekt modelfile outputmodelfile” där ”objekt” är numret för objektet som ska extraheras.
- Skapa en mask för objektet: imodmop-mask 255 outputmodelfile bildfil outputmask.mrc
- Konvertera filen till en tif skorsten: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. skapa ett Finita Element Mesh från segmenterade komponenter
- Iso2mesh är en fritt tillgänglig MATLAB-program att konvertera TIFF bildstaplar i volymetriska tetraedriska finita element maskor. Ladda ner och lägga till iso2mesh i MATLAB sökvägen från iso2mesh.sourceforge.net.
- Ladda ner källkoder och data att simulera RyR kluster på maskorna från github webbplats https://github.com/CellSMB/RyR-simulator.
- Starta programmet CardiacCellMeshGenerator MATLAB (figur 5).
- Läsa in olika organell komponent masker i MATLAB med hjälp av tre tryckknapparna på övre vänstra sidan av GUI.
- Skapa en annan binär bild stack som avgränsas luckor mellan myofibrils och mitokondrier som visas i figur 6A.
- Öppna ImageJ.
- Med hjälp av filen | Öppna dialogrutan, Ladda de myofibrils och mitokondrier tiff stackarna in i programmet.
- Initiera bild tillägg plugin genom att välja ”Process | Calculator Plus ”.
- Markera den myofibril bildstapel i1, mitokondrierna bild stack som i2, och välj ”Lägg till” operatören. Klicka på ”OK”.
- Efter en ny image stack som representerar resultatet av 4.5.4 visas, Välj ”Redigera | Invertera ”för att producera en bildstapel som liknar figur 6A.
- Läsa in filen som innehåller binär bild högen av klyftorna mellan myofibrils och mitokondrier genom att trycka på knappen ”RyRGapsFile” på CardiacCellMeshGenerator programmet.
- Tryck ”generera Mesh” GUI. Detta utlöser de iso2mesh kommandot v2m med 'cgalmesh' möjlighet att generera en tetraedrisk mesh som liknar figur 4E. Tre filer kommer att matas ut i slutet av detta steg: en .ele-fil, en .face-fil och en .node-fil som innehåller listan över noder som utgör element, de noder som utgör ansikten och koordinaterna för noderna , respektive.
5. matematiskt karta rumsligt varierande tätheten av Ion-kanaler av intresse på Finita Element Mesh.
-
Generera nödvändiga ingångar för RyR-simulatorn genom att trycka på knappen märkt generera RyR-Simulator ingångar på GUI.
Obs: Knappen utlöser en funktion generateRyRsimulatorInputs.m, som använder följande information från steg 4 för att generera ingångarna:
(1) outDir: platsen för utdatafiler som är nödvändiga för RyR kluster simulering.
(2) imres: PIXELupplösning i de tre riktningarna av bildstaplar.
(3) myofibril_file: den fil som innehåller binär bild stacken som visas i diagram 4B.
(4) sarcolemma_file: den fil som innehåller binär bild stacken som visas i figur 4A.
(5) ryrgaps_file: den fil som innehåller binär bild stacken som visas i diagram 5A.- Efter denna funktion utför, kontrollera att följande filer har skapats i katalogen som anges som outDir sökväg:
- d_axial_micron.txt, som representerar axiella avståndet mellan positionen för z-skivan och resten av pixlar i en bildstapel.
- d_radial_micron.txt, som representerar det euklidiska avståndet (exklusive den axiella komponenten) från varje pixel i uppsättningen möjliga RyR kluster platser till pixlar på z-skiva planet.
- W_micron.txt, vilket motsvarar listan över rumsliga koordinater i alla tillgängliga lägen för RyR kluster för att vara närvarande.
- De återstående 3 filerna i mappen innehåller suffixet ”_pixel” snarare än ”_micron” för att beteckna att värdena inom dessa filer har skrivits i pixel samordna form.
-
Simulera RyR kluster distributioner på binär bild stacken av myofibrils.
- Tryck på knappen märkt ”öppen RyR-simulator i R” att inleda programmet R.
- På R-gui, Välj ”fil | Öppna ”och hitta filen” inställningar. R ”i RyR-Simulator paketet (RyR-Simulator/källa/inställningar. R).
- Också öppna filen ryr-simulator-parallellen. R (ligger i RyR-Simulator/källa/ryr-simulator-parallell. R). miljöer som Rstudio (https://www.rstudio.com) eller ett vanligt kommandoradsgränssnitt kan användas, t.ex. med kommandot R64 i ett skal eller kommandot fönster.
- Ändra parametrarna i inställningar. R fil som beskrivs nedan:
- Ange sökväg2 till Mappadressen som innehåller filerna i 5.1.2 för en experimentellt förvärvade confocal bildstapel RyR kluster och myofibrils.
Obs: Github repository mapp indata-filer/master-cellen / redan innehåller filer som har skapats för en tidigare insamlade bildstapel. - Ange Path4 till en mappadress där de filer som skapades i steg 5.1.2 lagras.
- Sökväg3 börvärde till en mapp där användaren vill de simulerade RyR kluster platserna ska sparas.
- Inställning N antalet RyR kluster till simuleras i modellen (vanligtvis i intervallet 200 till 300).
- Ställ in etol, en tolerans om fastställande, för skillnaden mellan experimentellt uppmätta rumslig distribution av RyR kluster och modell simulerat rumslig distribution av RyR kluster.
- Ställa in numIter att begränsa antalet försök som RyR-simulatorn ska ta för att hitta en simulerad RyR kluster mönster som uppfyller etol värdet.
Obs: Värden för etol och numIter har angetts till typiska värden i inställningarna. R fil. - Ange numPatterns till antalet olika RyR kluster mönster som användaren vill simulera (vanligtvis är det användbar praxis simulera 99 mönster för statistiska förtroende).
- Ställa in numCores att aktivera användning av flera CPU trådarfler (kärnor) för snabbare parallell bearbetning med R att simulera punkt mönster.
- Ange sökväg2 till Mappadressen som innehåller filerna i 5.1.2 för en experimentellt förvärvade confocal bildstapel RyR kluster och myofibrils.
- Kontrollera att följande paket installeras med package installer gui i R: snö, doSNOW, doparallel, foreach, iteratorer och rgl.
- Köra simulatorn genom att ange följande kommando i fönstret R kommandot: källa (' sökväg till ryr-simulator-parallell. R', chdir = TRUE)
Obs: Utdata från programmet RyR-Simulator är en lista över txt-filer (en numPatterns genereras fil) som innehåller samordna listor i N rader och 3 kolumner, som företräder x, y och z koordinater av N simulerade RyR kluster.
-
Karta punkter som rumsliga tätheter på en beräkningsmodell som använder CardiacCellMeshGenerator.
- Genom att välja knappen märkt ”Välj RyR points file”, Välj en simulerad RyR kluster distribution textfil från dem som var produktionen av RyR-simulatorn.
- Köra ”RyR densitet Mapper” GUI i MATLAB. Detta kartlägger de rumsliga platserna av de simulerade RyR kluster i txt-filen i steg 5.3.1 på finita element mesh som genereras i steg 4,8 med en metod som kallas en sfärisk kernel intensitet estimator metod26.
Obs: Utdata från detta steg är en fil med filtillägget .txt som innehåller en lista med värden för numeriska densitet ion-kanal per enhet sfärisk volym vid varje de computational mesh-noderna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 2 och figur 7 ger representativa resultat av flera viktiga steg i detta protokoll: (i) visualisering och omorientera vävnad block för tvärsnittsdata elektronmikroskopi vyer; (ii) generera en 3D elektronmikroskopi bildstapel; (iii) segmentera sub cellulära ultrastruktur för organeller av intresse. (iv) generationen av ett finita element mesh med iso2mesh; (v) simulerar en realistisk fördelning av RyR kluster på maskan, (vi) följt av mappning denna rumsliga fördelning som en spatial densitet över den computational mesh.
Figur 2 visar typiska ljusa fält bilder som visar hur celler visas när orienterade longitudinellt (figur 2A, märkt L), snett (figur 2A, märkta O) och cross-sectionally (figur 2B) med avseende på den skärande plan. Sneda och longitudinellt orienterade prover uppvisar strimmor, medan cross-sectionally orienterade prover inte uppvisar strimmor. Kapillärerna visas också mer cirkulär i tvärsnittsdelstudien vyer än i sneda visningar.
Figur 3A visar en representativ bild av en god kvalitet tomogram stack som kan förvärvas när protokollet vävnad förberedelse i steg 1 följs. Vara måste försiktig när du utför 3D rekonstruktion från serierna Mikroskop bild tilt. Felaktiga spårning av kolloidala partiklar av guld, eller brist på tillräckligt guld partiklar kan påverka kvaliteten — bild kontrast och bild fokus — av tomogram avsevärt. Detta påverkar möjligheten att segmentera olika strukturer betydligt. Omsorg och erfarenhet är nödvändigt att säkerställa att vävnad blocken färgas tillräckligt och att det är en jämn fördelning av Kolloidalt guld partiklar genom vävnad volymen. Om i tvivel, kan det vara bra att rådgöra med en specialist laboratorium eller anläggning vid lokala institution. Om modellgenerering görs med låg kontrast eller felaktigt rekonstrueras data, modeller kan fortfarande genereras men korrespondens modellering resultat med egenskaperna för de biologiska system för att simuleras kan vara dålig. Figur 3B visar en representativ bild av vad en segmenterad modell av myofibrils och mitokondrier ser ut.
Figur 4E visar en 3D-rendering av den tetraedriska mesh som produceras av iso2mesh. Så länge de ursprungliga bilden stack och segmentering uppgifterna är av god kvalitet, är detta steg relativt robust. Figur 6B och 6 c figur visar en typisk RyR kluster distribution (i rött) inom 3D cellulära topologin. I detta skede är mesh själv inte indata i RyR simulatorn. En bildstapel cellkanten och klyftorna mellan myofibrils och mitokondrier — genereras från segmenterade bilder i figur 4 — bilda stora ingångarna till RyR simulatorn. Försiktighet måste iakttas att segmentera gränserna för myofibrils och mitokondrierna så noggrant som möjligt; felaktig segmenteringar skulle resultera i en felaktig representation av cell topologin i data, som följaktligen kommer att påverka RyR placering inom mesh. Detta skulle då påverka plats och tid dynamiken av calcium signalering i hjärtmuskelcellen (Application 1).
Figur 7 visar 3 instanser av simulerade RyR kluster på samma maska topologi efter med sfäriska kernel intensitet estimator algoritm. Märka variationen i organisationen av RyR kluster. Dessa variationer har mätts i det variabilitet som hittades i den experimentella data18. Var noga med att välja kernel sfär radien och stegstorlek över vilka prover kärnan RyR kluster tätheten. Dessa två faktorer påverkar hur kraftigt eller diffust en representation av tätheten av RyR kluster kommer att beskrivas på mesh. En analys av effekten av olika värden för dessa parametrar kommer för att begränsa på parametervalen för en rimlig mesh.
Den resulterande mesh RyR kluster myofibrils och mitokondrierna är en minimal modell hjärtmuskelcellen struktur. Detta nät har tillämpats, samt varianter av det som härrör från andra data och cellstruktur, studera kalcium dynamics och blockeringar. En översikt över de två programmen beskrivs nedan för att illustrera kraften i finita element modellering av cellstrukturen i ger insikter på struktur-funktionssamband.
Ansökan 1 18 : Spatiotemporal dynamics av kalcium släppa i hjärtmuskelcellerna. Denna modell har använts för att undersöka rollen som heterogen fördelning av RyR kluster, myofibrils och mitokondrier på Kalciumsignalering. Figur 8 visar spatiotemporal dynamiken i cytosoliskt kalcium under stigande fasen av övergående när simuleras på mesh topologin genererat från detta protokoll. Figur 8B visar heterogena fritt kalcium och fluorophore-bound-kalcium koncentration över tid. Pilarna pekar på små fläckar av hög kalcium på grund av en högre täthet av RyR kluster eller mitokondrier i dessa regioner. Figur 8 c visar simulerade linje-scanna bilder som kan jämföras med experimentella linje-scanna bilder av kalcium dynamik som samlas vanligtvis använder levande konfokalmikroskopi. Modellen simuleringen ger en mycket högre upplösning bild av rumslig heterogenitet av kalcium än en experimentellt förvärvade bild. Dessutom på grund av den modellen som härrör från strukturella mikroskopi data, inaktiverat antalet kluster som måste förbli (~ 4-6) efter elektriska aktiveringen för heterogeneitiesna att uppstå i bilden confocal linje-scan kan bestämmas exakt. Liknande heterogeneitiesna observeras i experimentellt förvärvade linje-scanna bilder av kalcium dynamik i djurmodeller av hjärtsvikt18
Program 2 27 : Spatiotemporal dynamiken i mitokondriell blockeringar i hjärtmuskelcellerna. Ett övergripande syfte med detta arbete är att studera förhållandet mellan kalcium dynamics, mitokondriell Bioenergetik och muskelkontraktion. Simuleringar av mitokondriell oxidativ fosforylering i isolering inom hjärtmuskelcellen har utförts som ett första steg. Som sådan, fördelningen av RyR kluster behövs inte, och man kan helt enkelt använda mesh vid steg 3,4. Som en mer komplex ansökan, kan blockeringar (program 2) kombineras med kalcium dynamics (ansökan 1) i en modell som använder alla komponenter beaktas i mesh och modellera konstruktion, dvs mitokondrier, myofibrils och ryanodine receptorer.
Figur 9 representerar resultaten från dessa rumsliga metabolism simuleringar över olika regioner i ett nät som genereras med hjälp av steg 3,4. Figur 9A skildrar syrekoncentrationen i hela cellen tvärsnitt, medan figur 9B visar koncentrationen av ADP endast i myofibril facket av cellen. Figur 9 c skildrar fördelningen av mitokondriella membranpotential i mitokondriell nätverket. Dessa siffror visar ojämna fördelningen av mitokondrier och myofibrils i cell tvärsnitt. De visar också det inhomogena metabola landskapet som följd av detta icke-enhetlig ultrastruktur. Detta visar kraften i mikroskopi data baserat finita element simulering för att ge insikter på struktur-funktionssamband som annars är svårt att erhålla genom experimentella metoder ensam.
Figur 1: av beredning av hjärtat för kemiska fixering. (A) Schematisk av perfusion apparat. Avstängningskranen innehåller en ventil att växla mellan Tyrodes och fixativ lösningar. Bägaren vid basen används för att fånga lösningar som BEGJUTA genom hjärtat. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: undersöka cell orientering under ljusa fält mikroskopi. (A) ljusa synfält av toluen blå färgade tjocka delen av hjärtvävnad som illustrerar celler som longitudinellt orienterad (L) och snett orienterad (O) med avseende på imaging planet; Observera strimmorna i längdriktningen orienterade cellen, t.ex. (B) ljusa fältet vy av en vävnad avsnitt som har tvärgående, tvärsnitt av cellen i linje med bildplanen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: segmentering av elektronmikroskopi data. (A) ögonblicksbild av manuell segmentering av mitokondrier med verktyget sculpt. (B), en 3D-vy av de kompletta segmenterad manuellt mitokondrier, myofibrils (i en mängd färger) och sarcolemma (i rosa). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: omvandla binärt bildstaplar i 3D tetraedriska mesh. (A-C) Binärt masker av sarcolemma, myofibrils och mitokondrier, respektive. (D) sammanfogad Visa av binära masker av myofibrils (i rött) och mitokondrier (i grönt). (E) representativa tetraedriska mesh som genererades från bilden stacken i (D) med iso2mesh. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: CardiacCellMeshGenerator. En skärmbild av det grafiska användargränssnittet som medföljer denna protokoll publikation för användare att utföra steg 4 och 5. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: simulerar en realistisk RyR kluster distribution på en segmenterad elektronmikroskopi bildstapel av hjärt ultrastruktur. (A) A binär bild stack föreställande klyftorna mellan myofibrils och mitokondrier, som representerar uppsättningen av alla pixlar där RyR kluster hittades. (B), en 3D-rendering (bild inte dras till skala) av en av de simulerade RyR kluster distributioner (visas som röda områden) inom 3D geometri skildras i 3D image stack; de gröna ytorna representerar mitokondrierna i en bildstapel. (C) en högre-förstoring (alltså en liten del skärs ut ur cellen tvärsnitt vid gränserna) syn på en överlagring av RyR kluster från steg 4 och computational maskan från steg 3 på en bit av den 3D elektron tomografi bildstapel. (B) och (C) har ändrats från Ulf et al. 18 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: rumslig distribution av numeriska densitet av RyR kluster från tre simulerade RyR kluster mönster. Alla mesh-noder är färgkodade från white för numeriska densitet 0,0 RyR kluster/µm3 till rött för en högsta numeriska täthet på 0,99 RyR kluster/µm3. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 8: Rumslig heterogenitet i [Ca2 +]jag under Ca2 + övergående stigande fas. (A) Genomsnittligt cytosoliska fritt sprida [Ca2 +]jag (vänster) och Fluo-4 bunden Ca2 +, [F4Ca]jag (höger). (B) och (C) Visa time-lapse ögonblicksbilder av fritt sprida Ca2 + och F4Ca på z-skivan, tvärgående plan; svarta pilar Markera regioner av hög [Ca2 +]jag på grund av mitokondriell kluster; röda pilarna Markera regioner av hög [Ca2 +]i på grund av flera RyR kluster i närheten. (C) simulerade linje skanningar av [Ca2 +]jag (mitten) [F4Ca]jag (höger). Line positionen visas på cell tvärsnitt till vänster. Den horisontella dimensionen av cell tvärsnitt har lämnats som en indikator på den rumsliga skalan i ottomotorer av bilden. Denna siffra har ändrats från Ulf et al. 18 Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 9: rumslig distribution av metaboliter och mitokondriella membranpotential genereras från rumsliga simulering av hjärt energiomsättning. (A) syrekoncentrationen i hela cellen tvärsnitt i enheter av µM, (B) koncentrationen av ADP endast i myofibril delen av cellen i enheter av µM. (C) fördelning av mitokondriella membranpotential över den mitokondriella nätverket i enheter av mV. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 10: visualisering av en simulerad RyR kluster punkt mönster på R-statistik paketet. Detta fönster visas vid ingående av RyR kluster simuleringar, som skildrar först av de simulerade punkt mönsterna. Detta kan användas som indikator att RyR-simulatorn har ingått samt och kan förhöra kvaliteten på de simulerade mönsterna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Kemikalier | Kvantiteter |
| 0,2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Destillerat vatten | 20 mL |
| 0,15 M natrium cacodylate buffertlager | |
| Natrium cacodylate | 32,1 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Späd 1 L med destillerat vatten | |
| pH 7,4 | |
| 0,3 M natrium cacodylate buffertlager | |
| Natrium cacodylate | 64,2 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Späd 1 L med destillerat vatten | |
| pH 7,4 | |
| Tyrode lösning sammansättning | |
| NaCl | 139 mM |
| KCl | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glukos | 12 mM |
| NaHCO3 | 17 mM |
| Probenecid | 1 mM |
| BDM | 20 mM |
| NaCl/KCl/NaHCO3 1 L lösning | |
| NaCl (molekylvikt 58.44 g/mol) | 81,2 g |
| KCl (molekylvikt 74.55 g/mol) | 2.24 g |
| NaHCO3 (molekylvikt 84.01 g/mol) | 14,28 g |
| Löses upp i 1 L destillerat vatten | |
| MgCl2/CaCl2 1 L lösning | |
| CaCl2 (2H2O) (molekylvikt 147 g/mol) | 1.764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) | 0.814 g |
| Löses upp i 1 L destillerat vatten | |
| 1 M 200 mL glukoslösning | |
| Dextros (molekylvikt 180.16 g/mol) | 36.03 g |
| Lös i 200 mL dubbel destillerat vatten | |
| Tyrode lösning 500 mL lösning | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 mL |
| Glukos | 6 mL |
| Dubbel destillerat vatten | 400 mL |
| Bubbla syre i lösning för 5 min | |
| 2% PFA + 2,5% glutaraldehyd + 0,2% tanic syra fixativ i 0,15 M natrium cacodylate | |
| PARAFORMALDEHYD pulver (PFA) | 2 g |
| Tanic syra | 0,2 g |
| Destillerat vatten | 20 mL |
| 25% glutaraldehyd | 10 mL |
| 0,3 M natrium cacodylate | 20 mL |
| 0,15 M natrium cacodylate | 50 mL |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 mL destillerat vatten |
| 4% uranyl acetat stamlösning | |
| Uranyl acetat | 4 g |
| Nära kokande dubbel destillerat vatten | 96 mL |
| Lös upp UA i nära-bioling vatten med en omrörare i en fumehood. | |
| Filtrera UA genom en Whatman nr 1 filter till 200 mL brun flaska för lätta skydd | |
| Cap tätt och etikett, förvaras vid 4 ° C | |
Tabell 1: Reagenser och kvantiteter för vävnad förberedelse för elektronmikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det ovannämnda protokollet beskriver viktiga steg för att generera en roman finita element geometriska modell för hjärtmuskelcellen ultrastruktur. Metoden möjliggör computational fusion av olika mikroskopi (eller, i princip, andra data) metoder för att utveckla en mer omfattande beräkningsmodell för hjärtmuskelcellen dynamik som innehåller detaljer av rumsliga cell arkitekturen. Det finns för närvarande inga andra protokoll som är tillgängligt för att skapa en sådan modell av en hjärtmuskelcellen.
Steg 1 beskrivs ett protokoll för perfusion fixering. Alternativt, hjärtat kunde vara censurerade, dissekeras i mindre bitar och nedsänkt i fixativ. Men denna process måste göras snabbt och kan ha varierat resultat, beroende på storleken på proverna. I författarnas erfarenhet säkerställer perfusion grundlig infiltration av fixeringsvätskan in i vävnad och celler. Författarna har också tidigare perfusion hjärtat med Krebs-Henseliet lösning för att göra hjärtat slå innan fixering. Detta gjorde mätningar på arbetande hjärtat före fixering.
Elektronmikroskopi processtegen i steg 2 är typiska för elektron tomografi. De bearbetning lösning kvantiteterna, särskilt av färgning lösningar och tiderna kan variera när du använder andra avbildningstekniker såsom svepelektronmikroskopi eller fokuserad ion-beam mikroskopi28följetong-block-ansikte. Förvärvade elektronmikroskopi bilderna måste vara uppdelad i olika organell regioner, såsom mitokondrier, myofibrils och transverse tubuli. Detta kan utföras manuellt eller i ett automatiserat sätt. Kontrasten i bilden stacken är delvis beroende av framgången av protokollet färgning, men några av denna kontrast går förlorad när du utför tomografi. Det här protokollet beskriver manuella steg för att segmentera de olika strukturerna, även om nya metoder för att utföra automatisk segmentering29 blir mer gynnsam i allmänhet att förbättra dataflöde.
De viktigaste egenskaperna att undersöka i elektronmikroskopi datamängden är bild kontrast och struktur bevaras. Färgning receptet och kådan inbäddning blandningar i detta protokoll har förfinats för hög kontrast mellan myofibrils, mitokondrier och z-skivorna av hjärt cellen. Författarna har exempelvis tidigare använt kalciumklorid i stället för garvsyra i steg 1.2 för att avgränsa det sarkoplasmatiska retikulära nätverket. Detta hjälpte med att identifiera myofibril buntar yttre gränser under organell segmentering. Ytterligare färgning kemiska komponenter och tider kan också användas för att visualisera membranstrukturer, såsom den sarkoplasmatiska nätmagen eller tvärgående-axial tubuli30.
Bilderna måste också granskas för strukturell nedbrytning. Dålig fixering eller elektronmikroskopi bearbetning kan resultera i allvarlig förlust av mitokondriella cristae, hög andel av rubbas eller svullna mitokondrier och sönderfall av delar av cellmembranet (sarcolemma). En närmare och noggrann undersökning kan också Visa förlust av den t-tubulär och SR membran, men är mindre uppenbara för ett otränat öga. Lösningar på problemet inkluderar: (i) att säkerställa grundlig genomblödning; (ii) dela upp vävnaden i små prover som också garanterar djup penetration av fixativ och fläckar; (iii) säkerställa att elektronmikroskopi bearbetning är gjort i kalla lösningar eller på is där så anges; och (iv) se till att tiderna för färgning och dehydrering (uttorkning i synnerhet) följs strikt.
En typisk hjärtmuskelcellen är ~ 20 µm i tvärsnitt diameter och ~ 100 µm i längd. Detta gör imaging hela hjärtats celler en betydande utmaning. Dessutom komplicerar förändrade inriktningen av muskelfibrer inom hjärtat31 ytterligare förvärvet av en bild volym vars axlar är i linje med de tvärgående och längsgående axlarna för en cell av intresse. Bild analysprogram såsom IMOD aktivera syntetiska re-anpassning av data till en önskad orientering. Senaste framstegen inom seriell block-face scanning electron microscopy28 och tillhörande bildbehandling algoritmer29 också att lösa dessa problem. Trots kommer att noggrann undersökning av tjocka sektioner under ett ljusmikroskop och efterföljande re-orientation av blocket (steg 2.5) öka sannolikheten för imaging celler med rimlig anpassning av längsgående och tvärgående axlarna med bildtagning axlar. Detta kommer att säkerställa att de flesta av cell volymen kommer att fångas inom synfältet.
Protokoll steg 3, 4 och 5 kräver programvara som anges i Tabellen för material som ska installeras. IMOD, R-statistik paketet, iso2mesh och FiJi (en version av ImageJ för mikroskopi data) har omfattande dokumentation och tutorials på hur man använder dem. CardiacCellMeshGenerator är en MATLAB-program som har utvecklats för att göra det lättare för användaren att bygga modellen i ett enkelt arbetsflöde. Användare kan hämta hela källa koden och programpaket från github RyR-simulator databasen länk (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). Ansökan, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, kan installeras i MATLAB som en app. Ingångarna för nät genereras i detta protokoll kan hittas inuti RyR-simulator/indata-filer/mål-tomo-cell /, medan ytterligare ingångar för RyR-klustret simulatorn kan hittas inuti RyR-simulator/indata-filer/master-cell /. Innan appen, bör användare kontrollera att den installera iso2mesh mappen och dess undermappar har lagts till MATLAB sökvägen. På samma sätt, säkerställa att det R-paket som behövs (Tabell för material) för kluster simulatorn har installerats inom R.
En förloppsindikator har inkluderats i appen när du genererar mesh, när du genererar ingångarna för RyR kluster simulatorn, och när mappning RyR kluster tätheter på maskorna med hjälp av RyR densitet mapper; appen kommer att återge 3D mesh i GUI när steget mesh generation har ingått. Efter att ha avslutat RyR kluster simuleringarna i R användargränssnitt, ett grafiskt fönster visas (figur 10), som skildrar en av de simulerade 3D RyR kluster punkt mönsterna.
Knappen ”generera Mesh” på GUI utlöser funktionen iso2mesh för att generera en tetraedrisk mesh. Resolutionen som modell kan justeras genom att ange parametrarna ”iso2mesh” på GUI som justerar maximal tetraedriska element volym och kanta längden. Programmet skiljer för närvarande element som utgör regionen myofibril och mitokondrier regionerna; den här funktionen kommer att utökas med andra komponenter i cellen i framtiden.
Användare kan använda 3D rendering av mesh och RyR kluster för att felsöka dessa steg. RyR kluster simulering inställningar, etol och numIter, släpper inställningar. R påverka precisionen i RyR kluster simuleringarna; dessa två parametrar avgör när en RyR kluster mönster simulering avslutar. Dessa parametrar kan justeras vid inspektion av fördelningen av RyR klustren i fönstret R (figur 10) för att säkerställa att: (i) alla kluster är nära z-skivorna; och (ii) kluster är spridda över hela tvärsnittet i stället för att aggregera i någon en region. En ad hoc- känslighetsanalys av simuleringarna att dessa två parametrar kan utföras för att bestämma en lämplig kombination av etol och numIter.
Sfäriska kernel intensitet estimator i steg 5 använder en sfär av valda diameter som en kärna, som förs över volymen av intresse (3D rumsliga modellen i detta sammanhang). Dessa parametrar kan justeras för denna utjämning algoritm på GUI i figur 5: (1) r_sphere definierar radien av sfäriska kernel utjämning; (2) hval definierar iterativ rumsliga stegstorlek som sfäriska kärnan iterativt måste skickas över volymen.
Ett enkelt sätt att avgöra om parametrarna spatial densitet är tillräckligt är att kontrollera distributionen av RyR kluster densitet värdena som visas i figur 7. Värdena för densitet ska fördelas så att stadsdelen i hög densitet värden är en liknande storlek till storleken av ett RyR kluster i mikroskopi data.
Det nuvarande protokollet producerar ett finita element-modell som bara innehåller realistiska fördelningen av myofibrils, mitokondrier och RyR kluster. Ett tillägg till detta steg skulle vara att simulera distribution av andra-jonkanaler som spelar en roll i ECC, såsom sarco-endoplasmic retikulära kalcium pumpar (SERCA2a), natrium-kalcium värmeväxlare (NCX) och sarcolemmal kalcium pumpar. Nyckeln till dessa tillägg är en analys av den geografiska fördelningen av jonkanalerna från immunofluorescens data. Exempelvis NCX kanaler har mätts för att vara jämnt fördelat över t-tubulär membranen på ett genomsnittligt avstånd av 0,67 µm, men deras förhållande till RyR kluster är inte så tydliga32. Å andra SERCA2a inriktning antikroppar har tidigare använts för att markera de SR33, men den rumsliga tätheten av SERCA2a har inte rapporterats i litteraturen. I detta skede, kan därför en enhetlig fördelning av SERCA 2A över SR nätverket och NCX över de t-tubuli antas med försiktighet.
Som visat i representativa resultat, kan den resulterande finita element mesh användas med finita element solvers34 att simulera biokemiska processer såsom kalcium signalering18 och bioenergetik27 som reaktion-diffusion processer. I detta syfte representeras jonkanaler reaktion platser på noder inom maska topologi. De reaktion platserna fungera som källor eller sänkor av olika kemiska arter att representera flödet av kemiska ämnen genom dessa jonkanaler i olika fack i cellen. De utdata mesh och RyR densitet filer från detta protokoll kan användas med alla andra integrator eller inom någon annan miljö, förutsatt att programvaran har funktionen att erkänna dessa textfiler. Textfiler kan också manipuleras av skript eller tredje parts programvara för att tillfredsställa indatafilen formatkraven för val miljö. Den första ansökan på kalcium dynamics endast visar nyttan av denna modell för att kalcium kunna men detta innebär inte att maskorna inte kan användas för längre tidsskalor. Den mesh och kluster täthet kan användas för att simulera flera kalcium cykler, med att upprätthålla homeostas och stabilitet endast beroende av Problemlösaren finita element som används.
Ett mer långsiktigt mål är att förbättra denna pipeline av modellbygge för att göra det enkelt att skapa strukturellt korrekt finita element modeller av hjärtmuskelceller och andra celltyper. En automatiserad segmentering algoritm har utvecklats nyligen, som kan tillämpas på serial-block-face skanning elektronmikroskopi data av hjärtmuskelcellerna att skapa en modell av myofibrils och mitokondrier distribution i hela cellen med minimal användare ingång29. Denna metod kommer att utökas för att segmentera de t-tubuli och SR membran nätverk i framtiden. En mer generaliserad version av RyR-simulator algoritm som gör att användare att analysera och simulera samtidig platser mellan jonkanal och organeller, liksom mellan olika Jon-kanaltyper, i en hög genomströmning mode är också under utveckling. En sömlös protokoll för att bygga en komplett modell av cellen skulle göra det möjligt för forskare att utföra modellbaserad hypoteser tester på förhållandet mellan cellstruktur och cellens funktion mer rutinmässigt än är för närvarande möjligt med experimentella metoder ensam.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av det kungliga samhället av nya Zeeland Marsden snabbt starta Grant 11-UOA-184, den mänskliga gränser Science Program forskningsbidrag RGP0027/2013 och den australiska forskning rådet Discovery Project Grant DP170101358.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
