Denne protokol beskriver en ny metode for at skabe et rumligt detaljerede finite element model af den intracellulære arkitektur af cardiomyocytes fra elektronmikroskopi og konfokal mikroskopi billeder. Kraften i denne rumligt detaljerede model er påvist ved hjælp af casestudier i calcium signalering og bioenergetik.
Med fremkomsten af tre-dimensionelle (3D) tænkelig teknologier såsom elektron tomografi, seriel-blok-ansigt scanning Elektron Mikroskopi og konfokal mikroskopi, det videnskabelige samfund har hidtil uset adgang til store datasæt på sub mikrometer opløsningen, der karakteriserer den arkitektoniske remodellering, der ledsager ændringer i cardiomyocyte funktion i sundhed og sygdom. Disse datasæt har dog været underudnyttede for at undersøge rollen i cellulære arkitektur remodeling i cardiomyocyte funktion. Formålet med denne protokol er at skitsere hvordan du opretter en nøjagtig finite element model af en cardiomyocyte ved hjælp af høj opløsning elektronmikroskopi og konfokal mikroskopi billeder. En detaljeret og præcis model af cellulære arkitektur har betydelige muligheder for at give ny indsigt i cardiomyocyte biologi, mere end eksperimenter alene kan samle. Kraften i denne metode ligger i dens evne til at beregningsmæssigt lunte oplysninger fra to forskellige billeddiagnostiske modaliteter af cardiomyocyte ultrastruktur at udvikle en samlet og detaljeret model af cardiomyocyte. Denne protokol beskriver trin for at integrere elektron tomografi og konfokal mikroskopi billeder af voksne mandlige Wistar (navnet efter en bestemt hunderace albino rotte) rotte cardiomyocytes at udvikle en halv-sarkomeret finite element model af cardiomyocyte. Proceduren, der genererer en 3D finite element model, der indeholder en nøjagtig, høj opløsning skildring (størrelsesordenen ~ 35 nm) af fordelingen af mitokondrier, myofibrils og ryanodine receptor klynger, at frigive de nødvendige calcium til cardiomyocyte sammentrækning af sarcoplasmic retikulære netværket (SR) ind i myofibril og cytosole rum. Modellens genereret her som en illustration ikke omfatter oplysninger af den tværgående-tubulus arkitektur eller sarcoplasmic retikulære netværket og er derfor en minimal model af cardiomyocyte. Modellen kan imidlertid allerede anvendes i simulation-baserede undersøgelser til rollen af cellestruktur i calcium signalering og mitokondriel bioenergetik, som er illustreret og drøftet ved hjælp af to casestudier, som præsenteres efter den detaljeret protokol.
Excitation-sammentrækning kobling (ECC) i hjertet henviser til den vigtige og indviklede kobling mellem elektrisk excitation af cardiomyocyte membran og efterfølgende mekanisk sammentrækning af cellen under hvert pulsslag. Matematiske modeller har spillet en nøglerolle i at udvikle en kvantitativ forståelse af de indbyrdes forbundne biokemiske processer, der regulerer aktionspotentialet1, cytosole calcium signalering2, bioenergetik3, og efterfølgende kontraktile styrkegenerering. Sådanne modeller har også med succes forudsagt ændringer til hjerteslag når én eller flere af disse biokemiske processer undergå ændringer4,5. Den yderst organiseret ultrastruktur af cardiomyocyte er i stigende grad blevet anerkendt til at spille en afgørende rolle i den normale kontraktile funktion af cellen og hele hjertet. Faktisk sker ændringer til morfologi og organisation af komponenter af cardiac ultrastruktur parallelt til biokemiske ændringer i sygdomstilstande såsom hypertrofi6, hjertesvigt7og diabetisk kardiomyopati8. Om disse strukturelle ændringer er mindre, adaptive eller patologiske svar til de ændrede biokemiske forhold er stadig stort set ukendt9. Den i sagens natur tætte kobling mellem form og funktion i biologi betyder, at eksperimentelle undersøgelser alene ikke giver dybere indsigt end korrelationer mellem strukturelle remodellering og cardiomyocyte funktion. En ny generation af matematiske modeller, der kan optage den strukturelle forsamling af subcellulære komponenter, sammen med de velundersøgte biokemiske processer, er nødvendigt at udvikle en omfattende og kvantitativ forståelse af forholdet mellem struktur, biokemi og kontraktile styrke i cardiomyocytes. Denne protokol beskriver metoder, der kan bruges til at generere strukturelt nøjagtig finite element modeller af cardiomyocytes, der kan bruges til sådanne undersøgelser.
Det sidste tiår er sket betydelige fremskridt i 3D elektronmikroskopi10, Konfokal11og super-resolution mikroskopi12 der giver hidtil uset, høj opløsning indsigt i nano-skala og mikro-skala samling af den subcellulære komponenter af cardiomyocyte. For nylig, disse datasæt har været brugt til at generere beregningsmæssige modeller af cardiomyocyte ultrastruktur13,14,15,16. Disse modeller bruger en veletableret engineering simulation metode, kaldet finite element metoden17, oprette finite element beregningsmæssige masker over, hvilke biokemiske processer og cardiomyocyte kontraktioner kan simuleres. Disse modeller er dog begrænset af opløsning og detaljer, som en mikroskopi metode kan give i et billede datasæt. For eksempel, elektronmikroskopi kan generere nanometer-niveau detalje af cellestruktur, men det er svært at identificere specifikke proteiner inden for det billede, der vil være nødvendigt at oprette en model. På den anden side super-resolution Optisk mikroskopi kan give høj kontrast billeder med opløsninger på rækkefølgen af 50 nm af kun en vælge par molekylære komponenter i cellen. Kun ved at integrere supplerende oplysninger fra disse billeddiagnostiske modaliteter kan man realistisk udforske følsomheden af funktion til ændringer i struktur. Korrelationsmaalinger lys og elektronmikroskopi er stadig ikke en rutine fremgangsmåde, og det vil stadig lide den begrænsning, at kun et begrænset antal komponenter kan farves i visningen immunofluorescens og korreleret med visningen Elektron Mikroskopi.
Denne protokol udgør en roman tilgang18 , der anvender statistiske metoder19 til at analysere og beregningsmæssigt fuse lysmikroskopi oplysninger om den geografiske fordeling af ion-kanaler med elektronmikroskopi oplysninger om andre hjertesygdomme ultrastruktur komponenter, såsom myofibrils og mitokondrier. Dette producerer en finite element model, der kan bruges med biofysiske modeller af biokemiske processer til at studere rollen, som cardiomyocyte subcellulære organisation på de biokemiske processer, der regulerer cardiomyocyte sammentrækning. For eksempel, denne protokol kan bruges til at oprette modeller fra sund og streptozotocin-induceret diabetisk hjerte myocytes at studere effekten af strukturelle remodeling på hjerte cellefunktion, der er observeret i diabetisk dyre modeller8. En yderligere fordel ved den statistiske karakter af metoden præsenteres fremgår også i protokollen: metoden, der kan generere flere forekomster af finite element geometrier, der nøje efterligne de eksperimentelt observerede variationer i cellestruktur.
Som overblik, protokol skridt omfatter: (i) forberedelse af hjertets væv til elektronmikroskopi at generere 3D billeder med tilstrækkelig opløsning og kontrast; (ii) genopbygning og segmentering af 3D billedstakke fra elektronmikroskopi data ved hjælp af en 3D elektronmikroskopi genopbygning og billedanalyse software kaldet IMOD20; (iii) ved hjælp af iso2mesh21 til at generere en finite element mesh ved hjælp af segmenterede data som input; (iv) ved hjælp af roman algoritme og koder til at knytte fordelingen af Ionkanaler på finite element mesh.
Udgangspunktet for tilgangen til hvert trin er skitseret i protokollen, og repræsentative resultater findes i de ledsagende figurer. Overblik er skitseret, angive, hvordan de genererede rumligt detaljerede modeller kan bruges til at studere den rumlige ændringer af calcium under ECC, samt mitokondrie bioenergetik. Nogle af de nuværende begrænsninger i protokollen er diskuteret, samt nye udviklinger, der er på vej til at overvinde dem og yderligere fremme en kvantitativ forståelse af rollen af cellestruktur til hjerte systembiologi. Hvordan disse metoder kan generaliseres til at oprette finite element modeller af andre celletyper er også rettet.
Brugere af denne protokol kan springe trin 1 og genopbygning del af trin 2, hvis de har adgang til en eksisterende Elektron Mikroskopi billedstak. Brugere, der har til hensigt at erhverve deres data i samarbejde med mere erfarne elektron microscopists måtte ønske at diskutere og sammenligne fiksering og farvning procedurer i trin 1 med ekspert til at bestemme en optimal protokol for erhvervelse.
Den ovennævnte protokol beskriver vigtige trin for at generere en roman finite element geometriske model af cardiomyocyte ultrastruktur. Metoden gør det muligt for computational fusion af forskellige mikroskopi (eller i princippet, andre data) metoder til at udvikle en mere omfattende computational model af cardiomyocyte dynamik, der omfatter detaljer af rumlige celle arkitektur. Der er i øjeblikket ingen anden protokol til at oprette sådan en model af en cardiomyocyte.
Trin 1 skitserer en…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den kongelige samfund i New Zealand Marsden hurtigt starte Grant 11-UOA-184, menneskelige grænser Science Program Research grant RGP0027/2013 og australsk forskning Rådet Discovery Project Grant DP170101358.
Materials | |||
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
Equipment | |||
Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
Retort stand | Proscitech | T752 | |
Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
Software | |||
SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
spatstat | R-project | install via R program | |
rgl | R-project | install via R program | |
doparallel | R-project | install via R program | |
foreach | R-project | install via R program | |
doSNOW | R-project | install via R program | |
iterators | R-project | install via R program |