Summary
Bu iletişim kuralı bir dağınık şekilde detaylı Sonlu elemanlar modeli cardiomyocytes hücre içi mimarisinin elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu görüntüler oluşturmak için yeni bir yöntem özetliyor. Bu dağınık şekilde detaylı model gücünü vaka çalışmaları kalsiyum sinyal ve bioenergetics kullanarak gösterilmiştir.
Abstract
Elektron tomografi gibi üç boyutlu (3D) görüntüleme teknolojileri çıkışıyla, seri blok-surat scanning elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu, bilimsel topluluk benzeri görülmemiş büyük veri kümeleri alt mikrometre erişebilir mimari modelleme karakterize çözünürlük sağlığı ve hastalıkları cardiomyocyte işlevindeki değişiklikler eşlik eder. Ancak, bu veri kümeleri altında-hücresel mimarisi cardiomyocyte işlevinde remodeling rolü soruşturma için kullanılan olmuştur. Bu protokolü nasıl yüksek çözünürlüklü elektron mikroskobu ve confocal mikroskobu görüntüleri kullanarak bir cardiomyocyte bir doğru Sonlu elemanlar modeli oluşturmak için anahat amacıdır. Hücresel mimarisinin ayrıntılı ve doğru modeli cardiomyocyte biyoloji, deneyler yalnız toplamak daha yeni görüşler sağlamak için önemli potansiyele sahiptir. Bu yöntemin gücü hesaplama açısından tek Birleşik ve ayrıntılı bir model cardiomyocyte geliştirmek için cardiomyocyte ultrastructure iki farklı görüntüleme yöntemleri üzerinden bilgi sigorta yeteneğini yatıyor. Bu iletişim kuralı elektron tomografi ve yetişkin erkek Wistar (albino sıçan belirli bir cins için ad) sıçan cardiomyocytes cardiomyocyte yarı-sarcomere Sonlu elemanlar modeli geliştirmek için confocal mikroskobu görüntüleri tümleştirmek için özet bilgiler. Yordam bir doğru yüksek çözünürlüklü tasvir içeren bir 3B Sonlu elemanlar modeli oluşturur (~ 35 sırasına nm) mitokondri, myofibrils ve cardiomyocyte için gerekli kalsiyum yayın ryanodine reseptör kümeleri dağılımı myofibril ve sitozolik bölme içine daralma sarcoplasmic Retiküler ağdan (SR). Oluşturulan modeli burada bir örnek enine tübül mimarisi veya sarcoplasmic Retiküler ağ ayrıntılarını dahil değildir ve bu nedenle cardiomyocyte en az bir modeldir. Yine de, model zaten rolü gösterilmiştir ve takip sunulmaktadır iki vaka çalışmaları kullanma ele kalsiyum sinyal ve mitokondriyal bioenergetics, hücre yapısının simülasyon tabanlı soruşturmalar uygulanabilir Detaylı iletişim kuralı.
Introduction
Uyarma-kasılma kaplin (ECC) kalbinde önemli ve karmaşık cardiomyocyte membran elektrik uyarma ve hücre sonraki mekanik daralma her kalp atışı sırasında arasındaki kancası anlamına gelir. Matematiksel modeller düzenleyen aksiyon potansiyeli1,2, bioenergetics3, sinyal sitozolik kalsiyum birbirine biyokimyasal süreçler nicel bir anlayış geliştirmek önemli bir rol oynadığı ve sonraki contractile kuvvet oluşturma. Bu modeller de başarıyla ne zaman bir sinyal değişiklikleri tahmin veya birkaç bu biyokimyasal süreçlerin değişiklikler4,5tabi. Cardiomyocyte son derece organize ultrastructure giderek hücre ve tüm kalp normal contractile işlevinde önemli bir rol oynamak için kabul edilmiştir. Gerçekten de, morfoloji ve kardiyak ultrastructure bileşenlerinin organizasyonu için değişiklikler hipertrofisi6, kalp yetmezliği7ve diyabetik kardiyomiyopati8gibi hastalık koşullarında biyokimyasal değişikliklere paralel olarak gerçekleşir. Değişen küçük, adaptif veya patolojik yanıt-e doğru bu yapısal değişikliklerdir biyokimyasal koşulları olup hala büyük ölçüde bilinmeyen9. Form ve fonksiyon Biyolojide arasında doğal olarak sıkı kancası anlamına gelir deneysel çalışmalar yalnız yapısal tadilat ve cardiomyocyte fonksiyonu arasındaki ilişkiler daha derin anlayışlar sağlayamaz. Alt hücresel bileşenleri ile birlikte iyi okudu biyokimyasal süreçler, yapısal montaj dahil edebilirsiniz matematiksel modeller yeni nesil ilişki kapsamlı, nicel bir anlayış geliştirmek için gerekli olan yapısı, biyokimya ve cardiomyocytes contractile kuvvet arasında. Bu iletişim kuralı böyle araştırmalar için kullanılan cardiomyocytes yapısal olarak doğru Sonlu elemanlar modelleri oluşturmak için kullanılan yöntemleri açıklar.
Son on yılda önemli gelişmeler 3D elektron mikroskobu10, confocal11ve nano ölçekli ve mikro ölçekli Meclisi görülmemiş, yüksek çözünürlüklü içgörü sağlamak süper çözünürlük mikroskobu12 gördü cardiomyocyte alt hücresel bileşenleri. Son zamanlarda, bu veri kümeleri cardiomyocyte ultrastructure13,14,15,16Hesaplamalı modelleri oluşturmak için kullanılmaktadır. Bu modeller Sonlu elemanlar yöntemi17, olarak adlandırılan bir köklü mühendislik simülasyon yöntemi, Sonlu elemanlar Hesaplamalı kafesler kasılmalar hangi biyokimyasal süreçler ve cardiomyocyte üzerinde benzetimi yapılabilir oluşturmak için kullanın. Ancak, bu modellerin çözünürlüğü ve mikroskopi yöntemi bir görüntü veri kümesinde sağlayabilir detay tarafından sınırlıdır. Örneğin, elektron mikroskobu nanometre düzeyinde detay hücre yapısı oluşturabilirsiniz, ancak spesifik proteinlerin bir model oluşturmak için gerekli olacak görüntü içinde tespit etmek zordur. Öte yandan, süper çözünürlük optik mikroskobu yüksek kontrastlı görüntüler 50 sırasına çözünürlüklerde sağlayabilir sadece bir kaç moleküler bile■enleri hücrenin nm. Sadece tamamlayıcı bilgileri görüntüleme Bu modalities entegre ederek bir gerçekçi işlevi duyarlılığını yapısındaki değişiklikler için keşfedebilirsiniz. Bağdaşık ışık ve elektron mikroskobu değil hala rutin bir işlem ve hala bileşenleri yalnızca sınırlı sayıda olabilir ayirt görünümünde lekeli ve elektron mikroskobu görünümüyle ilişkili olduğunu sınırlama etkilenecek.
Bu protokol analiz ve hesaplama açısından iyon kanalları mekansal dağılımı üzerinde ışık mikroskobu bilgilerle diğer kardiyak elektron mikroskobu bilgi sigorta için istatistiksel yöntemler19 kullanır bir roman yaklaşım18 sunar myofibrils ve mitokondri gibi ultrastructure bileşenleri. Bu biyokimyasal süreçler biyofiziksel modelleri ile cardiomyocyte cardiomyocyte kasılma düzenleyen biyokimyasal süreçler alt hücresel kuruluştan rolü eğitim için kullanılabilir bir Sonlu elemanlar modeli üretir. Örneğin, bu iletişim kuralını modelleri sağlıklılardan oluşturmak için kullanılabilir ve yapısal tadilat diyabetik hayvan gözlenen kardiyak hücre fonksiyonları üzerine etkisi çalışmaya streptozotocin indüklenen diyabetik kardiyak miyositler8modelleri. Sunulan yöntem istatistiksel niteliği bir avantajı da iletişim kuralında gösterilmiştir: yöntem birden çok yakından hücre yapısı deneysel olarak gözlenen değişimler taklit Sonlu elemanlar geometrileri örneği oluşturabilirsiniz.
Genel, iletişim kuralı adımlar içerir: (i) kalp doku hazırlanması için yeterli çözünürlük ve kontrast; 3D görüntüler oluşturmak elektron mikroskobu (ii) yeniden yapılanma ve 3D görüntü yığınları elektron mikroskobu verilerden bir 3D elektron mikroskobu imar ve görüntü analiz yazılımı kullanarak bölümleme but20denir; (iii) kullanarak iso2mesh21 bölümlenmiş veri giriş olarak kullanarak bir Sonlu elemanlar kafes oluşturmak için; (iv) iyon kanalları Sonlu elemanlar kafes üzerine dağılımı harita için roman algoritması ve kodları kullanarak.
Her adım yaklaşmak öncül protokolde belirtilen ve temsilcisi sonuçları eşlik eden resimler sağlanır. Genel bir bakış için oluşturulan dağınık şekilde ayrıntılı modeller sırasında ECC, aynı zamanda mitokondrial bioenergetics kalsiyum kayma dinamiklerini incelemek için nasıl kullanılabileceğini belirten seviyelendirilir. Bazı iletişim kuralının geçerli sınırlamaları, yanı sıra bunların üstesinden ve daha fazla kalp sistemleri Biyoloji hücre yapısı rolü nicel bir anlayışı ilerletmek için devam etmektedir yeni gelişmeler ele alınmıştır. Nasıl bu yöntemler diğer hücre tiplerinin Sonlu elemanlar modelleri oluşturmak için Genelleştirilmiş de ele.
Önceden varolan bir elektron mikroskobu görüntü yığını erişiminiz varsa kullanıcıların bu protokol adım 1 ve adım 2 imar parçası atlayabilirsiniz. Kullanıcı kim tasarlamak-daha deneyimli elektron microscopists ile işbirliği içinde onların veri elde etmek için tartışmak ve fiksasyon ve boyama işlemleri adım 1 Alım için en uygun bir iletişim kuralını belirlemek için uzman ile karşılaştırmak isteyebilirsiniz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm yöntem tanımlamak burada Auckland hayvan etik Komite ve University of California San Diego kurumsal hayvan bakımı ve kullanımı Komitesi, nerede doku Protokolü was orijinal gelişmiş Üniversitesi tarafından onaylanmıştır.
1. deneysel hazırlık
- Hisse senedi çözümleri 0.15 M ve 0,3 M sodyum cacodylate arabellekleri pH 7.4 Tablo 1göre hazırlayın.
-
Oxazolidin sabitleştirici (%2 paraformaldehyde (PFA) + %2.5 oxazolidin + % 0,2 Tannik asit 0.15 M sodyum cacodylate tampon pH 7,4) hazırlamak bileşenleri kullanarak, tablo 1'de listelenen.
- İngiltere'de yılın tozu distile su sürekli karıştırarak ile bir ocağın üzerinde 60 ° C'de 20 ml 2 g geçiyoruz.
- Kadar çözüm açıktır 1 M NaOH çözüm ekleyin.
- Çözüm sıcaklığı 40 ° C altında tamamlanana kadar bekleyin, sonra 10 mL oxazolidin ve 0,3 M sodyum cacodylate 20 mL ekleyin.
- Tannik asit 0.2 g ekleyin ve çözüm içinde çözülür.
- 0.15 M sodyum cacodylate 50 mL ekleyin.
- Eğer aynı gün kullanılmış buzdolabı 4 ° C'de veya buz üzerinde üç ya da dört 20 mL mercek şişeleri sabitleştirici, saklayın.
- Tablo 1' deki tarifi göre Tyrode'nın çözüm 20 mM 2, 3-butanedione monoxime (BDÖ), ile hazırlayın.
-
Bir Langendorff aparatı duman dolap içinde oluşturun.
- İki farklı imbik duruyor, yaklaşık 70 cm stand tabanından yüksek iki 100 mL plastik enjektör boru kelepçe.
- Plastik şırınga tüpler ve 3 mm iç çapında boru ve üç yollu stopcock şekil 1' de gösterildiği gibi kullanarak bir bağlayıcı tüp takın.
- 3 mm dış çap kanül bağlayıcı boru, nerede kalp perfüzyon fiksasyon için bağlı olarak altına uygun.
-
Şırınga tüpler Tyrode'nın çözüm ve 37 ° C'de sabitleştirici çözümleri ile doldurmak
- Tüp içindeki hava kabarcıkları şırınga çözümleri aralarında geçirerek kaldırın.
2. Cardiomyocyte Ultrastructure elektron mikroskobu verileri elde etmek
- Hayvan eksizyon ve kalp kimyasal fiksasyonu için hazırlayın.
Not: Bu protokol yetişkin erkek Wistar (albino sıçan belirli bir cins için ad) sıçan kalp doku işlemek için gereken adımları ayrıntılı. Ne zaman kalp doku diğer türlerden kaynaklı protokol değişiklikleri yapılması gerekebilir.- Hayvan sıçan (vücut ağırlığı 200-250 g) tedavisi ile 250 U/mL heparin mayi enjeksiyon yolu ile 0.5 mL ile anestezi. 10 dakika bekleyin, sonra fareyi Fentobarbital (210 mg/kg vücut ağırlığı) mayi enjeksiyonu ile tedavi.
- Anestezi uygun bir ölçüde ayak çimdik refleks sınayarak doğrulayın.
- Hayvan tarafından servikal çıkığı ötenazi.
- Hasat için daha önce yayımlanmış Jüpiter makaleler benzer diseksiyon yordamları kullanarak kalp22,23, sonra yer o buz gibi salin.
- Artan aort yalıtmak ve cannulate. Kanül ucu nereye koroner arterler şube sadece yarı ay kapak üzerinde oturur emin olun. Bir iş parçacığı artan aort etrafında sıkıca bağla.
- Kanül ~ 70 cm (şekil 1) sisteminin Bankası yukarıda işletilen yerçekimi tahrik Langendorff cihazı bağlayın.
- Stopcock Langendorff sistemdeki Tyrode'nın çözüm 20 mM BDÖ (myosin inhibitörü) 2-3 dk da dahil olmak üzere, kalple sıvı twist.
- % 2 paraformaldehyde, % 2.5 oxazolidin ve 0.15 M sodyum cacodylate 10 dk 37 ° C'de % 0,2 Tannik asit sabitleştirici ile perfüzyon başlamak için stopcock çevir. Eğer başarılı olursa, kalp soluk kahverengi açmak ve sert ve yufka yürekli ol.
- Bir tıraş bıçağı kullanarak, sol ventrikül (lateral) ücretsiz duvar dokusu blok teşrih ve elde etmek doku boyutu yaklaşık3 1 mm engeller.
- Önceden soğutulmuş 20 mL mercek şişeleri, buz 2 h. için aynı sabitleştirici örneklerinde şişeleri mümkün olduğunca çok sayıda örnekleri depolamak ve örnekleri çözümde batık sağlamak mağaza.
Dikkat: Örnekleri kadar % 100 dehidratasyon adım aşağı sonra soğuk tutmak önemlidir.
- Daha fazla fiksasyon ve elektron mikroskopi için örnekleri boyama.
- 0.15 M sodyum cacodylate arabellekte bir cam kabı 100 mL dökün ve buz üzerinde serin.
- 0,08 gram potasyum ferrocyanide % 2 potasyum ferrocyanide de %2 Osmiyum tetroxide ve 0.15 M sodyum cacodylate içeren bir heavy metal leke çözüm yapmak eklenmesi ve ardından % 4 Osmiyum tetroxide ve 0,3 M sodyum cacodylate, eşit miktarda hazırlamak. Çözüm buz üzerinde serin.
- Dışarı sabitleştirici pipette ve şişeleri örneklerinde daldırın için yeterli soğuk 0.15 M sodyum cacodylate arabellek ile değiştirin. Şişeleri buz 5 min için yerleştirin.
- 2.2.3 aşırı sabitleştirici kaldırmak için 0.15 M sodyum cacodylate ile dört kez daha yineleyin.
Dikkat: küçük parçaları örnek alabilirsiniz ve elmas bıçak doku blok kesit sırasında berbat edebilir çünkü cam Pipetler kullanmayın. Buz üstünde tüm çözümler için örnek eklemeden önce önceden soğutmak önemlidir. Örnek (çok kısa süreler kısmi kapsama en fazla birkaç saniye süren kısa bir süre çözüm değişimleri sırasında tolere) her zaman çözüm tarafından kapalı kalır önemlidir. Yıkama veya çözümler yerine, yeni çözüm hızlı bir şekilde önceki çözüm çıkardıktan sonra ekleyin. Mercek şişeleri yıkar arasında buz üzerinde tutun. Not Bu adım değil duyarlı, doku blok zaman biraz daha uzun, gerekirse yıkanabilir. - Sodyum cacodylate arabellek buz gibi heavy metal leke çözüm ile değiştirin ve buza gecede saklayın. Ferrocyanide iyi şişeyi el sallayarak karışık sağlamak; çözüm siyah açmalısınız.
Dikkat: İş Osmiyum zehirli olduğu için bu adımı gerçekleştirirken duman Hood. - %4 sulu uranyl asetat (UA) hisse senedi çözüm (Tablo 1) hisse senedi UA çözüm eşit hacimli ve Çift Kişilik distile su kullanarak %2 oranında seyreltin ve buza sakin olun.
- Heavy metal leke buz soğutmalı 0.15 M sodyum cacodylate arabellek ile değiştirin ve buz üzerinde 5 min için kuluçkaya örnek izin.
- 2.2.7 dört kez daha herhangi bir aşırı ağır metal leke çözüm durulama buzda adımları yineleyin.
- Örnekleri dört kez, 2-dk bekle-nokta ile arasında arıtılmış suyla durulayın (çift distile yeterlidir).
- Arıtılmış su yerine buz gibi %2 60-120 dakika buz üzerinde UA ve izin örnek kuluçkaya.
- Etanol (örnekleri daldırın için yeterli) beş 20 mL mercek şişeleri dehidratasyon adımda kullanılan buz üstünde ne yapıyorsun? Artan oranlarda distile su etanol altı tüpleri var: % 20, % 50, % 70, % 90 ve % 100.
- Saf aseton etanol şişeleri ile birlikte buzda başka bir 20 mL mercek flakon ve serin dökün.
- Dört kez 2 dk bekleme süreleri ile arıtılmış su örneklerinde aşırı UA yıkamak için buza durulayın.
- Etanol örneklerinde kurutmak.
- Soğuk etanol serisi gittikçe örnek şişeyi çözümünüzde aşağıdaki gibi buza değiştirerek kurutmak: % 20 etanol için 10 dk; % 50 etanol 10 min için; % 70 etanol 10 min için; % 90 etanol 10 min için; o zaman iki kez 10 dk içinde % 100 etanol.
- Örnek oda sıcaklığına soğutmalı saf aseton ile son % 100 etanol değiştirerek geçiş ve 10 min için bir oda sıcaklığında laboratuvar bankta örnek şişe yerleştirin.
- Bir daha fazla 10 dk yıkama saf aseton observable şişeleri içinde olduğunu yoğunlaşma kaldırmak için oda sıcaklığında gerçekleştirin. Kuluçka sırasında aseton/reçine çözümler kadar olun.
- Şişeleri saf aseton 50: 50 saf aseton ve epoksi reçine (oranlarını epoksi reçine bileşenlerinin üretici tarafından belirtildiği gibi ile) değiştirin. Tüm bileşenler aynı toplu iş kullanın. Reçine kaplı örnek şişeleri gece bir rotor üzerinde bırakın.
- Reçine örnekleri katıştır.
- 50: 50 reçine % 75 reçine (% 25 aseton) ile değiştirin ve % 100 reçine için oda sıcaklığında 4 h daha fazla kuluçka/infiltrasyon ardından 3 h için kuluçkaya.
- % 100 reçine taze % 100 reçine ile değiştirin ve örnek şişeleri gecede reçine daha derin penetrasyon için doku örneği bırakın.
- Örnekleri şişeleri dışarı almak ve fırın uygun kaplarda yer onları ve düz bir Bankası var; Alüminyum veya gümüş folyo su bardağı pişirme bu amaç için örneğin kullanılabilir.
- (Deplasman örneklerin) önlemek için yavaşça dökün taze reçine (böylece örnekleri reçine katıştırma) örnekleri üzerinde ve reçine ve örnekleri bir fırın 48 h için 60 ° C'de polimerize.
- Reçine blok kesit görüntü hücreleri yeniden yönlendirebileceğiniz.
- 1 µm kalın test bölümleri hücre yönü24değerlendirmek için bir cam bıçak ile bir ultramicrotome kullanarak reçine bloklardan elde edilir.
- 20 için kalın test bölümleri leke % 1 toluen mavi ve % 1 boraks s.
- Kas hücre yönlendirme parlak alan mikroskop altında incelemek.
- Lekeli test bölümleri görüntülerden anlaşıldığı yönelim dayanarak, yeniden yönlendirebileceğiniz boyuna veya eğik odaklı ( şekil 2Abenzer) reçine onlar kesecek kesit (böylece hücreleri cam bıçak maruz sağlamak için blok benzer şekil 2B).
- Elektron tomografi kullanma görüntü doku bölümlerine.
- Yarı ince kesitler elde etmek (~ 300 nm) reoriented dokusunun bir elmas kullanarak blokları bıçak ve bölümler bakır Izgaralar25üzerine aktarın.
- % 2 UA ve Sato kurşun25kalın bölümlerle leke.
- Kolloidal altın parçacıkları bölümleri25her iki tarafında geçerlidir.
- Tek veya çift eksenli tilt dizi öngörülen görüntü kümesi + 70 °25° ve-70 ° edinin.
- But20 3D görüntü yığını (bir tek elektron tomografi bölüm 3D bilgi sağlar 2D görüntüleri bir dizi) yeniden oluşturmak için kullanın hücrenin. Bu yeniden oluşturulan yığın sonraki adımda parçalara.
3. Myofibrils ve mitokondri bölgeler EM 3D görüntü kümesinden segment
- "3dmod" but programını çalıştırın.
- 3dmod grafik kullanıcı arabiriminde ".rec" adresini girin veya 3D içeren ".mrc" dosyasını yeniden görüntü veri kümesi (2,7 adımda oluşturulan) hücre etiketli giriş kutusuna "görüntü dosya (lar):", ardından "OK" tuşuna basın.
- "Dosya" menüsü altında yeni modeli seçin, sonra "Modeli olarak kaydedin" kullanma uygun bir ad ile kaydedin... menü öğesi "Dosya" altında.
Not: "nesne" yapmak kesimli bileşenler topluluğu but bir nesne olabilir. Varsayılan olarak, yeni bir model numarası "1" ile yeni bir nesne içerir. - "Özel" menüsünün altında "Çizim araçları" seçin. Bu yeni bir araç çubuğu benzer şekil 3Aiçinde açılacaktır.
Not: Farklı organel sınırları çevresinde kontür oluşturmak için kullanılan çeşitli araçlar vardır. Bu araçları kullanma yolları hakkında daha fazla yardım but20 belgelerinde bulunabilir. - "Çizim araçları" menüsünde "Heykel" seçeneğini seçin ve görüntü penceresine fareyi hareket ettirmek yere; fare işaretçisini üzerinde ortalanmış dairesel bir kontur-ecek gözükmek.
- Farenizin orta düğmesiyle bir mitokondri (koyu bölgelerle demarcations şekil 3A' yeşil dağılımı satırlarla tarafından gösterildiği gibi görüntü dosyaları) üzerinde tutarak, daire dağılımı çevre ile sınırı şekle sürükleyin.
- Mitokondri sınırı şekillendirme işlemi tamamlandıktan sonra orta düğmesini bırakın ve her mitokondri veri için 3,6 adımı yineleyin. Her kontur olarak aynı nesnesi içinde yeni bir kontur but tarafından otomatik olarak tanınır.
- Altında "Düzenle | Nesne "menüsünde, yeni bir nesne oluşturmak için"Yeni"seçin. Bu otomatik olarak toplam nesne sayısı bir artırmasına ve bu sayı yeni nesneye atayın.
- 3,6 ve 3,7 segmentlere ayırmak ve myofibril kontür kaydetmek için adımları yineleyin.
- Hücre sınırını de segmentlere ayırmak için adım 3.6, gelir 3,8, adımları yineleyin.
- "Dosya" menüsü altında modeli dosyayı kaydedin.
- Şekil 4A-Cgösterildiği gibi ikili bir maskeye gruplandırma her nesne dönüştürmek için bir komut satırı penceresinde aşağıdaki komutları çalıştırın.
- "" Nesne"sayıyken elde edilebilir için nesne modeli imodextract nesne modelfile outputmodelfile" belirli bir nesneden ayıklayın.
- Bu nesne için bir maske oluşturun: imodmop-maske 255 outputmodelfile ImageFile outputmask.mrc
- Dosyayı bir TIF yığına dönüştürmek: mrc2tif -s outputmask.mrc outputmask.tif
4. kesimli bileşenlerinden bir Sonlu elemanlar ağ oluşturma
- Iso2mesh TIFF görüntü yığınları hacimsel Dörtyüzlü Sonlu elemanlar kafesler dönüştürmek için serbestçe kullanılabilir bir MATLAB programdır. Download ve iso2mesh iso2mesh.sourceforge.net MATLAB yolunu ekleyin.
- Download kaynak şifre ve github Web sitesi https://github.com/CellSMB/RyR-simulator üzerinden mesh RyR kümelerde benzetimini yapmak için veri.
- CardiacCellMeshGenerator MATLAB uygulaması (şekil 5) başlatın.
- Farklı organel bileşen maskeleri MATLAB GUI sol üst tarafında üç Basma düğmelerini kullanarak yükleyin.
- Myofibrils ve şekil 6Aiçinde gösterildiği gibi mitokondri arasındaki boşlukları demarcates başka bir ikili görüntü yığını oluşturun.
- ImageJ açın.
- Dosyayı kullanarak | İletişim kutusunu açın, myofibrils ve mitokondri TIFF yığın programa yük.
- Resim ek plugin seçerek başlatmak "süreci | Hesap Makinesi Plus ".
- Myofibril görüntü yığını i1 seçin, mitokondri yığını olarak I2 görüntü ve "Ekle" işleci seçin. "Tamam" düğmesini tıklatın.
- 4.5.4 sonucunu temsil eden yeni bir görüntü yığını görüntülendikten sonra seçin "Düzenle | Görüntü yığını benzer şekil 6Aiçin üretmek için ters çevir'i ".
- CardiacCellMeshGenerator programı "RyRGapsFile" düğmesine basarak myofibrils ve mitokondri arasındaki boşluklar ikili resim yığını içeren dosya yükleyin.
- "Kafes oluşturmak" GUI üzerinde itin. Bu iso2mesh komut v2m Dörtyüzlü kafes şekil 4Eiçin benzer oluşturmak için 'cgalmesh' seçeneği ile tetikler. Üç dosyaları çıktı bu adımın sonundaki olacak: bir .ele dosyası, bir kilometrenin dosya ve elemanları, yüzleri olun düğümleri makyaj düğümlerin listesi ve düğümleri koordinatlarını içerir bir .node dosya , sırasıyla.
5. matematiksel olarak dağınık şekilde değişen yoğunluğu iyon-kanal Sonlu elemanlar Mesh üzerine ilgi göster.
-
GUI oluşturmak RyR-Simulator girişleri etiketli düğmeye basarak RyR-Simulator için gerekli girişleri oluşturur.
Not: Düğme-ecek tetik girdileri oluşturmak için adım 4 aşağıdaki bilgileri kullanan bir işlev generateRyRsimulatorInputs.m:
(1) outDir: RyR küme simülasyon için gerekli olan çıkış dosyalarının konumuna.
(2) imres: görüntü yığınları üç yöne pixel kararlılık.
(3) myofibril_file: 4B rakamgösterilen gibi ikili görüntü yığını içeren dosya.
(4) sarcolemma_file: 4A rakamgösterilen gibi ikili görüntü yığını içeren dosya.
(5) ryrgaps_file: 5A rakamgösterilen gibi ikili görüntü yığını içeren dosya.- Bu işlev'nı çalıştırdıktan sonra aşağıdaki dosyaları outDir yolu olarak belirtilen dizin içinde oluşturulmuş olduğunu kontrol edin:
- d_axial_micron.txt, z-disk konumunu piksel Görüntü yığınında geri kalanı arasındaki Aksiyel uzaklığı temsil eden.
- d_radial_micron.txt, z-disk uçakta piksele dizi mümkün RyR küme kümedeki her pikseli rasgele üzerinden (Aksiyel bileşen hariç) Öklid uzaklığı temsil eden.
- W_micron.txt, RyR bulunması için kümeleri için hangi uzamsal koordinatları kullanılabilir pozisyonların listesini temsil eder.
- Kalan 3 eğe içinde belgili tanımlık ağıl bu dosyaları değerlerinin piksel koordinat formunda yazılmış olduğunu belirtmek için "_micron" yerine "_pixel" son eki içerir.
-
RyR küme myofibrils ikili görüntü yığınını dağıtımlarında simülasyonu.
- "Açık RyR-simülatörde R" etiketli düğmeye R programını başlatmak için.
- R-GUI üzerinde seçin "dosya | Açık"ve bulmak belgili tanımlık eğe"koyma. R"içinde RyR-Simulator paketi (RyR-simülatörü/kaynak/ayarlar. R).
- Ayrıca ryr simülatörü-paralel dosya açın. R (RyR-simülatörü/kaynak/ryr-simulator-paralel olarak yer alır. R). Rstudio (https://www.rstudio.com) veya düz bir komut satırı arabirimi kullanılabilir gibi ortamlar, bir kabuk veya komut penceresinde R64 komutunu kullanarak örneğin .
- Parametreleri ayarları değiştirin. R dosya aşağıdaki açıklandığı gibi:
- Yol2 5.1.2 RyR kümeleri ile myofibrils deneysel olarak alınan confocal görüntü yığını için listelenen dosyaları içeren klasör adresi ayarlayın.
Not: Github depo klasörü giriş dosyalarını/ana-hücreli / zaten önceden toplanan görüntü yığını için oluşturulan dosyaları içerir. - Path4 5.1.2 adımda oluşturulan dosyaların depolandığı klasörü adres olarak ayarlayın.
- Path3 noktası nerede simüle RyR küme yerleri kaydedilmesi için kullanıcının istediği bir klasör oluşturun.
- N kümesine (genellikle, 200-300 aralığı) modelindeki benzetimi için RyR küme sayısı.
- Etol, ayarı, RyR kümeleri deneysel olarak ölçülen kayma dağılımını ve modeli simule kayma dağıtım RyR kümeleri arasındaki fark için bir tolerans ayarlayın.
- NumIter RyR-Simulator etol değer tatmin simüle bir RyR küme model bulmak için gerçekleştirmeniz gereken girişimleri sayısını sınırlamak için ayarlayın.
Not: Etol ve numIter değerleri ayarlar içinde normal değerlere ayarlayın. R dosya. - Kullanıcının benzetimini yapmak istediği farklı RyR küme desen sayısını ayarla numPatterns (tipik olarak, istatistiksel güven için 99 modelleri simüle yararlı bir uygulamadır).
- NumCores daha hızlı paralel nokta desenler benzetimini yapmak için R ile işleme için çeşitli CPU konuları (çekirdek) kullanımını etkinleştirmek için ayarlayın.
- Yol2 5.1.2 RyR kümeleri ile myofibrils deneysel olarak alınan confocal görüntü yığını için listelenen dosyaları içeren klasör adresi ayarlayın.
- Aşağıdaki paketleri Paket Yükleyicisi kullanılarak yüklenir kontrol GUI R: kar, doSNOW, doparallel, foreach, yineleyiciler ve rgl.
- R komut penceresinde aşağıdaki komutu girerek simülatör yürütmek: kaynak (' yolunu ryr-simulator-paralel. R', chdir = TRUE)
Not: RyR-Simulator programı çıkışını N satırlardaki koordinat listeleri içeren (bir numPatterns dosyası oluşturulur) .txt dosyaları listesi ve x, y ve z koordinatları n temsil eden 3 sütun RyR kümeleri simüle.
-
Puan CardiacCellMeshGenerator kullanarak Hesaplamalı modeli üzerine mekansal yoğunlukları olarak eşleyin.
- Etiketli düğmesini seçerek "RyR Puan dosya seçin", çıkış RyR-Simulator tarafından oluşturulmuş bir simüle RyR küme dağıtım metin dosyası seçin.
- "RyR yoğunluğu Eşleştiricisi" MATLAB GUI yürütmek. Bu adım 5.3.1 bir küresel çekirdek yoğunluğu Tahmincisi yöntemi26olarak adlandırılan bir yöntemi kullanarak 4,8 adımda oluşturulan Sonlu elemanlar mesh üzerine .txt dosyasında simüle RyR kümelerde mekansal konumlarını eşler.
Not: Bu adımı çıktısı iyon-kanal başına birim küresel hacmi hesaplama kafes düğümlerin her birinde, sayısal yoğunluğu için bir değerler listesi içeren .txt uzantılı bir dosyadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 2 . Şekil 7 ile temsilcisi bu protokolündeki birkaç anahtar adımların sonuçlarını sağlar: (i) görüntülenmesi ve doku blok kesitsel elektron mikroskobu görünümleri; reorienting (ii) 3D elektron mikroskobu görüntü yığını oluşturma; (iii) segmentlere alt hücresel ultrastructure organelleri ilgi için; (iv) iso2mesh kullanarak bir Sonlu elemanlar kafes üretimi; (v) mesh kümelerde RyR gerçekçi bir dağıtım simulasyonu; (vi) hesaplama kafes olarak mekansal Yoğunluk kayma bu dağıtım eşleyerek takip ettim.
Şekil 2 boyuna yönelik hücreler nasıl görünür Haritayı tipik parlak alan görüntüleri görüntüler (L etiketlişekil 2A,), eğik (şekil 2A,) O etiketli ve cross-sectionally (şekil 2B) ile mineral için kesme düzleminin. Cross-sectionally yönelik örnekleri yiv izleri gösteren değil iken eğik ve boyuna yönelik örnekleri yivler, sergi. Kılcal da daha dairesel eğik görünümler kesitsel görünümlerinde görünür.
Şekil 3A zaman doku hazırlık Protokolü 1. adımda takip elde edilebilir bir kaliteli tomogram yığın temsilcisi bir görüntüsünü gösterir. 3D imar mikroskop görüntü tilt serisinden gerçekleştirirken özen göstermelidir. Kolloidal altın parçacıklarının yanlış izleme veya yeterli altın parçacıkları eksikliği kalite etkileyebilir — görüntü kontrast ve görüntü odak — tomogram, önemli ölçüde. Bu önemli ölçüde farklı yapıları segment yeteneğini etkiler. Bakım ve deneyim doku blok yeterince lekeli ve doku hacmi ile Kolloidal altın parçacıkları eşit dağılımı olduğunu emin olmak gereklidir. Şüpheniz varsa, bir uzman laboratuvar veya yerel kurum tesisinde danışmak yararlı olabilir. Model oluşturma ile düşük kontrast denenir veya hatalı veri yeniden modelleri hala oluşturulabilir ancak sonuçları benzetimi için biyolojik sistemlerin özellikleri ile modelleme yazışma düşük olabilir. Şekil 3B myofibrils ve mitokondri kesimli bir model gibi görünüyor bir temsili resim gösterir.
Şekil 4E iso2mesh tarafından üretilen Dörtyüzlü mesh 3B oluşturmayı gösterir. Orijinal görüntü yığını ve bölümleme görevleri iyi bir kaliteye sahip olduğu sürece, bu adımı oldukça sağlamdır. Şekil 6B ve şekil 6C bir tipik RyR küme dağıtım (kırmızı) 3D hücresel topolojisi içinde gösterir. Bu aşamada, kafes kendisini RyR simülatörde giriş değil. Görüntü yığını hücre sınırını ve myofibrils ve mitokondri arasındaki boşluklar — şekil 4 kesimli Albümdeki üretilen — RyR simülatörü büyük girişleri oluşturur. Olabildiğince doğru bir biçimde myofibrils ve mitokondri sınırlarını segmentlere ayırmak için bakım alınması gerekir; yanlış segmentations sonuç olarak kafes içinde RyR bulma etkiler verileri hücre topolojisinde, yanlış bir temsilidir neden olur. Bu daha sonra cardiomyocyte (uygulama 1) sinyal kalsiyum spatio-zamansal dinamiği etkileyebilir.
Şekil 7 küresel çekirdek yoğunluğu Tahmincisi algoritması kullandıktan sonra 3 simüle RyR kümeleri aynı örneğini topoloji mesh gösterir. RyR kümeleri organizasyonu varyasyon dikkat edin. Bu varyasyonlar olmak içinde deneysel veriler18bulundu değişkenlik içinde ölçülen var. Çekirdek küre yarıçapı ve üzerinde RyR küme yoğunluğu çekirdek örnekleri adım boyu seçiminde özen göstermelidir. Bu iki faktör nasıl keskin etkilemediği gibi diffüz RyR kümeleri yoğunluğu bir gösterimini mesh tasvir edilebilir. Bu parametreler için farklı değerler etkisini analiz makul bir kafes için parametre seçenekleri daraltmak için yardımcı olacaktır.
RyR kümeleri, myofibrils ve mitokondri elde edilen mesh cardiomyocyte yapısı en az bir modeldir. Bu kafes, bu kalsiyum dinamikleri ve bioenergetics çalışmaya diğer hücresel yapısı verilerinden elde edilmiştir varyasyonları yanı sıra uygulanmıştır. Bu iki uygulama genel bakış altında hücre yapısının yapı-fonksiyon ilişkileri üzerinde anlayışlar vermekte Sonlu elemanlar modelleme gücünü göstermek için gösterilmiştir.
Uygulama 1 18 : Kronolojik zamanmekansal dynamics kalsiyum cardiomyocytes yayın. Bu model RyR kümeleri, myofibrils ve kalsiyum sinyal üzerinde mitokondri türdeş olmayan dağıtım rolünü incelemek için kullanılmıştır. Şekil 8 geçici bu protokolü oluşturulan ağ topolojisi üzerinde simüle yükselen aşamasında sitozolik kalsiyum kronolojik zamanmekansal dinamikleri gösterir. Resim 8B türdeş olmayan ücretsiz kalsiyum ve zaman içinde fluorophore-bağlı-kalsiyum konsantrasyonu gösterir. Okları RyR kümeleri veya mitokondri bu bölgelerde daha yüksek bir yoğunluk nedeniyle yüksek kalsiyum küçük noktalar üzerine gelin. Şekil 8 c genellikle canlı confocal mikroskobu kullanılarak toplanan kalsiyum dynamics deneysel satır taramalı görüntülere karşılaştırılabilir simüle satır taramalı görüntüleri gösterir. Modeli simülasyon bir çok daha yüksek çözünürlük görünümünü kalsiyum kayma heterojen deneysel olarak alınan bir görüntü sağlar. Heterogeneities confocal satır taramalı görüntüde gerçekleşmesi için elektrik harekete geçirmek tam olarak tespit sonra Ayrıca, yapısal mikroskobu verilerden elde edilen modeli nedeniyle, kalmalıdır küme sayısı (~ 4-6) inaktive olur. Benzer heterogeneities deneysel olarak alınan satır Taramalı görüntüler kalsiyum dinamikleri kalp yetmezliği18 hayvan modellerinde gözlenir
Uygulama 2 27 : Kronolojik zamanmekansal mitokondriyal bioenergetics cardiomyocytes dinamiği. Bir şemsiye Bu çalışmanın amacı, kalsiyum dinamikleri, mitokondriyal bioenergetics ve kas kasılması arasındaki ilişkiyi incelemektir. İlk adım olarak, mitokondriyal oksidatif fosforilasyon izolasyon cardiomyocyte içinde simülasyonlar yapılmıştır. Bu nedenle, RyR kümeleri dağıtım gerekli değildir ve bir sade bir şekilde adım 3.4 mesh kullanabilirsiniz. Daha karmaşık bir uygulama bioenergetics (uygulama 2) kalsiyum dinamiklerini (uygulama 1) mesh ve modeli inşaat, Yani mitokondri, myofibrils ve ryanodine olarak kabul tüm bileşenleri kullanan bir model ile birleştiğinde reseptörleri.
Şekil 9 adım 3.4 kullanılarak oluşturulan bir kafes farklı bölgeler üzerinde bu kayma metabolizma simülasyondan sonuçları temsil eder. Şekil 9B ADP konsantrasyonu hücre myofibril bölmesi yalnızca gösterirken Þekil 9A oksijen konsantrasyonu hücre kesiti boyunca gösteriyor. Şekil 9C mitokondri zar potansiyel dağılımı mitokondrial ağ üzerinden gösterilmektedir. Bu rakamlar mitokondri ve myofibrils hücre kesit içinde olmayan tekdüze dağıtımını ortaya koyuyor. Aynı zamanda bu üniform olmayan ultrastructure kaynaklanan inhomogeneous metabolik manzara ortaya koyuyor. Bu güç mikroskobu veri yoksa deneysel yöntemlerle elde etmek zordur yapı-fonksiyon ilişkileri anlayışlar vermek için Sonlu elemanlar simülasyonlar dayalı gösterir.
Şekil 1: kalp Langendorff hazırlanması için kimyasal fiksasyonu. (A)şeması Langendorff perfüzyon cihaz. Stopcock Tyrode'nın arasında geçiş yapmak için bir vana içerir ve sabitleştirici çözümleri. Kabı üssünde kalbinden sıvı çözümleri yakalamak için kullanılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: hücre yönlendirme parlak alan mikroskobu altında inceleniyor. Kalp doku boyuna odaklı (L) ve görüntüleme uçak; ile ilgili olarak konuşabilerek odaklı (O) olan hücreleri gösteren toluen mavi kalın lekeli bölümünün(a)parlak alan görünüm Yivler boyuna odaklı hücresinde, örneğin unutmayın. (B) parlak alan görünümü görüntüleme uçak ile uyumlu cep enine, kesiti olan doku bölümü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: elektron mikroskobu veri bölümleme. (A)anlık görüntüsünü el ile ayrılmasını heykel aracını kullanarak mitokondri. (B) A 3D görüş-in tam el ile mitokondri, myofibrils (içinde çeşitli renkler) ve sarcolemma (pembe) olarak bölümlenmiş. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ikili görüntü yığınları 3D Dörtyüzlü kafes dönüştürme. (A-C) İkili maskeleri, sarcolemma, myofibrils ve mitokondri, anılan sıraya göre. (D) birleştirilmiş bir mitokondri (içinde yeşil) ve myofibrils (kırmızılı) ikili maskesiyle görüntüleyin. İso2mesh kullanarak görüntü yığınında (D) oluşturulan (E) temsilcisi Dörtyüzlü kafes. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: CardiacCellMeshGenerator. Bu iletişim kuralı yayın 4 ve 5 numaralı adımları gerçekleştirmek kullanıcılar için eşlik eden grafik kullanıcı arabirimi bir ekran görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: gerçekçi bir RyR küme dağıtım kardiyak ultrastructure kesimli elektron mikroskobu görüntü yığını üzerine simüle. (A) A ikili görüntü yığını. myofibrils ve RyR kümeleri bulunduğu tüm pikseller dizi temsil mitokondri arasındaki boşluklar tasvir (B) bir 3D render (İmaj Ölçekle çizilmiş değil) simüle RyR birini küme (kırmızı küre gösterilen) dağıtımları içinde 3D Görüntü yığınında; tasvir 3B geometrisinin Yeşil yüzeyler mitokondri görüntü yığını içinde temsil eder. (C) A yüksek-(böylece küçük bir kısmını kesip hücre kesit dışına sınırları) büyütme RyR yerleşimi görünümünü kümeleri adım 4 ve adım 3 3D elektron tomografi görüntü yığını bir dilim üzerine Hesaplamalı kafes. (B) ve (C) Rajagopal ve arkdeğiştirildi. 18 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7: kayma sayısal yoğunluğu 3-RyR kümelerinin dağıtımını RyR küme modelleri simüle. Tüm ağ düğümleri için sayısal yoğunluğu 0.0 RyR kümeleri/µm3 beyazdan için kırmızı bir maksimum sayısal yoğunluğu 0,99 RyR kümeleri/µm3için Renk kodlarına sahiptir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8: Kayma heterojenite [Ca2 +]i Ca2 + geçici yükselen aşamasında içinde. (A) ortalama serbestçe (solda) [Ca2 +]ben ve Fluo-4 Difüzyon sitozolik bağlı Ca2 +, [F4Ca]ben (sağda). (B) ve (Cserbestçe Ca2 + ve F4Ca z-disk enine uçak; Difüzyon hızlandırılmış anlık görüntüleri göster) siyah okları mitokondrial kümeleme nedeniyle yüksek [Ca2 +]ben bölgelerinde mark; Kırmızı oklar yakın bölgelerinde yüksek [Ca2 +]i birkaç RyR kümeleri nedeniyle işaretleyin. [Ca2 +]ben (orta) [F4Ca]ben (sağda), (C) sanal çizgi tarar. Satır konumu hücre kesit solda gösterilir. Hücre kesit yatay boyut kesit görüntü kayma ölçeğinde bir göstergesi olarak sağlanmıştır. Bu rakam Rajagopal ve arkdeğiştirildi. 18 Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9: kardiyak enerji metabolizmasının simülasyon kayma oluşturulan kayma metabolitleri ve dağıtımını mitokondri zar potansiyel. (A)birim hücre kesiti boyunca oksijen konsantrasyonu µM, (B) konsantrasyon ADP birimleriyle µM. hücrenin myofibril bölümünde yalnızca mitokondri zar mitokondri arasında potansiyel dağılımı (C) Ağ birimlerinde mV. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10: R-istatistik paket üzerinde simüle bir RyR küme noktası desen görselleştirme. Bu pencere ilk simüle noktası kalıplarının tasvir eden RyR kümeleri simülasyonları, sonuç olarak görüntülenir. Bu RyR-simülatörü de sahip olduğu ve simüle desenleri kalitesini sorguya bir göstergesi olarak kullanılabilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Kimyasallar | Miktarları |
| 0,2 N HCl | |
| 1 N HCl | 5 mL |
| Distile su | 20 mL |
| 0.15 M sodyum cacodylate arabellek hisse senedi | |
| Sodyum cacodylate | 32,1 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Distile su ile 1 L kadar yapmak | |
| pH 7.4 | |
| 0.3 M sodyum cacodylate arabellek hisse senedi | |
| Sodyum cacodylate | 64.2 g [3H2O] |
| 0,2 N HCl | 25 mL |
| Distile su ile 1 L kadar yapmak | |
| pH 7.4 | |
| Tyrode çözüm kompozisyon | |
| NaCl | 139 mM |
| KCl | 3 mM |
| CaCl2 | 3 mM |
| MgCl2 | 1 mM |
| Glikoz | 12 mM |
| NaHCO3 | 17 mM |
| Probenesid | 1 mM |
| BDÖ | 20 mM |
| NaCl/KCl/NaHCO3 1 L çözüm | |
| NaCl (molekül ağırlığı 58.44 g/mol) | 81,2 g |
| KCl (molekül ağırlığı 74.55 g/mol) | 2,24 g |
| NaHCO3 (moleküler ağırlık 84.01 g/mol) | 14.28 g |
| 1 L distile suda çözülür | |
| MgCl2/CaCl2 1 L çözüm | |
| CaCl2 (2H2O) (moleküler ağırlık 147 g/mol) | 1,764 g |
| MgCl2 (6H2O) (203.31 g/mol) | 0.814 g |
| 1 L distile suda çözülür | |
| 1 M glikoz 200 mL solüsyon | |
| Dekstroz (molekül ağırlığı 180.16 g/mol) | 36.03 g |
| 200 mL Çift Kişilik distile suda çözülür | |
| Tyrode çözüm 500 mL solüsyon | |
| NaCl/KCl/NaHCO3 | 50 mL |
| Glikoz | 6 mL |
| Çift Kişilik distile su | 400 mL |
| Kabarcık oksijen 5 min için çözüm | |
| % 2 PFA + % 2.5 oxazolidin %0,2 tanic asit sabitleştirici 0.15 M sodyum cacodylate | |
| Paraformaldehyde toz (PFA) | 2 g |
| TANİC asit | 0.2 g |
| Distile su | 20 mL |
| % 25 oxazolidin | 10 mL |
| 0.3 M sodyum cacodylate | 20 mL |
| 0.15 M sodyum cacodylate | 50 mL |
| 1 N NaOH | 4 g NaOH/100 mL distile su |
| %4 uranyl asetat hisse senedi çözüm | |
| Uranyl asetat | 4 g |
| Çift kaynama yakınındaki distile su | 96 mL |
| UA bir karıştırıcı bir fumehood kullanarak bioling yakınındaki suda çözülür. | |
| UA lamba koruma için 200 mL kahverengi şişe içine 1 Whatman filtreden filtre | |
| Sıkı cap ve etiket, 4 ° C'de depolayın | |
Tablo 1: Reaktifler ve elektron mikroskopi için doku hazırlık için miktarları.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Yukarıdaki Protokolü cardiomyocyte ultrastructure bir roman Sonlu elemanlar geometrik model oluşturmak için anahtar adımları özetliyor. Yöntem kayma hücre mimarisi ayrıntılarını içeren cardiomyocyte dynamics daha kapsamlı Hesaplamalı modeli geliştirmek Hesaplamalı füzyon farklı mikroskobu (veya, prensip olarak, diğer veri) yöntemleri sağlar. Şu anda diğer protokolü bir cardiomyocyte böyle bir model oluşturmak kullanılabilir.
1. adım bir protokol perfüzyon fiksasyon için özetliyor. Alternatif olarak, kalp olabilir eksize, küçük parçalar halinde disseke ve sabitleştirici dalmış. Ancak, bu işlem hızlı bir şekilde yapılması gerektiğini ve sonuçları, örnekleri büyüklüğüne bağlı olarak çeşitli var. Yazarın deneyimi, perfüzyon sabitleştirici ayrıntılı infiltrasyon doku ve hücre içine sağlar. Yazarlar ayrıca daha önce kalp kalp yapmak için Krebs-Henseliet solüsyonu ile periosteum ona daha önce fiksasyon. Bu ölçümler fiksasyon önce çalışma kalp üzerinde etkin.
Adım 2'deki elektron mikroskobu işleme adımları elektron tomografi için tipik örnekleridir. İşleme çözüm miktarları, özellikle boyama çözümleri ve zamanlara seri-blok-yüz elektron mikroskobu tarama veya iyon-ışını mikroskobu28odaklanmış gibi diğer görüntüleme teknikleri kullanırken farklı olabilir. Alınan elektron mikroskobu görüntüleri farklı organel bölgeleri, mitokondri, myofibrils ve transvers tübüllerin gibi parçalara gerekir. Bu el ile veya otomatikleştirilmiş bir yolla yapılabilir. Görüntü yığını içinde kontrast kısmen boyama Protokolü başarısına bağlıdır ama tomografi gerçekleştirirken bu kontrast bazıları kayıp. Otomatik bölümleme29 gerçekleştirmek için yeni yöntemler genellikle veri üretimini artırmak için daha uygun olacaktır, ancak bu protokolü farklı yapıları segmentlere için el ile gerçekleştirilecek adımlar açıklanır.
Elektron mikroskobu dataset içinde incelemek için en önemli nitelikleri görüntü kontrastı ve yapısını koruma vardır. Boyama tarifi ve karışımları bu protokol için gömme reçine myofibrils, mitokondri ve z-diskler kalp hücresi arasındaki yüksek karşıtlık için rafine edilmiştir. Örneğin, yazarlar daha önce Kalsiyum klorür Tannik asit yerine adım 1.2 sarcoplasmic Retiküler ağ ayırma için kullandık. Bu organel segmentleme sırasında myofibril demetleri dış sınırlarının belirlenmesi ile yardımcı oldu. Ek boyama kimyasal bileşenleri ve zamanları da membran yapılar, sarcoplasmic retikulum veya enine Aksiyel tübüllerin30gibi görüntülenmesi için kullanılabilir.
Görüntüleri de yapısal bozulma için muayene gerekir. Kalitesiz fiksasyon veya elektron mikroskobu işlem mitokondriyal cristae ciddi kaybı, yüksek oranda yerinden çıkar veya şişmiş mitokondri ve hücre zarı (sarcolemma) bölümlerini dağılması neden olabilir. Bir daha yakından ve dikkatli muayene de t-borulu kaybı gösterebilir ve SR membranlar, ama are eğitimsiz bir göze daha az belirgin. Bu sorunu için çözümler içerir: (i) ayrıntılı perfüzyon; sağlanması (ii) doku aynı zamanda sabitleştirici ve lekelerin derin penetrasyon sağlamak küçük örnekleri dissekan; (iii) elektron mikroskobu işleme soğuk çözümler veya buz üzerinde belirtilen her yerde yapıldığını sağlanması; ve (iv) Boyama ve dehidrasyon (su kaybı özellikle) zamanlamalarını kesinlikle takip.
Tipik bir cardiomyocyte ~ 20 µm Kesitin çapı ve uzunluğu ~ 100 µm. Bu görüntüleme tüm kalp hücreleri önemli bir meydan okuma yapar. Ayrıca, kas lifleri kalp31 daha fazla içinde değişen yönünü olan eksen bir hücre ilgi enine ve boyuna balta ile uyumlu bir görüntü birimi edinimi olmak zordur. But gibi görüntü analiz programları verileri sentetik yeniden uyum istenen bir yönelim içine etkinleştirin. Seri blok-yüz tarama elektron mikroskobu28 ve ilişkili görüntü işleme algoritmaları29 da son gelişmeler bu sorunları gidermek yardımcı. Yine de, hafif bir mikroskop altında kalın bölümlerin dikkatli muayene ve sonraki yeniden yönlendirmesini blok (Adım 2.5) boyuna ve enine eksenleri görüntüleme ile makul hizalamasını içeren hücreleri görüntüleme olasılığı artacaktır Eksen. Bu en hücre biriminin görüş alanı içinde yakalanan sağlayacaktır.
İletişim kuralı adım 3, 4 ve 5 yüklemeye Malzemeler tablo listelenen yazılımlar gerektirir. BUT, R-istatistik paket, iso2mesh ve FiJi (bir sürüm ImageJ mikroskobu veriler için) geniş dokümantasyon ve öğreticiler nasıl kullanılacaklarını var. CardiacCellMeshGenerator model basit bir iş akışı oluşturmak kullanıcı kolaylaştırmak için geliştirilen bir MATLAB uygulamasıdır. Kullanıcı-ebilmek download tüm kaynak kod ve uygulama paketi github RyR-simülatörü depo bağlantı (https://github.com/CellSMB/RyR-simulator/tree/JoVE). Uygulama, CardiacCellMeshGenerator.miappinstall, MATLAB'de bir uygulaması yüklenebilir. İçin RyR-küme simülatörü RyR-simülatörü/giriş-dosyalarını/ana-hücre içinde bulunabilir bu protokol için oluşturulan kafes için giriş RyR-simülatörü/giriş-dosyaları/hedef-tomo-hücre içindeki / ek giriş sırasında bulunabilir /. Belgili tanımlık app işlemini başlatmadan önce kullanıcılar yüklü iso2mesh klasörü ve onun alt klasörleri MATLAB yolunu eklenmiştir emin olun. Benzer şekilde, küme simülatörü için R-paketleri gerekli (Tablo reçetesi) da R. içinde kurulmuş olduğundan emin olun
Bir ilerleme çubuğu mesh, RyR küme simülatörü için girişleri oluştururken oluştururken ve RyR küme yoğunlukları RyR yoğunluğu Eşleştiricisi kullanarak ağ üzerinde eşlerken app dahil etmiştir; kafes üretimi adım sahip olduğu zaman app GUI 3B Kafes hale getirecek. RyR küme simülasyonlar R kullanıcı arabiriminde tamamladıktan sonra grafik bir pencere-ecek gözükmek (şekil 10), bir benzetim yapılmış 3D RyR küme noktası desen tasvir.
GUI "Mesh oluştur" butonuna Dörtyüzlü bir kafes oluşturmak için iso2mesh işlev tetikler. Modeli çözünürlüğü en fazla Dörtyüzlü öğe hacmi ve Kenar uzaklığını ayarlamak GUI "iso2mesh parametreleri" ayarlayarak ayarlanabilir. Program şu anda myofibril bölge ve mitokondri bölgeleri oluşturan öğeleri ayırt eder; Bu özellik gelecekte hücrenin diğer bileşenlerinin dahil etmek için genişletilir.
Kullanıcı-ebilmek kullanma 3D render mesh ile RyR kümeleri aşağıdaki adımları ile ilgili sorunları giderme. RyR küme simülasyon ayarlarını, etol ve ayarları içinde numIter. R RyR küme simülasyonlar doğruluğunu etkiler; Ne zaman bir RyR küme desen simülasyon sona erer bu iki parametre belirlemek. Bu parametreler üzerine muayene R pencere (şekil 10) RyR kümelerde dağılımı sağlamak için ayarlanabilir: (i) z-diskler; yakın tüm kümeleri olan ve (ii) kümeleri yaymak genelinde herhangi bir bölgede toplayarak yerine tüm kesit. Etol ve numIter uygun bir kombinasyonunu belirlemek için bu iki parametre için simülasyonlar geçici duyarlılık analizi yapılabilir.
Küresel çekirdek yoğunluğu Tahmincisi adım 5'te seçilen çapı bir küre faiz (Bu bağlamda 3D kayma modeli) hacmi üzerinden geçirilen bir çekirdek olarak kullanır. Bu parametreler için bu şekil 5GUI'SİNDE algoritmasına yumuşatma ayarlanabilir: (1) r_sphere küresel çekirdek düzgünleştirme; yarıçapı tanımlar (2) hval üzerinde küresel çekirdek yinelenen birim gönderilmesi gereken yinelemeli kayma adım boyutunu tanımlar.
Şekil 7' de gösterildiği gibi RyR küme yoğunluk değerleri dağıtımını denetlemek için mekansal yoğunluk parametrelerini yeterli olup olmadığını belirlemek için basit bir yaklaşım olacaktır. Yüksek yoğunluk değerlerini mahalle mikroskobu veri bulunan bir RyR kümesi boyutunu benzer bir boyuta öyle ki yoğunluk değerlerini dağıtılmış.
Geçerli protokol yalnızca gerçekçi dağıtım myofibrils, mitokondri ve RyR kümeleri içeren bir Sonlu elemanlar modeli üretir. Bu adımı uzantısı sarco endoplasmic Retiküler kalsiyum Pompalar (SERCA2a), sodyum kalsiyum değiştiriciler (NCX) ve sarcolemmal kalsiyum pompaları gibi ECC içinde bir rol oynayan diğer iyon kanalları dağıtımını benzetimini yapmak için olurdu. Bu uzantılar iyon kanalları ayirt verilerden kayma dağılımını bir analizini anahtarıdır. Örneğin, NCX kanalları aynı şekilde 0.67 µm ortalama bir aralığını, t-tüp membranlar üzerinde dağıtılmak üzere ölçülen var ama RyR kümeleri ile ilişkilerini çok açık32değil. Öte yandan, SERCA2a hedefleme antikorlar daha önce SR33işaretlemek için kullanılan, ama SERCA2a mekansal yoğunluk literatürde rapor değil. Bu nedenle, bu aşamada, tekdüze dağılım SERCA 2A SR ağ üzerinden ve NCX t-tübüllerin üzerinde dikkatli bir şekilde kabul edilebilir.
Temsilcisi sonuçlarında gösterildiği sonuç Sonlu elemanlar mesh ile Sonlu elemanlar çözerler34 18 ve bioenergetics27 tepki-Difüzyon olarak sinyal kalsiyum gibi biyokimyasal süreçler benzetimini yapmak için kullanılabilir işler. Bu amaçla, iyon kanalları tepki siteleri, ağ topolojisi içinde düğümleri olarak temsil edilir. Reaksiyon siteleri kaynakları veya lavabo hücrenin farklı bölmeleri kimyasal türler Bu iyon kanalları üzerinden akışını temsil etmek için farklı kimyasal türler olarak hareket ederler. Yazılım bu metin dosyalarını tanıması için özelliğine sahip olması koşuluyla çıkış mesh ve RyR yoğunluğu eğe--dan bu iletişim kuralı ile herhangi bir diğer integral alıcı veya herhangi bir diğer ortamında kullanılabilir. Metin dosyaları aynı zamanda komut dosyaları veya seçim ortamının giriş dosyası biçim gereksinimleri karşılamak için üçüncü taraf yazılım tarafından manipüle edilebilir. Kalsiyum dinamikleri üzerinde ilk uygulama, yalnızca bu model için kalsiyum upstroke yarar gösterir ama bu mesh uzun zaman ölçekler için kullanılamaz olduğunu göstermez. Mesh ve küme yoğunlukları homeostazı ve istikrar kullanılır Sonlu elemanlar çözücü yalnızca bağımlı bakım ile birden fazla kalsiyum devir taklit etmek için kullanılabilir.
Bu boru hattının cardiomyocytes ve diğer hücre tipleri yapısal olarak doğru Sonlu elemanlar modelleri oluşturmayı kolaylaştırmak için bina modeli geliştirmek için uzun vadeli bir amaçtır. Bir otomatik bölümleme algoritma son zamanlarda, seri-blok-yüz tarama elektron mikroskobu verisinin cardiomyocytes ile en az kullanıcı tüm hücre myofibrils ve mitokondri dağıtım bir model oluşturmak için uygulanabileceği geliştirilmiştir giriş29. Bu yöntem t tübül ve SR membran ağları gelecekte segmentlere ayırmak için genişletilir. Kullanıcı-e doğru çözümlemek ve iyon-kanal ve organelleri arasında yanı sıra yüksek üretilen iş moda farklı iyon-kanal türleri arasında ortak Mekanlar taklit sağlayacak RyR-simülatörü algoritma daha genel bir sürümü de geliştirilmekte olan. Hücre tam bir model oluşturma için kesintisiz bir iletişim kuralı modeli tabanlı Hipotez testleri hücre yapısı ve hücre işlevi daha fazla arasındaki ilişki üzerine düzenli olarak deneysel yaklaşımlar ile şu anda mümkün olduğundan daha gerçekleştirmek bilim adamları sağlayacak Yalnız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar onlar rakip hiçbir mali çıkarları var bildirin.
Acknowledgments
Bu eser Royal Society, Yeni Zelanda Marsden hızlı başlamak Grant 11-UOA-184, insan sınır bilim programı araştırma bursu RGP0027/2013 ve Avustralya Araştırma Konseyi keşif proje Grant DP170101358 tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | 746398 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | C8106 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2393 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P5405 | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S8045 | |
| Probenecid | Sigma-Aldrich | P8761 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich | B0753 | |
| 25% Glutaraldehyde EM Grade (500 ml bottle) | Merck | 354400-500ML | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| Tannic Acid | Sigma-Aldrich | 403040-500G | 100g EM grade |
| Sodium cacodylate | Sigma-Aldrich | C0250 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4593 | |
| Osmium Tetroxide | Sigma-Aldrich | 75632-10ML | 4% in water, 5 ml bottle (or 10 ml bottle also available) |
| Uranyl Acetate | EM Sciences | 22400 | 25g bottle |
| Potassium Ferrocyanide | Merck Millipore | 104973 | |
| Toluene blue | Sigma-Aldrich | T3260 | |
| Borax | Sigma-Aldrich | S9640 | also termed sodium borate |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | 792780 | Diluted to different percentages with pure water |
| Acetone | EM Sciences | RT10017 | |
| Resin kit | EM Sciences | 14040 | ACM Durcupan works well |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H9892 | 1Normal solution |
| Equipment | |||
| Ultramicrotome | Leica | EM UC7 | |
| Transmission electron microscope | ThermoFisher Scientific | Tecnai F30 | http://www.leica-microsystems.com/ |
| Retort stand | Proscitech | T752 | |
| Tubing | BioStrategy | 75831-346 | for langendorff perfusion apparatus, 3 mm diameter is recommended but not essential |
| Stopcocks | SDR | QP13813 | for langendorff tubing; product is only an example, user can select any |
| retort stand clamps | Proscitech | T715 | |
| Plastic syringes | SDR | QPC1108 | for solutions on langendorff apparatus |
| Cannulation silk suture, 7-0 | TeleFlex | 15B051000 | for tieing heart on langedorff apparatus |
| Cannula | Made from 3 mm outer-diameter steel needle | ||
| Rubber petri dish mat | Proscitech | H068 | for use as cutting board during fixed-heart dissection |
| Razor blades | Proscitech | L056 | for cutting fixed-heart into small blocks for EM processing |
| Glass bottles | BioStrategy | 89000-236 | for storing solutions during tissue fixation and processing for EM |
| Beakers | BioStrategy | 213-0477 | for storing solutions temporarily and during perfusion |
| Scintillation vials | BioStrategy | 548-2170 | for tissue samples during EM processing |
| Dissection kit | Proscitech | T161 | for animal dissection |
| Syringe Filters | Proscitech | WS3-02225S | for purification of Uranyl Acetate |
| Aluminium/silver foil baking cups | From any baking products store | ||
| Dupont Diamond knife | BioStrategy | 102680-780 | 35 degree angle version produces best sections. |
| Colloidal Gold | BBI Solutions | EM. GC15 | 15 nm colloidal gold |
| EM mesh grids | Proscitech | GCU150 | a variety of sizes can be tested: GCU150h, GCU200h for example |
| Plastic disposal pippettes | Proscitech | LCH20 | best to use plastic disposables especially when working with resin |
| Software | |||
| SerialEM | University of Boulder | tomography acquisition | |
| MATLAB | MathWorks | https://www.mathworks.com/products/matlab.html | |
| IMOD | University of Boulder | image alignment and segmentation | |
| iso2mesh | available at http://iso2mesh.sourceforge.net | ||
| Fiji or similar image processing software | ImageJ | Fiji is Just Image J | available at https://fiji.sc for manipulation of binary image stacks |
| RyR-Simulator codes/data | CellSMB group | available at https://github.com/CellSMB/RyR-simulator | |
| CardiacCellMeshGenerator | CellSMB group | comes with RyR-Simulator under folder "gui-version" | |
| R-statistics software | R-project | Download from https://www.r-project.org | |
| spatstat | R-project | install via R program | |
| rgl | R-project | install via R program | |
| doparallel | R-project | install via R program | |
| foreach | R-project | install via R program | |
| doSNOW | R-project | install via R program | |
| iterators | R-project | install via R program |
References
- Noble, D., Rudy, Y. Models of cardiac ventricular action potentials: iterative interaction between experiment and simulation. Phil. Trans. R. Soc. A: Math., Phys. and Eng. Sci. 359 (1783), 1127-1142 (2001).
- Williams, G. S. B., Smith, G. D., Sobie, E. A., Jafri, M. S. Models of cardiac excitation-contraction coupling in ventricular myocytes. Math. Biosci. 226 (1), 1-15 (2010).
- Beard, D. A., Vendelin, M. Systems biology of the mitochondrion. Am. J. Phys. - Cell Phys. 291 (6), C1101-C1103 (2006).
- Crampin, E. J., Smith, N. P. A Dynamic Model of Excitation-Contraction Coupling during Acidosis in Cardiac Ventricular Myocytes. Biophys. J. 90 (9), 3074-3090 (2006).
- Li, L., Louch, W. E., et al. Calcium Dynamics in the Ventricular Myocytes of SERCA2 Knockout Mice: A Modeling Study. Biophys. J. 100 (2), 322-331 (2011).
- Shimizu, I., Minamino, T. Physiological and pathological cardiac hypertrophy. J. Mol. Cell. Cardiol. 97, 245-262 (2016).
- Wei, S., Guo, A., et al. T-tubule remodeling during transition from hypertrophy to heart failure. Circ. Res. 107 (4), 520-531 (2010).
- Jarosz, J., Ghosh, S., et al. Changes in mitochondrial morphology and organization can enhance energy supply from mitochondrial oxidative phosphorylation in diabetic cardiomyopathy. Am. J. Phys. - Cell Phys. 312 (2), C190-C197 (2017).
- González, A., Ravassa, S., Beaumont, J., López, B., Díez, J. New Targets to Treat the Structural Remodeling of the Myocardium. J. Am. Coll. Cardiol. 58 (18), 1833-1843 (2011).
- Hayashi, T., Martone, M. E., Yu, Z., Thor, A., Doi, M. Three-dimensional electron microscopy reveals new details of membrane systems for Ca2+ signaling in the heart. J. Cell Sci. , (2009).
- Soeller, C., Crossman, D., Gilbert, R., Cannell, M. B. Analysis of ryanodine receptor clusters in rat and human cardiac myocytes. Proc. Natl. Acad. Sci. 104 (38), 14958-14963 (2007).
- Soeller, C., Baddeley, D. Super-resolution imaging of EC coupling protein distribution in the heart. J. Mol. Cell. Cardiol. 58 (1), 32-40 (2013).
- Yu, Z., Holst, M. J., et al. Three-dimensional geometric modeling of membrane-bound organelles in ventricular myocytes: bridging the gap between microscopic imaging and mathematical simulation. J. Struct. Biol. 164 (3), 304-313 (2008).
- Hake, J., Edwards, A. G., et al. Modelling cardiac calcium sparks in a three-dimensional reconstruction of a calcium release unit. J. Physiol. 590 (18), 4403-4422 (2012).
- Soeller, C., Jayasinghe, I. D., Li, P., Holden, A. V., Cannell, M. B. Three-dimensional high-resolution imaging of cardiac proteins to construct models of intracellular Ca2+ signalling in rat ventricular myocytes. Exp. Physiol. 94 (5), 496-508 (2009).
- Kekenes-Huskey, P. M., Cheng, Y., Hake, J. E. Modeling effects of L-type Ca2+ current and Na+-Ca2+ exchanger on Ca2+ trigger flux in rabbit myocytes with realistic t-tubule geometries. Front. in Physiol. 3, 1-14 (2012).
- Zienkiewicz, O. C., Taylor, R. L. The finite element method. 1, Butterworth-Heinemann. (2000).
- Rajagopal, V., Bass, G., et al. Examination of the effects of heterogeneous organization of RyR clusters, myofibrils and mitochondria on Ca2+ release patterns in cardiomyocytes. PLoS Comp. Biol. 11 (9), e1004417 (2015).
- Illian, J., Penttinen, A., Stoyan, H., Stoyan, D. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. Statistical Analysis and Modelling of Spatial Point Patterns. , John Wiley & Sons. Chichester, UK. 1-534 (2008).
- Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. Computer Visualization of Three-Dimensional Image Data Using IMOD. J. Struct. Biol. 116, 71-76 (1996).
- Fang, Q., Boas, D. A. Tetrahedral mesh generation from volumetric binary and grayscale images. Proc. ISBI. , 1142-1145 (2009).
- Aune, D. J., Herr, S. E., Menick, D. R. Induction and assessment of ischemia-reperfusion injury in langendorff perfused rat hearts. J. Vis. Exp. (101), e52908 (2015).
- Judd, J., Lovas, J., Huang, G. N. Isolation, culture and transduction of adult mouse cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (114), (2016).
- Hagler, H. K. Ultramicrotomy for biological electron microscopy. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 369 (Chapter 5), 67-96 (2007).
- He, W., He, Y. Electron tomography for organelles, cells, and tissues. Electron Microscopy: Methods and Protocols. 1117 (20), 445-483 (2014).
- Diggle, P., Marron, J. S. Equivalence of smoothing parameter selectors in density and intensity estimation. J. Am. Stat. Assoc. 83 (403), 793-800 (1988).
- Ghosh, S., Crampin, E. J., Hanssen, E., Rajagopal, V. A computational study of the role of mitochondrial organization on cardiac bioenergetics. Proc. EMBC. , 2696-2699 (2017).
- Pinali, C., Kitmitto, A. Serial block face scanning electron microscopy for the study of cardiac muscle ultrastructure at nanoscale resolutions. J. Mol. Cell. Cardiol. 76, 1-11 (2014).
- Hussain, A., Hanssen, E., Rajagopal, V. A Semi-Automated Workflow for Segmenting Contents of Single Cardiac Cells from Serial-Block-Face Scanning Electron Microscopy Data. Microsc Microanal. 23 (S1), 240-241 (2017).
- Pinali, C., Bennett, H., Davenport, J. B., Trafford, A. W., Kitmitto, A. Three-dimensional reconstruction of cardiac sarcoplasmic reticulum reveals a continuous network linking transverse-tubules: this organization is perturbed in heart failure. Circ. Res. 113 (11), 1219-1230 (2013).
- LeGrice, I. J., Hunter, P. J., Smaill, B. H. Laminar structure of the heart: a mathematical model. Am. J. Physiol. 272 (5 Pt 2), H2466-H2476 (1997).
- Jayasinghe, I. D., Cannell, M. B., Soeller, C. Organization of ryanodine receptors, transverse tubules, and sodium-calcium exchanger in rat myocytes. Biophys. J. 97 (10), 2664-2673 (2009).
- Jayasinghe, I. D., Crossman, D. J., Soeller, C., Cannell, M. B. Comparison of the organization of t-tubules, sarcoplasmic reticulum and ryanodine receptors in rat and human ventricular myocardium. Clinic. Exp. Pharmacol. P. 39 (5), 469-476 (2012).
- Bradley, C., Bowery, A., et al. OpenCMISS: a multi-physics & multi-scale computational infrastructure for the VPH/Physiome project. Prog. Biophys. Mol. Bio. 107 (1), 32-47 (2011).
