Summary
Konventionelle tab af funktion undersøgelser af gener ved hjælp af knockout dyr har ofte været dyrt og tidskrævende. Elektroporation-baseret CRISPR-medieret somatiske mutagenese er et kraftfuldt værktøj til at forstå genet fungerer in vivo. Her rapporterer vi en metode til at analysere knockout fænotyper i prolifererende celler af lillehjernen.
Abstract
Hjernen misdannelser er ofte forårsaget af genetiske mutationer. Decifrere mutationer i patient-afledte væv har identificeret potentielle årsagsfaktorer af sygdomme. For at validere bidrag af en dysfunktion af de muterede gener til udvikling af sygdom, er generation af dyremodeller transporterer mutationerne en indlysende fremgangsmåde. Mens kønscelleoverførsel genetisk manipuleret musemodeller (GEMMs) er populære biologiske værktøjer og udstille reproducerbare resultater, det er begrænset af tid og omkostninger. I mellemtiden, ikke-genom GEMMs ofte aktiverer udforske genfunktion i en mere realistisk måde. Siden nogle hjerne sygdomme (fx, hjernetumorer) synes at være resultatet af somatiske men ikke kønscelleoverførsel mutationer, ikke-kønscelleoverførsel kimære musemodeller, hvor normale og unormale celler sameksistere, kunne være nyttigt for sygdom-relevant analyse. I denne undersøgelse rapport vi en metode til induktion af CRISPR-medieret somatiske mutationer i lillehjernen. Specifikt, vi udnyttede betinget knock-i mus, hvor Cas9 og normal god landbrugspraksis er kronisk aktiveres af CAG (CMV forstærker/kylling ß-actin) promotor efter Cre-medieret rekombination af genomet. Den selvstændige designet enkelt-guide RNA'er (sgRNAs) og Cre recombinase sekvens, både kodet i et enkelt plasmid konstruktion, blev leveret til cerebellare stilk/stamceller på en embryonale stadie benytter i utero elektroporation. Derfor var transfekteret celler og deres datter celler mærket med grøn fluorescerende proteiner (NGL), således at lette yderligere fænotypiske analyser. Derfor, denne metode ikke kun viser elektroporation-baserede gen levering i cerebellare Embryoceller men også foreslå en roman kvantitative tilgang for at vurdere CRISPR-medieret tab af funktion fænotyper.
Introduction
Hjernesygdomme er en af de mest forfærdelige dødelige sygdomme. De skyldes ofte genetiske mutationer og efterfølgende dysregulering. For at forstå molekylære mekanismer af hjernesygdomme, har nogensinde langvarige bestræbelser på at dechifrere genomer af menneskelige patienter opdaget en række potentielle sygdomsfremkaldende gener. Hidtil, har været udnyttet kønscelleoverførsel genetisk manipuleret dyremodeller for in vivo gevinst-af-funktion (GOF) og tab af funktion (LOF) analyser af sådanne kandidat gener. På grund af den fremskyndede udviklingen af funktionelle valideringsundersøgelser, en mere realistisk og fleksibel i vivo gen assay system for at studere genfunktion er ønskeligt.
Anvendelse af en in vivo elektroporation-baserede gen overførsel systemet at udvikle mus hjernen er velegnet til dette formål. Faktisk har flere undersøgelser, i utero elektroporation vist deres potentiale til at gennemføre funktionelle analyser i udviklingslandene hjernen1,2,3. Faktisk, flere regioner i mus hjernen, såsom cerebral cortex4, nethinden5, diencephalon6, baghjernen7, lillehjernen8og rygmarven9 er blevet angrebet af somatiske gen levering tilgange, så langt.
Faktisk, forbigående genekspression af i vivo elektroporation på embryonale mus hjerner har længe været anvendt til GOF analyse. Seneste transposon-baserede genomisk integration teknologier yderligere aktiveret langsigtet og/eller betingede udtryk af gener af interesse10,11, hvilket er en fordel at dissekere genfunktion i en rumlig og tidsmæssig måde under udvikling. I modsætning til GOF analyse, har LOF analyse været mere udfordrende. Mens forbigående Transfektion af siRNAs og shRNA-regnskabsmæssige plasmider blev udført, er langsigtede virkninger af LOF af gener ikke garanteret på grund af eventuel forringelse af eksogent indførte nukleinsyrer, såsom plasmider og dsRNAs. CRISPR/Cas-teknologien giver imidlertid et gennembrud i LOF analyser. Gener kodning fluorescerende proteiner (f.eks.normal god landbrugspraksis) eller en bioluminescerende proteiner (fxfirefly luciferase) har været co transfekteret med CRISPR-Cas9 og sgRNAs til at mærke de celler udsat for CRISPR-Cas9-medieret somatiske mutationer. Ikke desto mindre, denne tilgang kan have begrænsninger i funktionelle studier om prolifererende celler, da eksogene markørgener er udvandet og forringet efter langsigtede spredning. Mens de transfected celler og deres datter celler gennemgå CRISPR-induceret mutationer i deres genomer, kan deres fodspor få tabt over tid. Genetiske mærkning tilgange vil således egnet til at overvinde dette problem.
Vi har for nylig udviklet en CRISPR-baseret LOF metode i cerebellare granula celler, der undergår langsigtede spredning under deres differentiering12. At genetisk mærke de transfected celler, vi bygget et plasmid, bærer en sgRNA sammen med Cre og indført plasmidet i cerebella af Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus13 bruger i utero elektroporation. I modsætning til regelmæssig plasmid vektorer kodning EGFP, denne fremgangsmåde med succes mærket transfekteret granula neuron prækursorer (BNI) og deres datter celler. Denne metode giver stor støtte i forståelse in vivo funktion af gener af interesse i prolifererende celler i normal hjernens udvikling og en tumor-tilbøjelige baggrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev gennemført efter dyrevelfærd forordninger og er blevet godkendt af de ansvarlige myndigheder (Regierungspräsidium Karlsruhe, godkendelsesnumre: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 og G133/14).
1. generere pU6-sgRNA-CVH-Cre plasmider
- Design sgRNA til at målrette en gen-af-interesse efter tidligere udgivne protokol14.
Bemærk: I dette eksperiment, to sgRNAs er designet til at målrette mus Top2b gen og en ikke-målrettet kontrol sgRNA (tabel 1). Til knockout molekylærgenetisk ved hjælp af CRISPR teknologi, nødt sgRNAs til at være designet til at målrette enten den kodende sekvens af 5' region eller den væsentlige funktionelle domæne af protein. En praktisk udgangspunkt er at teste offentligt tilgængelige pre-designede sgRNA sekvenser, ligesom GeCKO v2 mus knockout pool bibliotek15 fra Zhang lab. SgRNAs kan alternativt udformes ved hjælp af offentlig tilgængelig software som følgende websted: crispr.mit.edu. - Klone sgRNAs i pU6-sgRNA-CVH-Cre vektor.
Bemærk: PU6-sgRNA-CVH-Cre vektor12 anvendes i denne undersøgelse er afledt af den oprindelige pX330 plasmid16 ved at erstatte den kodende sekvens af SpCas9 med Cre recombinase.- Syntetisere to DNA oligos som følger. Betydning: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisensstoffer: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Bemærk: 20 N vist ovenfor står for sgRNA sekvens. - Fordøje pU6-sgRNA-CVH-Cre med BbsI i 30 minutter ved 37 ° C ved hjælp af følgende reagenser, indlæse en 1%-agarosegel fordøjet prøven, og rense dem ved hjælp af en gel-udvinding kit. Brug 3 µg Plasmid; 3 µL Bbs; 1 µL FastAP; 5 µL 10 x fordøjelsen buffer; tilføje ddH2O for at bringe den samlede mængde til 50 µL.
- Phosphorylate og anneal hvert par af sgRNA oligos ved hjælp af følgende reagenser (10 µL samlede volumen): 1 µL Customized forstand oligo (100 mM); 1 µL tilpasset antisense oligo (100 mM); 1 µL 10 x T4 ligatur Buffer; 6.5 µL ddH2O; 0,5 ΜL T4 PNK. Inkuber i et thermo cycler i 30 minutter ved 37 ° C, og 5 min. ved 95 ° C, og derefter rampe ned til 25 ° C ved 5 ° C/min..
- Oprettet den følgende ligatur reaktion, og der inkuberes i 10 min. ved stuetemperatur (10 µL samlede volumen): X µL Bbsjeg fordøjet plasmid (50 ng); 1 µL fosforyleret og udglødet, oligo duplex (1:200 fortynding); 5 µL 2 x ligatur buffer; X µl ddH2O; 1 µL hurtig ligase.
- Tilføj 2 µL af varens ligatur i 50 µL af kemisk kompetente DH5α Escherichia coli celler. Efter 30 min inkubation på is, varme chok prøve for 90 s på 42 ° C, og der inkuberes i 2 min på is. Tilsæt 100 µL af LB medium og plade det på en LB-plade med 100 µg/mL ampicillin.
Bemærk: Integration af sgRNA sekvens i pU6-sgRNA-CVH-Cre plasmid er udført efter de kloning trin for pX330 plasmid14. - Podes to kolonier, hver på 2 mL af LB medium ved 37 ° C i mindst 6 timer, og udføre en mini prep DNA isoleret ved hjælp af et kit.
- Sanger sekvens mini prep DNA ved hjælp af hU6-Forward primer og identificere kolonier med den korrekte indsættelse af sgRNAs ved at tilpasse med sekvensen vist taktfast 1.2.1. Primer sekvens er vist i tabel 1. Plasmider anvendes i denne undersøgelse blev opkaldt pU6-sgTop2b-1-CVH-Cre, pU6-sgTop2b-2-CVH-Cre og pU6-sgControl-CVH-Cre.
- Podes korrekt identificeret kolonierne og rense endotoxin-fri plasmid DNA for i utero elektroporation ved hjælp af et kit, fxfra Qiagen. Elueres DNA med endotoxin-gratis TE-Buffer fortyndet i ddH2O på 1:10 (10% TE buffer). Plasmidet DNA koncentration skal være højere end 2 mg/mL.
Bemærk: Brug ikke en regelmæssig maxi-prep kit til DNA forberedelse. Gemme plasmid-løsninger ved 4 ° C for regelmæssig kortvarig brug (op til 4 uger), eller prøve en passende mængde på ca. 25 µL og holde ved-20 ° C til langtidsopbevaring.
- Syntetisere to DNA oligos som følger. Betydning: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisensstoffer: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. teste effektiviteten af sgRNAs ved hjælp af EGxxFP Plasmid System
Bemærk: Effektiviteten af sgRNAs er normalt testet af landinspektør eller T7E1 (T7 liv1975 jeg) assays. I denne protokol bruges en nem og effektiv alternativ tilgang. Nøglen til denne tilgang er at bruge den pCAG-EGxxFP plasmid som indeholder overlappende EGFP fragmenter adskilt af en DNA-sekvens der indeholder sgRNA målretning site17. Efter udtryk for pCAG-EGxxFP sammen med sgRNA og Cas9 i de transfected celler, er Cas9-medieret dobbeltstrenget pause (DSB) i rækkefølgen, målet repareret af endogene homologi-afhængige mekanismer, som genopretter EGFP udtryk kassette.
- Design primere til at forstærke regionen genomisk centreret med sgRNA målretning sekvenser. PCR-amplikon er ca 500 bp. I dette eksperiment, blev en DNA samling anvendt for at klone en PCR-forstærket fragment i pCAG-EGxxFP plasmid.
Bemærk: Alternativt passende begrænsning websteder kan føjes til 5'-enden af PCR-primere. Tilgængelige begrænsning websteder på pCAG EGxxFP vektor er BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI og EcoRV. - Forstærke genomisk DNA med designet primere ved hjælp af formen og PCR-parametre nedenfor. Indlæse prøven (19,7 µL H2O; 0,3 µL af 10 ng/µL mus genomisk DNA; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µL 2 X PCR master mix; 50 µL samlede volumen) ind på en 1% Agarosen gel og gel-rense PCR-fragmenter ved hjælp af en gel-udvinding kit. Brug de følgende reaktion betingelser: 95 ° C i 3 min; derefter 35 x cyklusser af 98 ° C til 20 s, 60 ° C i 15 s, 72 ° C til 20 s, og mindst 72 ° C i 1 min; 4 ° C, på ubestemt tid.
Bemærk: I dette eksperiment, én region i Top2b exon 1 blev forstærket; Find primer sekvenser i tabel 1. - Fordøje pCAG-EGxxFP vektor med restriktionsenzymer BamHI og EcoRI i 2 timer ved 37 ° C, derefter indlæse prøve på en 1% Agarosen gel og gel-rense vektor rygraden ved hjælp af en gel-udvinding kit. Brug de følgende reagenser (50 µL samlede volumen): X µL Plasmid (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL EcoRI; 5 µL 10 x Buffer; X µl ddH2O.
- Oprette DNA forsamling reaktion18 ifølge fabrikantens anvisninger, og omdanne DH5α kompetente E. coli.
- Podes to kolonier, hver på 2 mL af LB medium ved 37 ° C i mindst 6 h, udføre en mini prep DNA isoleret ved hjælp af et kit, fxfra Qiagen, og identificere kolonier med den korrekte indsættelse (i det følgende benævnt pCAG-fx-Top2b-FP) ved hjælp af Sanger sekventering med EGxxFP-Top2b-F primer.
- Transfect HEK293T celler.
- Frø af HEK293T celler i en 24-godt plade 24 timer før Transfektion.
Bemærk: Celler blev kulturperler i et 37 ° C celle kuvøse med 5% CO2, i DMEM med Glutamin supplement indeholder 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin. Sikre, at cellerne er 60% sammenflydende på dagen for Transfektion. I dette eksperiment brugte vi self-made HEK293T celler stabilt udtrykker SpCas9 for at teste pU6-sgRNA-CVH-Cre. Vildtype HEK293T celler kan dog bruges, hvis et SpCas9 udtryk vektor er fastsat. - Transfect HEK293T celler ved hjælp af polyethylenimine (PEI) reagens. Transfect celler med 120 ng/brønd af pCAG-fx-Top2b-FP plasmid12 og 120 ng/brønd af pU6-sgTop2b-1-CVH-Cre eller pU6-sgTop2b-2-CVH-Cre i en 24-godt plade. Blandes plasmidet udpegede nationale myndigheder og de 1,8 µL af PEI reagens i 80 µL af unsupplemented DMEM medium med glutamin supplere og Inkuber i 15 min. ved stuetemperatur efter vortexing.
- 6 h efter Transfektion, fjerne medium og erstatte med frisk medium.
- Overvåge tilstedeværelsen af levende normal god landbrugspraksis+ celler 48 h efter Transfektion ved hjælp af et fluorescens mikroskop ved 20 x forstørrelse.
Bemærk: Antallet af normal god landbrugspraksis+ celler angiver målretning effektiviteten af sgRNA. Resultater af effektiv og ikke-effektive sgRNAs (sgTop2b-1 og sgTop2b-2, henholdsvis) er vist i figur 2A.
- Frø af HEK293T celler i en 24-godt plade 24 timer før Transfektion.
3. udføre In Utero elektroporation
- Opdrætter 6 til 8 uger gamle mus og forberede i utero elektroporation værktøjer. Cross mandlige homozygote Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus med kvindelige CD-1 mus. Tid graviditet af CD-1 mus fra den dag, vaginal stikket er opdaget (E0.5). Embryoner er electroporated på dagen E13.5.
- Trække borsilikatglas kapillærer (indvendig diameter: 0,6-0,8 mm) med en mikropipette puller. Brug følgende indstillinger: P = 500, varme = 560, Pull = 150, Vel = 75, tid = 250. Mærke den kapillære tip med sort blæk til bedre visualisering under injektionen. Trimme den kapillære taper under et stereomikroskop ved hjælp af en lineal og skarp nål pincet og trim tip ved en længde på ca. 6 mm.
- Opretholde enhed af kapillærer at holde eksperimentet reproducerbare. Oprette en ensidig skrå kant i løbet af trimning. Spidsen bør være så skarpe som muligt for nem indtrængen livmodervæggen og undgå vævsskader af embryoet.
Bemærk: Brug alternativt en mikro grinder til at justere en 35° vinkel19. Kapillærerne kan opbevares ved stuetemperatur i en 10 cm petriskål patogenfrie betingelser. - Autoklave de kirurgiske instrumenter.
- Bland sgRNA-plasmider i lige store dele med pT2K-IRES-Luc til en endelig koncentration på mindst 1 µg/µL for hver plasmid og farve plasmid-løsning med hurtig grøn (endelig koncentration på 0,05%). Forberede 1% hurtigt grøn stamopløsning med endotoxin-fri destilleret vand og filtreres gennem et 0,22 µm filter til at fjerne farvestof partikler fra løsningen.
Bemærk: Co Transfektion af pT2K IRES-Luc er valgfri, men giver mulighed for identifikation af levedygtige electroporated dyr efter fødslen bruger bioluminescens billeddannelse. Venligst se trin 3.5. Forberede en tilstrækkelig mængde af plasmid-mix for det samlede antal gravide mus skal betjenes. Bruge om 15-20 µL mix pr. mus (~ 12 embryoner). Fortsætte straks med kirurgi.
- Forberede mus til kirurgi.
- Bedøver gravid CD-1 mus med isofluran. Fremkalde anæstesi i en kasse med 3-4 vol-% isofluran (ilt strømningshastighed: 1,5 L/min) og opretholde det med 2 vol-% under operation via næsen kegle.
Bemærk: Den komplette kirurgi bør ikke tage længere tid end 30 min. reducere antallet af injiceres og electroporated embryoner, hvis nødvendigt. Bruge sterile handsker til kirurgi. - Placer musen på ryggen på en varmepude og justere anæstesi.
- Indsprøjtes smertestillende (Metamizol, 800 mg/kg kropsvægt, subkutant (s.c.), 24 h depot).
Bemærk: Du kan bruge andre autoriserede analgetika end Metamizol. - Anvende øjet salve for at forhindre øje-tørhed under kirurgi.
- Lave lemmer med tape og sterilisere maven med et desinfektionsmiddel. Dække mus med gaze, forlader kun den kirurgisk område udsat. Spredt 70% ethanol over kirurgiske område og gaze.
- Gøre en hud indsnit i ca. 2 cm i længde og udvide hullet forsigtigt med en direkte kirurgisk saks. Find linea alba og gøre en lidt mindre andet snit gennem bughinden ved hjælp af væv saks med stump spids.
- Fugte åbnede bughulen med pre varmede sterile 1 x PBS.
- Omhyggeligt udtrække livmoder horn fra bughulen bruger ring pincet. Træk forsigtigt ved at snuppe livmodervæggen udelukkende på kløften mellem æggeblomme sække af to tilstødende embryoner. Undgå ethvert pres på fosteret mens du trækker det gennem incisionen. Forstørre indsnittet, hvis det er nødvendigt og tage ekstra pleje til at placere de uterine horn på maven mens ikke komprimere blodgennemstrømning gennem den uterine arterie.
Bemærk: I nogle tilfælde kan det tilrådes at udtrække en uterin horn på et tidspunkt, og erstatte det, før du fortsætter med den anden uterin horn.
- Bedøver gravid CD-1 mus med isofluran. Fremkalde anæstesi i en kasse med 3-4 vol-% isofluran (ilt strømningshastighed: 1,5 L/min) og opretholde det med 2 vol-% under operation via næsen kegle.
- Injektion og elektroporation af plasmid DNAs
- Opsug ca 15 µL af farvede plasmid-løsning med rede glasset kapillær. Undgå eventuelle luftbobler under denne proces.
Bemærk: Plasmid-løsning kan blokere spidsen nemt hvis koncentrationen er høj. Test kapillar ved at frigive nogle DNA lige før injektionen. - Forsigtigt holde fosteret med ring pincet og Find hals-området.
Bemærk: Hvis embryonet er i en vanskelige at injicere position, springe den over og gå til den næste embryo. Øget Repositionering af fosteret kan øge chancerne for at skade dem. - Langsomt pierce med spidsen af de tidligere parat glas kapillarrør i den fjerde ventrikel ved at trænge gennem den dorsale baghjernen og efterfølgende injiceres omkring 1 µL plasmid-mix. Bekræfte, at den farvet DNA ikke er lækket fra hjernen og er synlig som en diamant formet struktur.
Bemærk: Som en mulighed, bruge 2,5 forstørrelsesglas for bedre visualisering af den fjerde ventrikel og de omkringliggende blodkar. Levere elektriske impulser umiddelbart efter injektion til at forhindre udbredelsen af plasmid-løsning til andre hjertekamrene. - Anvende elektriske firkant pulser (5 impulser, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) med pincet-lignende platin pincet (Se Tabel af materialer). Placer elektroderne sideværts med den negative pol, der dækker øret og den positive pol placeret på de cerebellare primordium over livmodervæggen. Brug 5 mm-diameter elektrode plader for effektiv elektroporation E13.5 embryoner.
Bemærk: Øge overlevelsesraten for unger ved at manipulere med mindre end 2/3rd af det samlede antal embryoner pr. dam. Undgå embryoner for tæt til livmoderhalsen. Hvis manipuleret, kan de forårsage komplikationer under fødslen og bringe hele kuldet. Hvis elektroderne er også Fosters hjerte, dette kan forårsage hjertestop.
- Opsug ca 15 µL af farvede plasmid-løsning med rede glasset kapillær. Undgå eventuelle luftbobler under denne proces.
- Post-elektroporation og efter operationen pleje
- Omhyggeligt placere uterin horn tilbage ind i bughulen og fyldes med pre varmes sterile 1 x PBS. Lade livmoderen horn glide ind i en naturlig position.
- Luk bughinden og hud separat med en enkel fortløbende sutur.
Bemærk: Tage ekstra pleje ikke til at gennembore gennem livmodervæggen når suturering bughinden. - Shut-down anæstesi og placere dyret mave-ned i et nyt bur.
- Overvåge dyret i løbet af vågne fase og igen 24 timer efter operationen. Placer bur under en varme lampe, hvis den skælvende ikke forbedres inden for en 15 min tidsramme og dyret ikke starter grooming.
- Bekræft vellykket elektroporation ved luciferase billeddannelse.
- Sørg for, at de betjente dæmninger drop embryoner på tid (på E19.5).
Bemærk: Fødselsdato kan udskydes til næste dag sandsynligvis på grund af operationen. - Bedøver electroporated unger (P5-P7) med 2,5% isofluran og injicere (intraperitoneal (i.p.)) med D-Luciferin (3 mg/kg kropsvægt) 5 min før billeddannelse.
- Opdage luciferase signaler i electroporated unger bruger bioluminescens imager.
Bemærk: Et 1 min eksponeringstid er tilstrækkeligt til at påvise luciferase signal. Radiance (p/s/cm2/sr) er ca > 1 x 106.
- Sørg for, at de betjente dæmninger drop embryoner på tid (på E19.5).
4. Forbered snit frosset organmateriale fra Electroporated Cerebella
- Aflive electroporated P7 unger og dissekere ud lillehjernen.
Bemærk: Normal god landbrugspraksis signal kan observeres ved hjælp af en epifluorescerende Stereoskopet. - Lave cerebella natten over i 5 mL pr. hjerne på 4% PFA i PBS ved 4 ° C.
- Overføre de faste cerebella overnatning i 10 mL pr. hjerne 30% saccharose i PBS ved 4 ° C.
Bemærk: Væv bør nå bunden af en 15 mL tube efter inkubation i rørsukkeropløsning. - Efter neddypning op den resterende rørsukkeropløsning med et stykke af cellulose filtrerpapir, fordybe lillehjernen i en optimal opskæring temperatur (OCT) sammensatte i en engangs plast skimmel og fryse det på tøris. Kryogene blokken kan opbevares ved-80 ° C indtil brug.
Bemærk: Protokollen kan pause her. - Snit den kryogene blok i sektioner med 10 µm i tykkelse ved hjælp af en kryostaten og holde afsnittene på-80 ° C indtil brug.
Bemærk: Man kan bekræfte normal god landbrugspraksis udtryk i afsnittene, efter udvaskning OLT sammensatte med PBS.
5. immunfarvning af snit frosset organmateriale
- Tørre dias på room temperature i 30 min og vask to gange i 10 min i PBS.
- Cirkel afsnittene med en flydende blocker pen og inkuberes sektioner i en blokerende løsning (10% normal æsel serum i PBS, som indeholder 0,1% Triton-X100) i 1 time ved stuetemperatur.
- Tilføje primære antistoffer mod molekyler af interesse (f.eks., normal god landbrugspraksis og topoisomerase II beta (Top2B) i denne undersøgelse) i den blokerende opløsning og inkuberes natten over ved 4 ° C.
Bemærk: Navne og koncentrationer af antistoffer bruges er angivet i Tabel af materialer. For at øge normal god landbrugspraksis signaler, kan en anti-normal god landbrugspraksis antistof anvendes valgfrit sammen med de andre antistoffer. - Vask dias med 0,1% Triton-holdige PBST 3 X til 10 min. Incubate sektioner i 1 time ved stuetemperatur med en fluorophore-konjugeret sekundær antistof fortyndet i blokerende løsning indeholdende DAPI.
- Vaske dias i PBS 3 X til 10 min. Mount dias og holde ved 4 ° C indtil billeddannelse.
Bemærk: Protokollen kan pause her.
6. billedbehandling og analyse
- Image sektioner ved hjælp af en Konfokal mikroskop ved 20 x forstørrelse.
- Tæl antallet af normal god landbrugspraksis positive celler mister udtryk for target proteinet. Et repræsentativt billede er vist i figur 2B.
- Tjek den molekylære fænotype efter ablation af target gener i BNI og deres descendenter af immuostaining12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I vivo funktionel analyse er det kritisk at identificere de celler, som er indsat om eksogene molekylærgenetisk. Samtidig udtryk for en markør, som normal god landbrugspraksis i ikke-prolifererende celler kan blive fulgt op i en lang periode, bliver signalet sekventielt tabt i prolifererende celler. En illustration af denne effekt er vist i figur 1. For at omgå mister fodaftryk af transfekteret celler i LOF analyser, udviklet vi en ny metode ved at kombinere elektroporation-baserede gen levering med CRISPR/Cas9-teknologi.
Repræsentative resultater er vist i figur 2. Funktionaliteten af plasmid konstruktioner er testet af forbigående Transfektion af pU6-sgTop2b-CVH-Cre og pCAG-fx-Top2b-FP17, transporterer sgTop2b target sekvens i HEK293T celler stabilt udtrykker SpCas9 (figur 2A). SgRNA-styrede Cas9 liv1975 aktivitet inducerer DSB-medieret homologi-instrueret reparation af EGFP udtryk kassette. Derfor, funktionen af sgRNA var direkte analyseret ved påvisning af normal god landbrugspraksis udtryk. Ifølge Mashiko et al.bestemmer en Transfektion effektivitet på mere end 30% en sgRNA som effektivt17.
BNI stammer fra rombeformede læben (RL), en region, som grænser op til taget af den fjerde ventrikel på vorden E12.5 indtil E16.5. Disse celler har været kendt for at gennemgå en massiv spredning efter fødslen i de ydre eksterne granulet lag (oEGL) og Skift til den indre EGL (iEGL) efter spændende cellecyklus20. BNI er således et relevant eksempel at teste fordele af vores genetiske mærkning tilgang.
Ved at følge denne protokol, tillader i utero elektroporation af BNI sporing af redigerede celler med normal god landbrugspraksis. Vi indførte pU6-sgRNA-CVH-Cre plasmid udtryk for sgControl i de cerebellare primordium af Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus på embryostadiet E13.5. Mus blev ofret på postnatal dag P7, og sagittal sektioner af cerebellare væv sektioner var plettet af Immunhistokemi. Ydre og indre EGL blev defineret af Ki67 udtryk (oEGL) og p27 udtryk (iEGL), henholdsvis. Trods gennemgår spredning og modning, bevaret modne cerebellare granulet neuroner (CGNs) stadig stærk normal god landbrugspraksis udtryk (figur 2B).
Understreger nytten af denne protokol, brugte vi desuden sgRNA målretning DNA Top2b som et repræsentativt eksempel. Eksperimentelle procedurer blev udført som beskrevet ovenfor (Se figur 2B). De fleste af normal god landbrugspraksis-positive celler transfekteret med sgRNAs for Top2b udstillet et tab af Top2b udtryk i det interne granul lag (IGL), mens indførelsen af kontrol sgRNAs ikke resulterede i klar reduktion af sit udtryk (figur 2 c). En kvantificering af dette resultat er vist i figur 2D. Disse data udgør et værdifuldt redskab til sporing redigerede celler for en lang periode under udvikling eller svulst dannelse.
Figur 1: skematisk fremstilling af normal god landbrugspraksis udtryk i prolifererende og ikke-prolifererende celler. (A) når en eksogen gen kodning normal god landbrugspraksis (fx, pCAG-EGFP) er transfekteret i ikke-prolifererende celler, cellerne kan give udtryk for normal god landbrugspraksis i lang tid (øvre lane). I mellemtiden, normal god landbrugspraksis udtryk kunne forsvinde i prolifererende celler på grund af fortynding af eksogene normal god landbrugspraksis (midterste vognbane). Derimod kan de celler, der bærer LoxP-Stop-LoxP-NGL (LSL-normal god landbrugspraksis) transgenet holde normal god landbrugspraksis udtryk under spredning efter Transfektion med Cre recombinase (lavere lane). (B) princippet om SpCas9-medierede genhæmning og normal god landbrugspraksis udtryk efter Cre og sgRNA Transfektion i en Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus stamme. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: repræsentative billeder af resultater fra protokollens. (A) HEK293T celler, der stabilt udtrykker SpCas9 blev transfekteret med pU6-sgTop2b-CVH-Cre og pCAG-fx-Top2b-FP plasmider. Normal god landbrugspraksis udtryk i levende celler blev overvåget ved hjælp af en fluorescerende celle imager (Se Tabel af materialer) 48 h efter Transfektion. Venstre og højre paneler viser en effektiv og ikke-effektive sgRNA sekvens baseret på normal god landbrugspraksis udtryk, henholdsvis. Skalere barer: 100 µm. (B) immunfarvning af normal god landbrugspraksis, Ki67 og p27 på P7 cerebella fra en Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus udsættes for elektroporation på E13.5 med pU6-sgRNA-CVH-Cre plasmid konstruktioner udtrykker kontrol sgRNA. Afsnittet er counterstained med DAPI (blå). Skalere barer: 50 µm; 20 x forstørrelse. Bemærk udtryk for normal god landbrugspraksis celler i oEGL præget af Ki67. (C) immunfarvning af normal god landbrugspraksis (grøn) og Top2b (magenta) på P7 cerebella fra en Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus, der var electroporated på E13.5 med pU6-sgRNA-CVH-Cre plasmid konstruerer udtrykker sgRNA mod Top2b (sgTop2b) og en kontrolsekvens (sgControl). Pilene angiver Top2b udtryk i normal god landbrugspraksis+ celler i det samme felt. Skalere barer: 20 µm; 20 x forstørrelse. (D) kvantificering af Top2b i electroporated (normal god landbrugspraksis-positive) celler i sgControl og sgTop2b eksperimenter. To og tre unger blev undersøgt for sgControl og sgTop2b, henholdsvis, og 25 celler fra hver hjerne blev analyseret. Fejllinjer udgør ± standardfejl af middelværdien (SEM) og p-værdier blev beregnet af uparret t-test, *p = 0.0002. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Navn | Sekvens | Ansøgning | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA target sekvens | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA target sekvens | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA target sekvens | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Kloning i pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Kloning i pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Rækkefølgen af sgRNA | |
Tabel 1: Sekvenser af oligos bliver brugt i denne undersøgelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Brug exo utero elektroporation, har vi tidligere rapporteret, siRNA-baseret i vivo funktionelle analyser af Atoh1 på et tidligt stadium af cerebellare granula celle differentiering8. SiRNA fortynding/nedbrydning og eksponering af embryoner uden for livmodervæggen var fænotypiske analyser af electroporated granula celler begrænset til vorden. Men den nuværende metode aktiveret analyse af Fænotypen af postnatal dyr.
Vores tidligere undersøgelse viste, at Cas9-medieret knockout af tumor suppressor Ptch1 via i utero elektroporation med held induceret medulloblastom2. Til sammenligning den nuværende tilgang udstiller to store fordele: 1) Cas9 behøver ikke at blive leveret med plasmid, giver mulighed for flere gen målretning ved at udføre flere sgRNA udtryk kassetter i en enkelt plasmid i stedet; og 2) målcellerne og deres descendenter er permanent mærket med normal god landbrugspraksis, gør det muligt for visualisering af levende celler og analyse af funktionaliteten af omdanne tumor celler in vivo.
De mest kritiske trin i denne protokol er korrekt injektion af plasmid DNAs til den korrekte placering og levering af elektriske impulser til de relevante steder i hjernen. Cerebellare neuroner er født fra den cerebellare neuroepithelium sekventielt på en måde, fødselsdato-afhængige. Ikke alle former for celler i de cerebellare primordium kan være målrettet via elektroporation, fordi kun et bestemt tidspunkt vindue på E12.5-14,5 er teknisk muligt. Dybe cerebellare kerner neuroner og Purkinje celler har været kendt for at opstå på E10.5-11.5, når ekstra embryonale membraner ikke er gennemsigtig, og embryoet er ikke klart synlige for DNA injektion. Senere, unipolære børste celler er afledt af E17.5 øverste RL (uRL), når den fjerde ventrikel er for snævre til at injicere en tilstrækkelig mængde af DNA i nærheden af URL-adressen. Vores metode er således kun gælder på E12.5-14,5, som hovedsagelig er rettet mod midten af - og senere-født progenitorceller, som BNI og hæmmende interneurons. En anden ulempe ved metoden er, at en fuld knockout fænotype ikke eventuelt er muligt i forhold til Cre/LoxP-medieret kønscelleoverførsel GEMMs, da kun tusindvis af cerebellare celler kan blive ramt af elektroporation i hvert embryon.
I en tidligere undersøgelse celler cirka 80% af normal god landbrugspraksis-positive cerebellare granula tabt udtryk for målrettede gen12. Mens granula celler identitet blev bekræftet af molekylære markører og deres fordeling, denne identifikation, måske ikke er altid gældende, som gener af interesse kunne inddrages i markør udtryk og neuronal migration. Betinget aktivering af Cre ved hjælp af en celle-specifikke promotor ville løse problemet i dette tilfælde. Den nuværende allestedsnærværende Cbh promotor i pU6-sgRNA-CVH-Cre plasmid kan derfor erstattes med en celle-specifikke promotor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi sætter pris på Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim og Petra Schroeter for teknisk bistand. Vi takker også Drs. K. Reifenberg, K. Dell og P. Prückl for nyttige støtte til dyreforsøg på DKFZ; den Imaging Core faciliteter af DKFZ og Carl Zeiss Imaging Center i DKFZ for konfokalmikroskopi billeddannelse. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (til D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
