Summary
Études classiques de perte de la fonction des gènes à l’aide d’animaux knock-out ont souvent été coûteux et long. Axée sur l’électroporation de mutagenèse induite par CRISPR somatique est un outil puissant pour comprendre les fonctions de gènes in vivo. Nous rapportons ici une méthode pour analyser les phénotypes d’élimination directe dans les cellules en prolifération du cervelet.
Abstract
Malformation cérébrale est souvent causée par des mutations génétiques. Décrypter les mutations dans les tissus dérivés de patient a identifié des facteurs étiologiques potentiels des maladies. Pour valider la contribution d’un dysfonctionnement des gènes mutés au développement de la maladie, la génération de modèles animaux portant les mutations est une approche évidente. Alors que les cellules germinales génétiquement modèles murins (edged) sont populaires outils biologiques et présentent des résultats reproductibles, il est limité par le temps et les coûts. Pendant ce temps, non lignée germinale edged permettre souvent explorer la fonction du gène d’une manière plus réaliste. Depuis certains cerveau maladies (p. ex., tumeurs cérébrales) semblent résulter de somatique, mais pas de mutations germinales, non lignée germinale modèles de souris chimériques, où coexistent des cellules normales et anormales, pourraient être utiles pour l’analyse pertinente à la maladie. Dans cette étude, nous présentons une méthode pour l’induction de mutations somatiques CRISPR-négociée dans le cervelet. Plus précisément, nous avons utilisé le conditionnels souris knock-in, dans lequel Cas9 et GFP sont chroniquement activés par le promoteur de l' ACG (CMV enhancer/poulet ß-actine) après Cre-médiée par recombinaison du génome. Le seul individu-conçu-guide RNAs (sgRNAs) et la séquence de recombinase Cre, tous deux encodé dans une construction de plasmide, ont été livrés sur les cellules souches/progénitrices cérébelleux à un stade embryonnaire à l’aide de in utero électroporation. Par conséquent, cellules transfectées et leur fille ont été marquées avec la protéine fluorescente verte (GFP), facilitant ainsi approfondir les analyses phénotypiques. Par conséquent, cette méthode est non seulement montrant livraison axée sur l’électroporation génique sur les cellules embryonnaires cérébelleux mais propose également une nouvelle approche quantitative pour évaluer CRISPR induite par la perte de fonction phénotypes.
Introduction
Maladies du cerveau sont une des plus terribles maladies mortels. Ils résultent souvent de mutations génétiques et dérèglement subséquent. Pour comprendre les mécanismes moléculaires des maladies du cerveau, éternelle efforts pour déchiffrer les génomes des patients humains ont découvert un certain nombre de gènes potentiels. Jusqu’ici, modèles animaux de lignée germinale génie modifiées ont été utilisés pour in vivo gain de fonction (GOF) et l’analyse de la perte de fonction (LOF) de ces gènes candidats. En raison du développement accéléré des études de validation fonctionnelle, un plus faisable et plus souple en vivo test système génétique pour étudier la fonction du gène est souhaitable.
L’application d’un système de transfert in vivo génique à base électroporation pour le cerveau en développement de la souris est adaptée à cet effet. En fait, plusieurs études utilisant l’électroporation de in utero ont montré leur capacité à effectuer des analyses fonctionnelles dans les pays en développement cerveau1,2,3. En fait, plusieurs régions du cerveau de souris, comme le cortex cérébral4, rétine5, diencéphale6, hindbrain7, cervelet,8et9 de la moelle épinière ont été ciblées par livraison génique somatique approches, jusqu'à présent.
En effet, expression transitoire par électroporation de in vivo sur le cerveau des souris embryonnaires a longtemps été utilisée pour l’analyse GOF. Récente intégration génomique axée sur le transposon technologies encore permis à long terme et/ou conditionnelle expression des gènes d’intérêt10,11, qui est avantageux à disséquer la fonction du gène de façon spatiale et temporelle au cours développement. Contrairement à l’analyse GOF, analyse LOF a été plus difficile. Tandis que la transfection transitoire des siRNAs et porteurs de shARN Plasmides a été effectuée, les effets à long terme de LOF des gènes ne sont pas garantis en raison de la dégradation éventuelle de d’acides nucléiques exogènes introduites, telles que les plasmides et ARN doubles brins. Cependant, la technologie CRISPR/AR offre une percée dans les analyses LOF. Gènes codant pour des protéines fluorescentes (p. ex., GFP) ou bioluminescentes protéines (p. ex., luciférase firefly) ont été conjointement transfectées avec CRISPR-Cas9 et sgRNAs d’étiqueter les cellules exposées à des mutations somatiques CRISPR Cas9-médiation. Néanmoins, cette approche pourrait avoir de limites dans les études fonctionnelles sur les cellules en prolifération, car les gènes marqueurs exogènes sont dilués et dégradées après la prolifération à long terme. Alors que les cellules transfectées et leurs cellules filles subissent des mutations induites CRISPR dans leurs génomes, leurs empreintes pourraient se perdre au fil du temps. Ainsi, les approches étiquetage génétiques serait appropriées surmonter ce problème.
Nous récemment mis au point une méthode axée sur les CRISPR LOF dans les microglies cérébelleuses qui subissent une prolifération à long terme au cours de leur différenciation12. Pour étiqueter une génétiquement les cellules transfectées, nous avons construit un plasmide portant une sgRNA ainsi que de la Cre et introduit le plasmide dans le sembable Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP souris13 utilisant l’électroporation de dans l’utérus . À la différence des vecteurs de plasmide régulière encodage EGFP, cette approche avec succès marqué granule transfectée précurseurs de neurone (PNB) et leurs cellules-filles. Cette méthode fournit le grand soutien dans la compréhension en vivo la fonction des gènes d’intérêt dans les cellules en prolifération dans le développement normal du cerveau et un fond sujettes aux tumeurs.
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Protocol
Toutes les expériences sur des animaux ont été menées conformément à la réglementation du bien-être des animaux et ont été approuvés par les autorités responsables (Regierungspräsidium de Karlsruhe, numéros d’homologation : G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 et G133/14).
1. générer des plasmides pU6-sgRNA-Cbh-Cre
- Concevoir la sgRNA afin de cibler un gène d’intérêt selon le protocole publiées antérieurement14.
Remarque : Dans cette expérience, deux sgRNAs sont conçus pour cibler le gène Top2b de souris et un sgRNA de contrôle indifférenciés (tableau 1). À débouchure ou des gènes à l’aide de la technologie CRISPR, sgRNAs doivent être conçus pour cibler la séquence codante de la région 5' ou le domaine fonctionnel essentiel de la protéine. Un bon point de départ consiste à tester des séquences sgRNA pré-conçus accessibles au public, comme le GeCKO v2 souris knockout piscine bibliothèque15 du labo Zhang. Sinon, les sgRNAs peuvent être conçus à l’aide de logiciels disponibles publics tels que le site Web suivant : crispr.mit.edu. - Clone du sgRNAs dans le vecteur pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
Remarque : Le vecteur pU6-sgRNA-Cbh-Cre12 utilisée dans cette étude est dérivé de l' original du plasmide pX33016 en remplaçant la séquence codante de SpCas9 avec la recombinase Cre .- Synthétiser les deux ADN oligos comme suit. Sens : 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' ; Antisens : 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Remarque : Les 20 N de ci-dessus stand pour la séquence sgRNA. - Digérer pU6-sgRNA-Cbh-Cre avec BbsI pendant 30 min à 37 ° C à l’aide de réactifs suivants, charger l’échantillon digéré à un gel d’agarose à 1 % et les purifier à l’aide d’un kit d’extraction du gel. Utilisation 3 µg plasmide ; 3 µL Bbsje ; 1 µL FastAP ; 5 µL 10 x tampon de digestion ; Ajouter ddH2O pour porter le volume total à 50 µL.
- Phosphoryler et recuire chaque paire d’oligos de sgRNA à l’aide de réactifs suivants (10 µL du volume total) : 1 µL sur mesure sens oligo (100 mM) ; 1 µL personnalisé antisens oligo (100 mM) ; 1 µL 10 x T4 ligature tampon ; 6.5 µL ddH2O ; 0,5 ΜL T4 PNK. Incuber dans un thermo-cycler pendant 30 min à 37 ° C et 5 min à 95 ° C, puis rampe jusqu'à 25 ° C à 5 ° C/min.
- Mettre en place la réaction suivante de la ligature et incuber pendant 10 min à température ambiante (10 µL du volume total) : X µL Bbsj’ai digéré le plasmide (50 ng) ; 1 µL phosphorylée et recuit, oligo duplex (dilution 1 : 200) ; 5 µL 2 x tampon de ligature ; X µl FD2O ; Ligase rapide de 1 µL.
- Ajouter 2 µL du produit de ligation dans 50 µL de cellules de DH5α Escherichia coli chimiquement compétents. Après 30 min d’incubation sur la glace, chaleur choquer l’échantillon de 90 s à 42 ° C et incuber pendant 2 minutes sur la glace. Ajouter 100 µL de milieu LB et il plaque sur un plat de livre contenant 100 ampicilline µg/mL.
Remarque : L’intégration de la séquence de sgRNA dans le plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre s’effectue selon les étapes de clonage pour le plasmide de pX33014. - Ensemencer les deux colonies, chacun dans 2 mL de milieu LB à 37 ° C pendant au moins 6 h et effectuer un isolement d’ADN de mini-préparent à l’aide d’un kit.
- Sanger séquencer l’ADN de mini-préparent à l’aide de l’apprêt hU6-Forward et identifier les colonies avec la pose adéquate des sgRNAs en s’alignant sur la séquence indiquée à l’étape 1.2.1. La séquence d’amorçage est indiquée dans le tableau 1. Plasmides utilisés dans cette étude ont été nommés pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre et pU6-sgControl-Cbh-Cre.
- Ensemencer les colonies correctement identifiés et purifier l’exempte d’endotoxine ADN plasmidique pour in utero électroporation, utiliser un kit, par exemple, de Qiagen. Éluer l’ADN avec exempte d’endotoxine-tampon TE dilué dans ddH2O à 01:10 (tampon de TE 10 %). La concentration d’ADN du plasmide doit être supérieure à 2 mg/mL.
Remarque : Ne pas utiliser un kit maxi-prep régulier pour la préparation de l’ADN. Plasmide-solutions à 4 ° C pour une utilisation régulière à court terme (jusqu'à 4 semaines), ou partie aliquote du stocker un volume approprié environ 25 µL et conserver à-20 ° C pour le stockage à long terme.
- Synthétiser les deux ADN oligos comme suit. Sens : 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3' ; Antisens : 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. tester l’efficacité de la sgRNAs en utilisant le système de plasmide EGxxFP
Remarque : L’efficacité de le sgRNAs est normalement testée par l’arpenteur-géomètre ou T7E1 (T7 endonucléase I) essais. Dans le présent protocole, est utilisée une autre méthode simple et efficace. La clé de cette approche consiste à utiliser le plasmide pCAG-EGxxFP qui contient des fragments de EGFP superposés séparés par une séquence d’ADN contenant le sgRNA site17de ciblage. Sur l’expression du pCAG-EGxxFP ainsi que les sgRNA et Cas9 dans les cellules transfectées, la rupture induite par le Cas9 double brin (DSB) dans la séquence cible est réparée par des mécanismes dépendants d’homologie endogènes, qui reconstitue l’expression EGFP cassette.
- Concevoir des amorces pour amplifier la région génomique centrée avec la sgRNA ciblant les séquences. L’amplicon PCR est environ 500 bp. Dans cette expérience, un assemblage de l’ADN a été appliqué pour cloner un fragment amplifié par PCR dans le plasmide pCAG-EGxxFP.
Remarque : Vous pouvez également des sites de restriction appropriée peuvent être ajoutés à l’extrémité 5' des amorces PCR. Sites de restriction disponible dans le vecteur pCAG-EGxxFP sont BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI et EcoRV. - Amplifier l’ADN génomique avec des amorces conçues à l’aide de la forme et les paramètres PCR ci-dessous. Charger l’échantillon (19,7 µL H2O ; 0,3 µL de 10 ng/µL ADN génomique de souris ; 2,5 µL 10 µM 2,5 µL 10 µM ; EGxxFP-Top2b-F EGxxFP-Top2b-R ; 25 µL 2 X mélange maître PCR ; volume total de 50 µL) sur un gel d’agarose de 1 % de gel et gel-purifier les fragments PCR à l’aide d’un kit d’extraction du gel. Utiliser la réaction suivant conditions : 95 ° C pendant 3 min ; puis 35 x cycles de 98 ° C pendant 20 s, 60 ° C pendant 15 s, 72 ° C pour 20 s et 72 ° C pendant 1 minute ; 4 ° C, indéfiniment.
Remarque : Dans cette expérience, une région dans l’exon 1 de la Top2b a été amplifiée ; trouver les séquences des amorces dans le tableau 1. - Digest le vecteur pCAG-EGxxFP avec des enzymes de restriction BamHI et EcoRI pendant 2 h à 37 ° C, puis charger l’échantillon sur un gel d’agarose de 1 % de gel et gel-purifier l’épine dorsale de vecteur à l’aide d’un kit d’extraction du gel. Utiliser des réactifs suivants (volume total de 50 µL) : X µL plasmide (3 µg) ; 2 µL BamHI ; 2 µL EcoRI ; 5 µL 10 x tampon ; X µl FD2O.
- Mettre en place l’ADN Assemblée réaction18 selon les instructions du fabricant et transformer en DH5α compétentes d' Escherichia coli.
- Inoculer les deux colonies, chacun en 2 mL de milieu LB à 37 ° C pendant au moins 6 h, effectuer un isolement d’ADN de mini-préparent à l’aide d’un kit, par exemple, de Qiagen et identifier les colonies avec l’insertion correcte (ci-après dénommée pCAG-EG-Top2b-FP) à l’aide de Sanger séquençage avec l’amorce de EGxxFP-Top2b-F.
- Transfecter de cellules HEK293T.
- Cellules de semences le HEK293T dans une plaque de 24 puits 24h avant la transfection.
NOTE : A cultivé des cellules dans un incubateur à 37 ° C cellule avec 5 % CO2, en DMEM avec supplément de glutamine contenant 10 % de SVF et 1 % la pénicilline/streptomycine. Veiller à ce que les cellules sont confluents de 60 % le jour de la transfection. Dans cette expérience, nous avons utilisé des cellules HEK293T self-made, exprimant de manière stable SpCas9 pour tester pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Cependant, les cellules HEK293T type sauvage peuvent être utilisés si un vecteur d’expression SpCas9 est fourni. - Transfecter les cellules HEK293T utilisant le réactif de polyéthylènimine (PEI). Transfecter les cellules avec 120 ng/puits de plasmide pCAG-EG-Top2b-FP12 et 120 ng/puits de pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre ou pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre dans une plaque 24 puits. Mélanger le plasmide DNAs et le 1,8 µL de réactif de PEI pour 80 µL de milieu DMEM sans additifs glutamine complètent et incuber pendant 15 min à température ambiante après agitation.
- 6 h après la transfection, retirez le support et remplacez par un milieu frais.
- Surveiller la présence de cellules vivantes de GFP+ 48 h après la transfection, à l’aide d’un microscope à fluorescence avec grossissement de 20 x.
Remarque : Le nombre de cellules GFP+ mesure l’efficience de ciblage de la sgRNA. Résultats des sgRNAs efficaces et inefficaces (sgTop2b-1 et sgTop2b-2, respectivement) sont indiquées dans la Figure 2 a.
- Cellules de semences le HEK293T dans une plaque de 24 puits 24h avant la transfection.
3. effectuer In Utero électroporation
- Se reproduisent 6 à 8 semaines des souris et de préparer les outils dans l’utérus de l’électroporation. Traverser les mâles homozygotes Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP souris avec souris CD-1 femelles. Durée de la grossesse des souris CD-1 dès le jour de que la fiche vaginale est détecté (E0.5). Les embryons sont électroporés à jour E13.5.
- Tirez des capillaires en verre borosilicate (diamètre intérieur : 0,6 à 0,8 mm) avec un micropipettes. Utilisez les paramètres suivants : P = 500, chaleur = 560, Pull = 150, Vel = 75, temps = 250. Étiquetez la pointe capillaire à l’encre noire pour meilleure visualisation pendant l’injection. Couper le cône capillaire sous un stéréomicroscope à l’aide d’une règle et forte aiguille pincettes et couper la pointe à une longueur d’environ 6 mm.
- Maintenir l’unité des capillaires pour garder l’expérience reproductible. Créer un bord biseauté unilatéral pendant la coupe. La pointe doit être aussi claire que possible pour faciliter la pénétration de la paroi utérine et pour éviter d’endommager les tissus de l’embryon.
NOTE : Également utiliser une micro meuleuse pour régler un angle de 35°19. Les capillaires peuvent être stockés à température ambiante dans une boîte de Pétri sous conditions exempts de micro-organismes pathogènes de 10 cm. - Stériliser les instruments chirurgicaux.
- Mélanger les sgRNA-plasmides à parts égales avec pT2K-IRES-Luc à une concentration finale d’au moins 1 µg/µL de chaque plasmide et couleur la plasmide-solution rapide vert (concentration finale de 0,05 %). Préparer 1 % vert rapide solution avec l’eau distillée sans endotoxine et filtre par un filtre de 0,22 µm pour enlever les particules de colorant de la solution.
NOTE : Transfection Co de pT2K IRES-Luc est facultative, mais permet l’identification des animaux d’électroporation viable après la naissance, en utilisant l’imagerie de la bioluminescence. S’il vous plaît voir l’étape 3.5. Préparer une quantité suffisante de plasmide-mix pour le nombre total de souris gravides à être exploité. Utiliser environ 15-20 µL mélanger par souris (~ 12 embryons). Procéder immédiatement à la chirurgie.
- Préparer les souris d’une intervention chirurgicale.
- Anesthésier enceintes souris CD-1 à l’isoflurane. Induire l’anesthésie dans une boîte avec 3-4 % en volume isoflurane (débit d’oxygène : 1,5 L/min) et l’entretenir avec 2 % en volume-pendant l’intervention par l’intermédiaire de coiffe.
Remarque : La chirurgie complète ne devrait pas prendre plus de temps que 30 min. réduire le nombre d’injection et d’embryons de l’électroporation, si nécessaire. Utiliser des gants stériles pour la chirurgie. - Placez la souris sur le dos sur un coussin chauffant et ajuster l’anesthésie.
- Injecter l’analgésique (métamizol, 800 mg/kg de poids corporel, voie sous-cutanée (s.c.), dépôt de 24h).
Remarque : Vous pouvez utiliser les autres analgésiques autorisés que métamizol. - Appliquer la pommade ophtalmique pour empêcher les yeux-sécheresse pendant la chirurgie.
- Fixer les branches avec du ruban et stériliser l’abdomen avec un désinfectant. Couvrir la souris avec de la gaze, laissant uniquement la zone chirurgicale exposée. L’éthanol à 70 % répartie entre gaze et zone chirurgicale.
- Faire une incision cutanée d’environ 2 cm de longueur et creuser l’écart délicatement avec des ciseaux chirurgicaux tout droit. Localiser la linea alba et faire une seconde incision légèrement plus petite par l’intermédiaire du péritoine à l’aide de tissus ciseaux à pointe émoussée.
- Humecter la cavité abdominale ouverte avec pré chauffé stérile 1 x PBS.
- Extrayez soigneusement les cornes utérines de la cavité abdominale à l’aide de pinces à anneau. Tirer doucement en saisissant la paroi utérine uniquement à l’écart entre le sac vitellin des voisins de deux embryons. Éviter toute pression sur l’embryon tout en tirant à travers l’incision. Agrandir l’incision, si nécessaire et faites particulièrement attention à positionner les cornes utérines sur l’abdomen tout en compressant ne pas le flux sanguin dans l’artère utérine.
Remarque : Dans certains cas, il est conseillé de les extraire une corne utérine à la fois et la remplacer avant de procéder à la deuxième corne utérine.
- Anesthésier enceintes souris CD-1 à l’isoflurane. Induire l’anesthésie dans une boîte avec 3-4 % en volume isoflurane (débit d’oxygène : 1,5 L/min) et l’entretenir avec 2 % en volume-pendant l’intervention par l’intermédiaire de coiffe.
- Injection et électroporation de plasmide DNAs
- Aspirer environ 15 µL de plasmide-solution colorée avec le verre prêt capillaire. Éviter les bulles d’air au cours de ce processus.
Remarque : La plasmide-solution peut obstruer la pointe facilement si sa concentration est élevée. Tester le capillaire en libérant certains ADN juste avant l’injection. - Doucement, maintenez l’embryon avec une pince anneau et localiser la région du cou.
Remarque : Si l’embryon se trouve dans une position difficile à injecter, ignorez-la et aller chercher l’embryon prochain. Accrue de repositionnement de l’embryon peut augmenter les chances de dommages pour eux. - Percer lentement avec la pointe du verre préalablement préparée capillaire dans le quatrième ventricule en pénétrant à travers le cerveau postérieur dorsale et par la suite injecter environ 1 µL du mélange plasmide. Confirmer que l’ADN de teint n’est pas coulée dans le cerveau et apparaît sous forme d’un diamant en forme de structure.
Remarque : En option, utilisez 2,5 loupes pour meilleure visualisation du quatrième ventricule et entourant les vaisseaux sanguins. Délivrer des impulsions électriques immédiatement après l’injection pour éviter la diffusion de la plasmide-solution aux autres ventricules. - Appliquer des impulsions électriques de carrés (5 impulsions, 32 mV, 50 ms-sur, 950 ms-off) avec des pinces comme platine pincettes (voir Table des matières). Placer les électrodes latéralement avec le pôle négatif portant sur l’oreille et le pôle positif positionné au primordium cérébelleux au cours de la paroi utérine. Utilisez 5 plaques d’électrodes de mm de diamètre pour l’électroporation efficace des embryons E13.5.
NOTE : Augmenter le taux de survie des chiots en manipulant de moins de 2/3rd relatif au nombre total d’embryons par barrage. Évitez de trop près des embryons au col utérin. Si manipulé, ils pourraient entraîner des complications pendant l’accouchement et compromettre la litière entière. Si les électrodes sont trop chère de l’embryon, cela peut provoquer un arrêt cardiaque.
- Aspirer environ 15 µL de plasmide-solution colorée avec le verre prêt capillaire. Éviter les bulles d’air au cours de ce processus.
- Soins post-électroporation et post-chirurgie
- Placer soigneusement les cornes utérines dans la cavité abdominale et remplissez-le préchauffée stérile 1 x PBS. Faites entrer les cornes utérines dans une position naturelle.
- Fermer le péritoine et la peau séparément avec une simple suture continue.
Remarque : Faire attention à ne pas à percer la paroi utérine pendant la suture du péritoine. - Arrêt l’anesthésie et placez l’animal vers le bas ventre dans une nouvelle cage.
- Surveiller l’animal au cours de la phase de réveil et encore 24h après la chirurgie. Placez la cage sous une lampe chauffante, si le tremblement ne s’améliore pas dans un délai de 15 min et que l’animal ne démarre pas de toilettage.
- Confirmer électroporation réussie par imagerie de la luciférase.
- Assurez-vous que les barrages exploités drop embryons à l’heure (à E19.5).
Remarque : La date de naissance peut être retardée au lendemain sans doute à cause de l’opération. - Anesthésier les chiots d’électroporation (P5-P7) avec 2,5 % isoflurane et injecter (intrapéritonéale (i.p.)) avec D-luciférine (3 mg/kg de poids corporel) 5 min avant l’imagerie.
- Détecter les signaux de la luciférase dans les chiots d’électroporation à l’aide de l’imageur de bioluminescence.
NOTE : Un temps d’exposition de 1 min est suffisant pour détecter le signal de la luciférase. Radiance (p/s/cm2/sr) est environ > 1 x 106.
- Assurez-vous que les barrages exploités drop embryons à l’heure (à E19.5).
4. préparer des Cryosections de l’électroporation sembable
- Euthanasier les chiots de P7 électroporation et disséquer sur le cervelet.
NOTE : Le signal GFP peut être observé à l’aide d’un stéréoscope épifluorescence. - Difficulté le sembable du jour au lendemain en 5 mL par cerveau de 4 % PFA dans du PBS à 4 ° C.
- Transférer le sembable fixe nuit à 10 mL par le cerveau de 30 % de saccharose dans du PBS à 4 ° C.
NOTE : Le tissu doit atteindre le fond d’un tube de 15 mL après incubation dans la solution de saccharose. - Après le trempage de la solution de saccharose restant avec un morceau de papier filtre cellulose, immerger le cervelet à une température de coupe optimale (OCT), composé dans un moule en plastique jetable et congeler sur la glace sèche. Le bloc cryogénique peut être conservé à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici. - Couper le bloc cryogénique en sections avec 10 µm d’épaisseur à l’aide d’un cryostat et garder les sections à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.
Remarque : On peut confirmer expression de la GFP dans les sections, après emportant l’OPO composé avec du PBS.
5. Immunostaining des Cryosections
- Sécher les lames à ambiant pendant 30 min et laver deux fois pendant 10 min dans du PBS.
- Entourez les sections avec un stylo liquide bloqueur et incuber les sections dans une solution de blocage (10 % de sérum normal âne dans du PBS contenant 0,1 % Triton-X100) pendant 1 h à température ambiante.
- Ajouter des anticorps primaires contre les molécules d’intérêt (p. ex., GFP et topoisomérase II beta (Top2B) dans cette étude) dans la solution de blocage et incuber une nuit à 4 ° C.
Remarque : Les noms et les concentrations d’anticorps utilisés sont répertoriées dans la Table des matières. Afin de renforcer les signaux de la GFP, un anticorps anti-GFP peut être éventuellement utilisé ainsi que les autres anticorps. - Laver les lames avec 0,1 % contenant du Triton PBST 3 X 10 min. laisser incuber les sections pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps secondaire conjugué fluorophore, dilué dans la solution de saturation contenant DAPI.
- Laver les diapositives dans du PBS 3 X pour 10 min. de Mont les diapositives et conserver à 4 ° C jusqu’en imagerie.
Remarque : Le protocole peut être suspendu ici.
6. imagerie et analyse
- Les sections à l’aide d’un microscope confocal à un grossissement de 20 x de l’image.
- Compter le nombre de cellules positives GFP perdre l’expression de la protéine cible. Une image représentative est montrée dans la Figure 2 b.
- Vérifier le phénotype moléculaire après ablation des gènes de cible dans le PNB et leurs progénitures par immuostaining,12.
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Representative Results
Analyse fonctionnelle in vivo , il est essentiel d’identifier les cellules qui gène exogène (s) ont été introduites. Si l’expression d’un marqueur, comme GFP dans des cellules non-proliférantes peut être suivis pendant une longue période de temps, le signal se perd dans l’ordre dans les cellules en prolifération. Une illustration de cet effet est illustrée dans la Figure 1. Pour contourner la perdre l’empreinte des cellules transfectées dans les analyses LOF, nous avons développé une approche originale en combinant prestation axée sur l’électroporation gène avec la technologie CRISPR/Cas9.
Résultats représentatifs sont indiquées à la Figure 2. Fonctionnalité des constructions plasmide est testée par transfection transitoire de pU6-sgTop2b-Cbh-Cre et pCAG-EG-Top2b-FP17, transportant la séquence cible de sgTop2b, dans HEK293T cellules exprimant de manière stable SpCas9 (Figure 2 a). L’activité de l’endonucléase de Cas9 guidée par sgRNA induit induite par l’ORD de réparation axés sur l’homologie de la cassette d’expression EGFP. Par conséquent, la fonction de la sgRNA a été analysée directement par détection de l’expression de la GFP. Selon Mashiko et coll., une efficacité de transfection de plus de 30 % détermine un sgRNA efficace17.
PNB sont issus de la lèvre rhombique (RL), une région frontalière avec le toit du quatrième ventricule aux stades embryonnaires E12.5 jusqu’au E16.5. Ces cellules ont été connus pour subir une prolifération massive après la naissance dans la couche granulaire externe externe (oEGL) et le déplacement vers l’intérieur EGL (iEGL) après être sorti du cycle cellulaire20. Ainsi, le PNB sont un exemple approprié pour tester les avantages de notre approche étiquetage génétique.
En suivant ce protocole, dans l’utérus l’électroporation des PNB permet un traçage des cellules édités avec GFP. Nous avons introduit le plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre exprimant sgControl dans le primordium de cervelet de souris Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP au stade embryonnaire E13.5. Souris ont été sacrifiées à jour après la naissance, P7, et des coupes sagittales des sections de tissu cérébelleux étaient tachés par immunohistochimie. EGL interne et externe ont été définis par expression Ki67 (oEGL) et l’expression de p27 (iEGL), respectivement. Malgré subissant la prolifération et la maturation, les neurones matures granule cérébelleux (SCT) a conservé encore forte expression de la GFP (Figure 2 b).
Mettant l’accent sur l’utilité de ce protocole, nous avons utilisé en outre le sgRNA DNA Top2b comme exemple représentatif de ciblage. Des procédures expérimentales ont été effectuées tel que décrit plus haut (voir Figure 2 b). La plupart des cellules transfectées avec sgRNAs pour Top2b GFP-positifs présentait une perte d’expression de Top2b dans la couche granulaire interne (IGL), tandis que l’introduction du contrôle sgRNAs n’a pas abouti à une nette diminution de son expression (Figure 2). Une quantification de ce résultat est illustrée dans la Figure 2D. Ces données présentent un outil précieux pour le suivi des cellules édités pendant une longue période de temps pendant la formation de développement ou une tumeur.
Figure 1 : représentation schématique de l’expression de la GFP dans les cellules prolifèrent et non-proliférantes. (A) lorsqu’un gène exogène qu'encodage GFP (p. ex., pCAG-EGFP) est transfecté dans des cellules non-proliférantes, les cellules peut-être exprimer GFP pendant une longue période (haute voie). Pendant ce temps, expression de la GFP pourrait disparaître dans les cellules en prolifération due à la dilution des exogènes GFP (voie du milieu). En revanche, les cellules qui transportent le transgène LoxP-Stop-LoxP-GFP (LSL-GFP) peuvent garder l’expression de la GFP durant la prolifération après la transfection avec recombinase Cre (voie basse). Souche de souris (B), le principe de silençage génique médiée par les SpCas9 et expression de la GFP après transfection Cre et sgRNA dans un Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : images représentatives des résultats du présent protocole. (A) HEK293T exprimant de manière stable SpCas9 des cellules ont été transfectées avec les plasmides pU6-sgTop2b-Cbh-Cre et pCAG-EG-Top2b-FP. Expression de la GFP dans des cellules vivantes a été contrôlée au moyen d’un imageur de cellule fluorescente (voir Table des matières) 48 h après la transfection. Panneaux gauche et droit montrent une séquence de sgRNA efficaces et inefficaces basée sur l’expression de la GFP, respectivement. Barreaux de l’échelle : 100 µm. (B) Immunostaining des GFP, Ki67 et p27 sur le sembable P7 d’une souris Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP soumis à électroporation à E13.5 avec des constructions pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide exprimant le contrôle sgRNA. La section est Eosine au DAPI (bleu). Barreaux de l’échelle : 50 µm ; grossissement de 20 x. Remarque les cellules exprimant GFP dans l’oEGL marquée par Ki67. (C) Immunostaining des GFP (green) et Top2b (magenta) sur le sembable P7 d’une souris Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP qui était électroporés à E13.5 avec le plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre construit exprimant sgRNA contre Top2b (sgTop2b) et un séquence de contrôle (sgControl). Les flèches indiquent Top2b expression dans les cellules GFP+ dans le même domaine. Barreaux de l’échelle : 20 µm ; grossissement de 20 x. Quantification des Top2b (D) dans les cellules d’électroporation (GFP-positif) dans des expériences de sgControl et sgTop2b. Deux ou trois petits ont été étudiés pour sgControl et sgTop2b, respectivement, et 25 cellules de chaque cerveau ont été analysés. Barres d’erreur représentent ± écart-type de la moyenne (SEM) et les p-valeurs ont été calculées par non apparié t-test, *p = 0,0002. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Nom | Séquence | Application | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | séquence cible sgRNA | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | séquence cible sgRNA | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | séquence cible sgRNA | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Clonage dans pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Clonage dans pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Séquençage pour sgRNA | |
Tableau 1 : Séquences d’oligos utilisée dans cette étude.
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Discussion
Utilisant l’exo utero électroporation, nous avons déjà rapporté axée sur les siARN in vivo des analyses fonctionnelles de Atoh1 à un stade précoce des granules de cérébelleux cellulaire différenciation8. En raison de la dilution et la dégradation des siARN et l’exposition des embryons à l’extérieur de la paroi utérine, analyse phénotypique de l’électroporation microglies se limitait aux stades embryonnaires. Toutefois, la méthode actuelle activé analyse du phénotype des animaux après la naissance.
Notre étude précédente a démontré que knockout Cas9-mediated de suppresseur de tumeur Ptch1 via in utero électroporation avec succès induite un médulloblastome2. En comparaison, l’approche actuelle présente deux atouts majeurs : 1) Cas9 ne doit pas être livré avec le plasmide, permettant le ciblage de gènes multiples en effectuant plusieurs cassettes d’expression de sgRNA dans un plasmide à la place. et 2) analyse du comportement de la transformation tumorale in vivode cellules et les cellules cibles et leurs progénitures en permanence signalées avec GFP, permettant la visualisation des cellules vivantes.
Les étapes plus critiques du présent protocole sont l’injection correcte du plasmide DNAs dans l’emplacement correct et la livraison des impulsions électriques dans les emplacements appropriés dans le cerveau. Neurones cérébraux sont nées de la cérébelleuse neuroépithélium séquentiellement en fonction de la date de naissance. Pas tous les types de cellules dans le primordium cérébelleux peuvent être ciblés par électroporation, parce que seulement une fenêtre de temps spécifique à E12.5-14,5 est techniquement faisable. Les neurones des noyaux cérébelleux profonds et des cellules de Purkinje ont été connus pour se poser à E10.5-11,5, lorsque les membranes embryonnaires extra ne sont pas transparents, et l’embryon n’est pas clairement visible pour l’injection de l’ADN. Plus tard, brosse unipolaire cellules proviennent de E17.5 RL supérieur (uRL), lorsque le quatrième ventricule est trop étroite pour injecter une quantité suffisante d’ADN dans le voisinage de l’uRL. Ainsi, notre méthode est uniquement applicable à E12.5-14,5, qui cible principalement les progéniteurs de milieu - et plus tard-nés, tels que le PNB et des interneurones inhibiteurs. Un autre inconvénient de la méthode est qu’un phénotype knockout complète ne peut être réalisable par rapport aux cellules germinales Cre/LoxP-mediated edged, puisque seuls des milliers de cellules cérébelleux peuvent être ciblés par électroporation dans chaque embryon.
Dans une précédente étude, environ 80 % des granules cérébelleuse de GFP-positive cellules perdues d’expression du gène ciblé12. Alors que l’identité des cellules granule a été confirmée par des marqueurs moléculaires et leur distribution, cette démarche d’identification peut-être pas toujours applicable, car les gènes d’intérêt pourraient être impliqués dans l’expression de marqueurs et de la migration neuronale. L’activation conditionnelle de Cre à l’aide d’un promoteur spécifique des cellules résoudrait le problème dans ce cas. Par conséquent, le promoteur actuel de Cbh omniprésent dans le plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre peut être remplacé par un promoteur spécifique des cellules.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous apprécions Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim et Petra Schroeter pour l’assistance technique. Nous remercions également Drs K. Reifenberg, K. Dell et P. Prückl d’une aide précieuse pour l’expérimentation animale au DKFZ ; l’imagerie installations centrales le DKFZ et le centre de formation image de Carl Zeiss dans le DKFZ pour l’imagerie de la microscopie confocale. Ce travail a été soutenu par la Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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