Summary
Konventionella förlust-av-funktion studier av gener med knockout djur har ofta kostsamma och tidskrävande. Elektroporation-baserade CRISPR-medierad somatiska mutagenes är ett kraftfullt verktyg att förstå genen fungerar i vivo. Vi rapporterar här, en metod att analysera knockout fenotyper i prolifererande celler av lillhjärnan.
Abstract
Hjärna missbildning är ofta orsakas av genetiska mutationer. Dechiffrera mutationerna i patientderiverade vävnader har identifierat potentiella orsakande faktorer av sjukdomar. För att validera en dysfunktion av muterade generna att sjukdomsutvecklingen bidrag, är generationen av djurmodeller som transporterar mutationerna en självklar strategi. Medan könsceller genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är populära biologiska verktyg och uppvisar reproducerbara resultat, den är begränsad av tid och kostnader. Under tiden aktivera icke-könsceller GEMMs ofta utforska geners funktion i ett mer genomförbart sätt. Sedan några hjärnans sjukdomar (t.ex., hjärntumörer) tycks resultera från somatiska men inte könsceller mutationer, icke-könsceller chimär musmodeller, där normala och onormala celler samexistera, kunde vara till hjälp för sjukdom-relevanta analyser. I denna studie redovisar vi en metod för induktion av CRISPR-medierad somatiska mutationer i lillhjärnan. Specifikt, utnyttjade vi villkorlig inpressning möss, där Cas9 och god Jordbrukarsed kroniskt aktiveras av CAG (CMV förstärkare/kyckling ß-aktin) Arrangören efter Cre-medierad rekombination av genomet. Egendesignade singel-guiden RNAs (sgRNAs) och Cre recombinase sekvensen, båda kodade i en enda plasmid konstruktion, levererades till lillhjärnan stjälk/stamceller på ett embryonala Stadium använder Utero elektroporation. Följaktligen, transfekterade celler och deras dotter celler var märkt med grönt fluorescerande protein (GFP), vilket underlättar ytterligare fenotypiska analyser. Därför, denna metod är inte bara visar elektroporation-baserade gen leverans till embryonala cerebellär celler men föreslår också en ny kvantitativ metod för att bedöma CRISPR-medierad förlust-av-funktion fenotyper.
Introduction
Sjukdomar i hjärnan är en av de mest fruktansvärda dödliga sjukdomarna. De resulterar ofta från genetiska mutationer och efterföljande dysreglering. För att förstå molekylära mekanismer för sjukdomar i hjärnan, har evig ansträngningar att dechiffrera genomen hos mänskliga patienter upptäckt ett antal potentiella orsakande gener. Könsceller genetiskt manipulerade djurmodeller har hittills utnyttjats för i vivo gain-of-function (GOF) och förlust-av-funktion (LOF) analyser av sådana kandidatgener. På grund av påskyndade utvecklingen av funktionella valideringsstudier är en mer genomförbar och flexibla i vivo gen analyssystem för att studera geners funktion önskvärt.
Tillämpningen av en överföring i vivo elektroporation-baserade gen system till hjärnans utveckling mus är lämplig för detta ändamål. I själva verket visat flera studier använder Utero elektroporation sin potential att göra funktionella analyser i den utvecklande hjärna1,2,3. Faktiskt, flera regioner i mus hjärnan, såsom cerebral cortex4, retina5, diencephalon6, hindbrain7, lillhjärnan8och ryggmärgen9 har varit föremål för somatisk gen leverans metoder, hittills.
Faktiskt, övergående genuttryck av i vivo elektroporation på embryonala mus hjärnor har länge använts för GOF analys. Senaste transposon-baserade genomisk integrationsteknik ytterligare aktiverat långsiktiga eller villkorliga uttrycket av gener av intresse10,11, vilket är fördelaktigt att dissekera genfunktion rumsliga och tidsmässiga tillfällen under utveckling. I motsats till GOF analys, har LOF analys varit mer utmanande. Medan övergående transfection av siRNAs och shRNA-carrying plasmider utfördes, garanteras långsiktiga effekter av LOF gener inte på grund av eventuell nedbrytning av exogent introducerade nucleic syror, såsom plasmider och dsRNAs. Den CRISPR/Cas-teknologin ger dock en break-through i LOF analyser. Gener som kodar för fluorescerande proteiner (t.ex., GFP) eller självlysande proteiner (t.ex., firefly luciferas) har transfekterats tillsammans med CRISPR-Cas9 och sgRNAs att märka cellerna exponeras för CRISPR-Cas9-medierad somatiska mutationer. Dock kan detta tillvägagångssätt ha begränsningar i funktionella studier på prolifererande celler, eftersom exogena markörgener är utspädd och förstörd efter långsiktig spridning. Medan de transfekterade cellerna och deras dotterceller genomgår CRISPR-inducerade mutationer i deras genom, kan deras fotspår gå förlorade över tid. Således, märkning metoder skulle vara lämpliga att övervinna problemet.
Vi har nyligen utvecklat en CRISPR-baserade LOF metod i lillhjärnan granule celler som genomgår långsiktig spridning under deras differentiering12. Etikettera genetiskt transfekterade cellerna, vi konstruerade en plasmid som bär en sgRNA tillsammans med Cre och införas i cerebella av Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP möss13 använda Utero elektroporation Plasmiden. Till skillnad från vanliga plasmid vektorer kodning andra, denna strategi framgångsrikt märkt transfekterade granule neuron prekursorer (BNI) och deras dotterceller. Denna metod ger bra stöd i förståelsen i vivo geners funktion av intresse i prolifererande celler i hjärnans normala utveckling och en tumör-benägen bakgrund.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utfördes enligt djurskyddsbestämmelserna och har godkänts av de ansvariga myndigheterna (Regierungspräsidium Karlsruhe, godkännandenummer: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14, och G133/14).
1. generera pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmider
- Design av sgRNA rikta en gen-of-intresse enligt den tidigare publicerade protokoll14.
Obs: I detta experiment, två sgRNAs är utformade för att rikta mus Top2b gen och en icke-riktad kontroll sgRNA (tabell 1). Knockout gene(s) med hjälp av CRISPR-teknik, måste sgRNAs vara utformade för att rikta antingen den kodande sekvensen av regionen 5' eller väsentliga funktionella domänen av proteinet. En bekväm utgångspunkt är att testa offentligt tillgängliga fördesignade sgRNA sekvenser, som GeCKO v2 mus knockout pool bibliotek15 från Zhang lab. Alternativt sgRNAs kan utformas med offentlig tillgänglig programvara såsom följande webbplats: crispr.mit.edu. - Klona sgRNAs in pU6-sgRNA-Cbh-Cre vektorn.
Obs: De pU6-sgRNA-Cbh-Cre vector12 används i denna studie härleds från den ursprungliga pX330 plasmid16 genom att ersätta den kodande sekvensen av SpCas9 med den Cre -recombinase.- Syntetisera två DNA oligos enligt följande. Känsla: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Obs: 20 N är ovan står för den sgRNA sekvensen. - Smälta pU6-sgRNA-Cbh-Cre med BbsI under 30 minuter vid 37 ° C med följande reagens, Ladda smält provet till en 1% agarosgel och rena dem med en gel-utvinning kit. Använd 3 µg Plasmid; 3 µL BbsI. 1 µL FastAP; 5 µL 10 x matsmältningen buffert; Lägg till ddH2O för att få den totala volymen till 50 µL.
- Fosforylera och glödga varje par av sgRNA oligos med följande reagens (10 µL totala volym): 1 µL anpassad känsla oligo (100 mM); 1 µL anpassade antisense oligo (100 mM); 1 µL 10 x T4 Ligation buffert; 6.5 µL ddH2O; 0,5 ΜL T4 PNK. Inkubera i en thermo-apparat under 30 minuter vid 37 ° C, och 5 min vid 95 ° C, och sedan ramp ner till 25 ° C vid 5 ° C/min.
- Ställ in följande ligering reaktion och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur (10 µL totala volym): X µL Bbsjag smält plasmid (50 ng); 1 µL fosforyleras och glödgas, oligo duplex (spädning 1: 200); 5 µL 2 x ligering buffert; X µl ddH2O; 1 µL snabb ligase.
- Tillsätt 2 µL av ligering produkten i 50 µL av kemiskt behöriga DH5α Escherichia coli celler. Efter 30 min inkubering på is, värme chock provet för 90 s vid 42 ° C, och inkubera i 2 min på is. Tillsätt 100 µL av LB medium och platta det på LB plåt innehållande 100 µg/mL ampicillin.
Obs: Integrationen av sgRNA sekvensen i pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmiden utförs enligt kloning steg för pX330 plasmid14. - Inokulera två kolonier, var i 2 mL LB medium vid 37 ° C i minst 6 h, och utföra en mini prep DNA isolering med ett kit.
- Sanger sekvens mini prep DNA använder hU6-Forward primer och identifiera kolonier med rätta införandet av sgRNAs genom att justera med sekvensen visas i steg 1.2.1. Primer sekvensen visas i tabell 1. Plasmider som används i denna studie namngavs pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre och pU6-sgControl-Cbh-Cre.
- Inokulera korrekt identifierade kolonierna och rena endotoxinfria plasmiden DNA för i livmodern elektroporation använda ett kit, t.ex., från Qiagen. Eluera DNA med endotoxinfria TE-buffert utspätt i ddH2O 1:10 (10% TE buffert). DNA koncentrationen av Plasmiden måste vara högre än 2 mg/mL.
Obs: Använd inte en vanlig maxi-prep-kit för DNA beredning. Plasmid-lösningar vid 4 ° C för regelbundna kortvarig användning (upp till 4 veckor) eller alikvot en lämplig volym av ca 25 µL håll och vid-20 ° C för långsiktig lagring.
- Syntetisera två DNA oligos enligt följande. Känsla: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. testa effektiviteten av den sgRNAs som använder EGxxFP Plasmid systemet
Obs: Effektiviteten av sgRNAs testas normalt av lantmätare eller T7E1 (T7 Amiiiiin jag) analyser. I detta protokoll används ett enkelt och effektivt alternativ. Nyckeln till detta tillvägagångssätt är att använda pCAG-EGxxFP plasmiden som innehåller överlappande andra fragment åtskilda av en DNA-sekvens som innehåller den sgRNA inriktning på plats17. Vid ett uttryck för pCAG-EGxxFP tillsammans med sgRNA och Cas9 i de transfekterade cellerna repareras Cas9-medierad double strand avbrottet (DSB) i målet sekvensen av endogena homologi-beroende mekanismer, som omformulerar det andra uttrycket kassetten.
- Design grundfärger att förstärka regionen genomisk centrerad med den sgRNA inriktning sekvenser. De PCR-Amplikonen är cirka 500 bp. I detta experiment tillämpades en DNA-församling för att klona en PCR-förstärkta fragmentet till pCAG-EGxxFP Plasmiden.
Obs: Alternativt lämplig begränsning platser kan läggas till 5' slutet av PCR primers. Finns begränsning platser i pCAG-EGxxFP vektorn är BamHI, NheI, PstI, SalI, mina och EcoRV. - Förstärka den genomiskt DNA med designade grundfärger med hjälp av formuläret och PCR-parametrarna nedan. Ladda provet (19,7 µL H2O; 0,3 µL 10 ng/µL mus genomiskt DNA; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µL 2 X PCR huvudmixen; 50 µL totala volym) på en 1% agaros gel och gel-rena PCR-fragmenten med en gel-utvinning kit. Använda den följande reaktion villkor: 95 ° C för 3 min; sedan 35 x cykler av 98 ° C för 20 s, 60 ° C under 15 s, 72 ° C för 20 s, och 72 ° C i 1 min. 4 ° C, på obestämd tid.
Obs: I detta experiment, en region i Top2b exon 1 förstärktes; hitta de primer sekvenserna i tabell 1. - Digest pCAG-EGxxFP vektorn med restriktionsenzym BamHI och mina för 2 h vid 37 ° C, sedan Ladda provet på en 1% agaros gel och gel-rena vektor ryggraden med en gel-utvinning kit. Använd följande reagenser (50 µL totala volym): X µL Plasmid (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL mina; 5 µL 10 x buffert; X µl ddH2O.
- Ställ in DNA församlingen reaktion18 enligt tillverkarens anvisningar, och omvandla till DH5α behöriga E. coli.
- Inokulera två kolonier, varje i 2 mL LB medium vid 37 ° C i minst 6 h, utföra en mini prep DNA isolering med ett kit, t.ex., från Qiagen, och identifiera kolonier med rätta insättningspunkten (hädanefter benämnd pCAG-EG-Top2b-FP) använder Sanger sekvensering med EGxxFP-Top2b-F primer.
- Transfect HEK293T celler.
- Utsäde av HEK293T celler till en 24-well platta 24 h innan transfection.
Obs: Celler odlades i en 37 ° C cell inkubator med 5% CO2, i DMEM med glutamin kosttillskott som innehåller 10% FBS och 1% Penicillin/Streptomycin. Säkerställa att cellerna är 60% konfluenta på dagen för transfection. I detta experiment använde vi egengjord HEK293T celler som stabilt uttrycker SpCas9 för att testa pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Vildtyp HEK293T celler kan dock användas om det finns ett SpCas9 uttryck vektor. - Transfect HEK293T celler med hjälp av polyethylenimine (PEI) reagens. Transfect cellerna med 120 ng per brunn pCAG-EG-Top2b-FP plasmid12 och 120 ng per brunn pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre eller pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre i en 24-bra platta. Blanda plasmiden DNAs och den 1.8 µL PEI reagens i 80 µL unsupplemented DMEM medium med glutamin komplement och inkubera i 15 min i rumstemperatur efter vortexa.
- 6 h efter transfection, ta bort mediet och ersätta med färsk medium.
- Kontrollera förekomsten av levande GFP+ celler 48 h efter transfection med fluorescens Mikroskop 20 x förstoring.
Obs: Antalet GFP+ celler indikerar sgRNA inriktning effektivitet. Resultaten av effektiva och icke gällande sgRNAs (sgTop2b-1 och sgTop2b-2, respektive) visas i figur 2A.
- Utsäde av HEK293T celler till en 24-well platta 24 h innan transfection.
3. utför In Utero elektroporation
- Föder upp 6 till 8 veckor gamla möss och förbereda verktygen i livmodern elektroporation. Korsa manliga homozygot Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP möss med CD-1 honmöss. Tid CD-1 mössen från dagen i vaginal kontakten är graviditet upptäcks (E0.5). Embryon är electroporated dag E13.5.
- Dra borosilikatglas kapillärer (innerdiameter: 0,6-0,8 mm) med en mikropipett avdragare. Använd följande inställningar: P = 500, värme = 560, Pull = 150, Vel = 75, tid = 250. Etikett kapillär spetsen med svart bläck för bättre visualisering under injektionen. Trimma kapillär koniska under ett stereomikroskop med hjälp av en linjal och vass nål pincett och trimma spetsen på en längd av ca 6 mm.
- Upprätthålla enhetligheten i kapillärerna att hålla experimentet reproducerbara. Skapa en ensidig avfasad kant under Intrimningen. Spetsen ska vara lika skarpa som möjligt för enkel penetrering av livmoderväggen och undvika vävnadsskada av embryot.
Obs: Alternativt använda en mikro kvarn för att justera en 35° vinkel19. Kapillärerna kan förvaras vid rumstemperatur i en 10 cm petriskål patogenfria villkor. - Autoklav de kirurgiska instrument.
- Blanda sgRNA-plasmidsna i lika delar med pT2K-IRES-Luc till en slutlig koncentration på minst 1 µg/µL för varje plasmid och färg plasmid-lösningen med snabb grön (slutlig koncentration på 0,05%). Bered 1% snabb grön lager med endotoxinfria destillerat vatten och filtrera genom ett 0,22 µm filter för att ta bort dye partiklar från lösningen.
Obs: Samtidig transfection pT2K IRES-Luc är valfritt, men möjliggör identifiering av livskraftiga electroporated djur efter födelsen med hjälp av Mareld imaging. Vänligen se steg 3.5. Förbereda en tillräcklig mängd plasmid-mix för det totala antalet dräktiga möss som ska fungeras. Använda om 15-20 µL blanda per mus (~ 12 embryon). Omedelbart gå vidare med operation.
- Förbereda möss för kirurgi.
- Söva gravid CD-1 möss med isofluran. Inducera anestesi i en låda med 3-4 vol-% isofluran (syre flöde: 1,5 L/min) och underhålla det med 2 vol-% under operation via näsan konen.
Obs: Komplett operationen bör inte ta längre än 30 min. minska antalet injiceras och electroporated embryon, om det behövs. Använd sterila handskar för kirurgi. - Placera musen på ryggen på en värmedyna och justera anestesi.
- Injicera smärtstillande (Metamizol, 800 mg/kg kroppsvikt, subkutant (s.c.), 24 h depot).
Obs: Du kan använda andra auktoriserade analgetika än Metamizol. - Tillämpa ögonsalva för att förhindra öga-torrhet under kirurgi.
- Fixa lemmar med tejp och sterilisera buken med ett desinfektionsmedel. Täcka musen med gasbinda, lämnar endast kirurgiska området exponeras. Utspridda i 70% etanol kirurgiska området och gasväv.
- Göra en huden snitt på ca 2 cm i längd och vidga klyftan försiktigt med rakt kirurgisk sax. Leta upp linea alba och gör en något mindre andra snitt genom bukhinnan använda vävnad sax med trubbig spets.
- Fukta öppnade bukhålan med pre värmde sterila 1 x PBS.
- Försiktigt extrahera uterin hornen från bukhålan med ring pincett. Dra försiktigt genom att greppa livmoderväggen enbart på klyftan mellan den äggula säckar av två angränsande embryon. Undvika eventuella tryck på embryot samtidigt som du drar det genom snittet. Förstora snittet vid behov och vara extra försiktig att placera uterin hornen på buken medan inte komprimera blodflödet genom livmodern artären.
Obs: I vissa fall är det klokt att extrahera en livmoderns horn i taget och Byt ut den innan du fortsätter med andra livmoderns horn.
- Söva gravid CD-1 möss med isofluran. Inducera anestesi i en låda med 3-4 vol-% isofluran (syre flöde: 1,5 L/min) och underhålla det med 2 vol-% under operation via näsan konen.
- Injektion och elektroporation av Plasmiden DNAs
- Aspirera cirka 15 µL av färgade plasmid-lösning med förberedda glaset kapillär. Undvika eventuella luftbubblor under denna process.
Obs: Plasmid-lösningen kan täppa spetsen enkelt om dess koncentration är hög. Testa kapillären genom att släppa några DNA precis före injektion. - Försiktigt hålla embryot med ring pincett och leta upp nacken.
Obs: Om embryot är i en position som är svårt att injicera, hoppa över den och gå för nästa embryot. Ökad ompositionering av embryot kan öka risken för skador på dem. - Pierce med spetsen på tidigare beredda glaset kapillär i den fjärde ventrikeln genom att tränga igenom den dorsala hindbrain och därefter injicera långsamt ca 1 µL av en plasmid-mix. Bekräfta att färgat DNA inte är läckt från hjärnan och syns som en diamant formad struktur.
Obs: Som ett alternativ använda 2,5 gånger förstoringsglas för bättre visualisering av den fjärde ventrikeln och omgivande blodkärl. Leverera elektriska pulser omedelbart efter injektion för att förhindra spridning av plasmid-lösningen till andra ventriklarna. - Gäller elektrisk fyrkantiga pulser (5 pulser, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) med pincett-liknande platina pincett (se Tabell för material). Placera elektroderna sidled med minuspolen som täcker örat och pluspolen placerad på den cerebellär primordium över livmoderväggen. Använd 5 mm diameter elektrodplattor för effektiv elektroporation E13.5 embryon.
Obs: Öka överlevnaden av pups genom att manipulera mindre än 2/3rd av det totala antalet embryon per dam. Undvika embryon för nära till livmoderhalsen. Om manipulerade, kan de orsaka komplikationer under förlossningen och äventyra hela kullen. Om elektroderna är alltför nära embryots hjärta, detta kan orsaka hjärtstillestånd.
- Aspirera cirka 15 µL av färgade plasmid-lösning med förberedda glaset kapillär. Undvika eventuella luftbubblor under denna process.
- Post-elektroporation och efter operation
- Noggrant placera livmoderns horn tillbaka i bukhålan och fyll med pre värmde sterila 1 x PBS. Låt livmoderns horn glida i en naturlig position.
- Nära peritoneum och huden separat med en enkel kontinuerlig sutur.
Obs: Extra försiktig inte att genomborra genom livmoderväggen när suturering bukhinnan. - Avstängning av anestesi och placera djuret mage-down in i en ny bur.
- Övervaka djuret under de vakna fas och igen 24 h efter operationen. Placera buren under en värme-lampa, om darrande inte förbättras inom en 15 minuters tidsram och djuret inte startar grooming.
- Bekräfta lyckad elektroporation genom luciferas imaging.
- Kontrollera att de opererade dammarna släppa embryon i tid (på E19.5).
Obs: Födelsedatum kan försenas till nästa dag förmodligen på grund av operationen. - Söva electroporated valparna (P5-P7) med 2,5% isofluran och injicera (intraperitoneal (IP)) med D-Luciferin (3 mg/kg kroppsvikt) 5 min före imaging.
- Upptäcka luciferas signaler i electroporated valparna använder Mareld kameran.
Obs: En 1 min exponeringstiden är tillräcklig för att upptäcka luciferas signalen. Radiance (p/s/cm2/sr) är ungefärligt > 1 x 106.
- Kontrollera att de opererade dammarna släppa embryon i tid (på E19.5).
4. Förbered kryosnitt från de Electroporated Cerebella
- Avliva den electroporated P7 pups och dissekera ut lillhjärnan.
Obs: GFP signalen kan observeras med en epifluorescerande stereoskop. - Fixa cerebella över natten i 5 mL per hjärnan på 4% PFA i PBS vid 4 ° C.
- Överföra de fasta cerebella övernattning i 10 mL per hjärnan 30% sackaros i PBS vid 4 ° C.
Obs: Vävnaden ska nå botten av en 15-mL tub efter inkubation i sackaroslösning. - Efter blötläggning upp de återstående sackaroslösning med en bit av cellulosa filterpapper, fördjupa lillhjärnan i en optimal skärtemperatur (ULT) sammansatta i en disponibel plast mögel och frysa det på torris. Kryogen blocket kan lagras vid-80 ° C fram till användning.
Obs: Protokollet kan pausas här. - Skär blocket kryogen i sektioner med 10 µm i tjocklek med en kryostat och hålla avsnitten vid-80 ° C fram till användning.
Obs: Man kan bekräfta GFP uttryck i avsnitten efter tvättningen ute ULT förening med PBS.
5. immunfärgning av kryosnitt
- Torka bilderna på room temperature i 30 min och tvätta två gånger i 10 min i PBS.
- Circle avsnitten med en flytande blockerare penna och inkubera avsnitten i en blockerande lösning (10% normala åsna serum i PBS som innehåller 0,1% Triton-X100) för 1 h i rumstemperatur.
- Lägg till primära antikroppar mot molekylerna av intresse (t.ex., GFP och topoisomeras II beta (Top2B) i denna studie) i blockerande lösningen och inkubera över natten vid 4 ° C.
Obs: Namnen och koncentrationer av antikroppar används listas i Tabell för material. För att öka GFP signaler, kan en anti-GFP-antikropp alternativt användas tillsammans med de andra antikropparna. - Tvätta i bilderna med 0,1% Triton-innehållande PBST 3 X för 10 min. Inkubera avsnitten för 1 h i rumstemperatur med en fluorophore-konjugerad sekundär antikropp utspätt i blockerande lösningen innehållande DAPI.
- Tvätta objektglasen i PBS 3 X för 10 min. Montera bilder och hålla vid 4 ° C tills imaging.
Obs: Protokollet kan pausas här.
6. imaging och analys
- Bild avsnitten med confocal Mikroskop 20 x förstoring.
- Räkna antalet GFP positiva celler förlorar uttrycket av målproteinet. En representativ bild visas i figur 2B.
- Kontrollera den molekylära fenotypen vid ablation av målet generna i BNI och deras avkommor med immuostaining12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
För in-vivo funktionell analys är det viktigt att identifiera de celler som exogena gene(s) har förts in. Samtidigt som ett uttryck för en markör, såsom god Jordbrukarsed i icke-frodas celler kan följas upp under en lång tid, försvinner signalen sekventiellt i prolifererande celler. En illustration av denna effekt demonstreras i figur 1. För att kringgå att förlora fotavtryck av transfekterade celler i LOF analyser, utvecklat vi en ny metod genom att kombinera elektroporation-baserade gen leverans med tekniken CRISPR/Cas9.
Representativa resultat visas i figur 2. Funktionaliteten i plasmiden konstruktioner är testad av övergående transfection av pU6-sgTop2b-Cbh-Cre och pCAG-EG-Top2b-FP17, bär sgTop2b target sekvensen, in i HEK293T celler stabilt uttrycker SpCas9 (figur 2A). SgRNA-guidad Cas9 Amiiiiin aktiviteten inducerar DSB-medierad homologi-regisserad reparation av andra uttryck kassett. Funktionen av sgRNA analyserades därför direkt genom påvisande av GFP uttryck. Enligt Mashiko et al.bestämmer en transfection verkningsgrad på mer än 30% en sgRNA som effektivt17.
BNI har sitt ursprung från rhombic läppen (RL), en region som gränsar till taket av den fjärde ventrikeln i embryonala stadier E12.5 tills E16.5. Dessa celler har varit känt att genomgå massiv spridning efter födseln i yttre externa granule lager (oEGL) och övergången till den inre EGL (iEGL) efter spännande cellcykeln20. Således är BNI ett lämpligt exempel att testa fördelarna med vår genetiska märkning strategi.
Genom att följa detta protokoll, tillåter i livmodern elektroporation av BNI spårning av redigerade celler med GFP. Vi introducerade pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmiden uttrycka sgControl i den cerebellär primordium Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP möss i fosterstadiet E13.5. Möss offrades vid postnatal dag P7 och sagittal delar av lillhjärnan vävnadssnitt var målat av immunohistokemi. Yttre och inre EGL definierades av Ki67 uttryck (oEGL) och M27 uttryck (iEGL), respektive. Trots genomgår spridning och mognad, kvar mogen cerebellär granule nervceller (CGNs) fortfarande starkt GFP uttryck (figur 2B).
Betonar nyttan av detta protokoll, använde vi vidare den sgRNA inriktning DNA Top2b som ett typexempel. Experimentella rutiner utfördes enligt ovan (se figur 2B). De flesta av GFP-positiva celler transfekterade med sgRNAs för Top2b uppvisade en förlust av Top2b uttryck i inre granule lagret (IGL), medan införandet av kontroll sgRNAs inte resulterade i tydlig minskning av dess uttryck (figur 2 c). En kvantifiering av detta resultat visas i figur 2D. Dessa uppgifter utgör ett värdefullt verktyg för att spåra redigerade celler under en lång tid under utveckling eller tumör bildas.
Figur 1: Schematisk bild av GFP uttryck i prolifererande och icke-frodas celler. (A) när en exogen gen kodning GFP (t.ex., pCAG-andra) är transfekterade i icke-frodas celler, celler kan uttrycker GFP under lång tid (övre lane). Under tiden kunde GFP uttryck försvinna i prolifererande celler på grund av utspädning av exogena GFP (mitten lane). Däremot kan de celler som bär den LoxP-Stop-LoxP-GFP (LSL-GFP) transgenens hålla GFP uttrycket vid spridning efter transfection med Cre recombinase (lägre lane). (B) principen om SpCas9-medierad nedtystning och god Jordbrukarsed uttryck efter Cre och sgRNA transfection i en Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus stam. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: representativa bilder av resultaten från detta protokoll. (A) HEK293T celler som stabilt uttrycker SpCas9 var transfekterade med pU6-sgTop2b-Cbh-Cre och pCAG-EG-Top2b-FP plasmider. GFP uttryck i levande celler övervakades med hjälp av en fluorescerande cell imager (se Tabell för material) 48 h efter transfection. Vänster och höger paneler visar en effektiv och icke-effektiv sgRNA ordningsföljd baserat på god Jordbrukarsed uttryck, respektive. Skala barer: 100 µm. (B) immunfärgning av GFP, Ki67 och M27 på de P7 cerebella från en Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus genomgå elektroporation på E13.5 med pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmid konstruktioner uttrycker kontroll sgRNA. Avsnittet är counterstained med DAPI (blå). Skala barer: 50 µm; 20 x förstoring. Observera GFP-uttryckande celler i den oEGL som präglas av Ki67. (C) immunfärgning av god Jordbrukarsed (grön) och Top2b (magenta) på de P7 cerebella från en Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus som var electroporated på E13.5 med pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmid konstruerar uttrycker sgRNA mot Top2b (sgTop2b) och en reglersekvens (sgControl). Pilar indikerar Top2b uttryck i GFP+ celler i samma fält. Skala barer: 20 µm; 20 x förstoring. (D) kvantifiering av Top2b i electroporated (GFP-positiv) celler i sgControl och sgTop2b experiment. Två och tre ungar undersöktes för sgControl och sgTop2b, respektive, och 25 celler från varje hjärna analyserades. Felstaplar representera ± medelfel medelvärde (SEM) och p-värdena beräknades av oparat t-test, *p = 0,0002. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Namn | Sekvens | Ansökan | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA mål sekvens | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA mål sekvens | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA mål sekvens | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Kloning i pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Kloning i pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Ordningsföljd för sgRNA | |
Tabell 1: Sekvenser av oligos som används i denna studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Använda exo utero elektroporation, har vi tidigare rapporterat siRNA-baserade i vivo funktionella analyser av Atoh1 i ett tidigt skede av cerebellär granule cellen differentiering8. På grund av siRNA utspädning/nedbrytning och exponering av embryon utanför livmoderväggen var fenotypiska analys av electroporated granule celler begränsad till embryonala stadier. Men med den nuvarande metoden gjort analys av fenotypen av postnatal djur.
Vår tidigare studie visat att Cas9-medierad knockout av tumörsuppressor Ptch1 via Utero elektroporation framgångsrikt inducerad medulloblastom2. I jämförelse, den nuvarande strategin uppvisar två stora fördelar: 1) Cas9 har inte levereras med plasmiden, möjliggör flera gen inriktning genom att bära flera sgRNA uttryck kassetter i en enda plasmid istället; och 2) målceller och deras avkommor märks permanent med GFP, för visualisering av levande celler och analys av beteendet hos omvandla tumör celler in vivo.
De viktigaste stegen i detta protokoll är korrekt injektion av Plasmiden DNAs på rätt plats och leverans av elektriska pulser till lämpliga platser i hjärnan. Cerebellär nervceller föds ur den cerebellär neuroepithelium sekventiellt på ett sätt som födelsedatum-beroende. Inte alla typer av celler i den cerebellär primordium kan riktas via elektroporation, eftersom endast en viss tidsramen på E12.5-14.5 är tekniskt genomförbart. Djupa cerebellär kärnor nervceller och Purkinje celler har varit känt att uppstå på E10.5-11,5, när extraembryonala hinnor är inte transparent och embryot är inte tydligt DNA injektionsvätska. Senare, unipolär borste celler härleds från E17.5 övre RL (uRL), när den fjärde ventrikeln är alltför snäv för att injicera en tillräcklig mängd DNA i närheten av uRL. Vår metod är således endast tillämplig vid E12.5-14.5, som främst riktar sig till mitten av - och senare-born progenitorceller, såsom BNI och hämmande interneuroner. En annan nackdel med metoden är att en full knockout fenotyp inte kanske är genomförbart jämfört med Cre/LoxP-medierad könsceller GEMMs, eftersom bara tusentals cerebellär celler kan riktas av elektroporation i varje embryo.
I en tidigare studie celler cirka 80% av GFP-positiv cerebellär granule förlorade uttryck av riktade gene12. Medan granule celler identitet bekräftades av molekylära markörer och deras fördelning, kanske denna identifiering metod inte alltid gäller, som gener av intresse kunde vara inblandade i markör uttryck och neuronala migration. Villkorlig aktivering av Cre använder en cell-specifika promotorn skulle lösa problemet i detta fall. Nuvarande allestädes närvarande Cbh arrangören i pU6-sgRNA-Cbh-Cre Plasmiden kan därför ersättas med en cell-specifika promotorn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Vi uppskattar Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim och Petra Schroeter för tekniskt bistånd. Vi tackar också Drs. K. Reifenberg, K. Dell och s. Prückl för bra stöd för djurförsök på DKFZ; den Imaging corefaciliteter från DKFZ och Carl Zeiss Imaging Center i DKFZ konfokalmikroskopi imaging. Detta arbete stöds av den Deutsche Forschungsgemeinschafts, KA 4472/1-1 (till D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
