Summary
Konvensjonelle tap-av-funksjon studier av gener bruke knockout dyr er ofte kostbare og tidkrevende. Electroporation-baserte CRISPR-mediert somatisk mutagenese er et kraftig verktøy for å forstå gen fungerer i vivo. Her rapporterer vi en metode for å analysere knockout fenotyper i voksende celler av lillehjernen.
Abstract
Misdannelse hjernen er ofte forårsaket av genetiske mutasjoner. Tyde mutasjoner i pasient-avledede vev har identifisert potensielle årsaksfaktorer av sykdommer. For å validere bidrag av en dysfunksjon av muterte genene sykdom utvikling, er generering av dyremodeller bærer mutasjoner en tydelig måte. Mens germline genmodifiserte musen modeller (GEMMs) er populære biologiske verktøy og utstillingen reproduserbar resultater, det er begrenset av tid og kostnader. I mellomtiden aktivere ikke-germline GEMMs ofte utforske gen funksjon på en mer mulig måte. Siden noen brain sykdommer (f.eks, hjernesvulster) synes å skyldes somatiske men ikke germline mutasjoner, ikke-germline chimeric musen modeller, som normale og unormale celler eksistere, kan være nyttig for sykdom-relevant analyse. I denne studien rapporterer vi en metode for induksjon av CRISPR-mediert somatiske mutasjoner i lillehjernen. Spesielt vi utnyttet betinget banke i mus, som Cas9 og GFP kronisk aktiveres av CAG (CMV enhancer/kylling ß-utgangen) selskapet etter grobunn-mediert rekombinasjon i genomet. Egenutviklede single-guiden RNAs (sgRNAs) og grobunn recombinase rekkefølgen, både kodet i et enkelt plasmider konstruksjonen ble levert i lillehjernen stammen/stamfar celler på en gryende scenen med electroporation i utero . Følgelig ble transfekterte cellene og deres datter merket med grønne fluorescerende protein (GFP), dermed tilrettelegge ytterligere fenotypiske analyser. Derfor, denne metoden er ikke bare viser electroporation-baserte gen levering i embryonale lillehjernen celler, men foreslår en ny kvantitativ tilnærming for å vurdere CRISPR-mediert tap-av-funksjon fenotyper.
Introduction
Brain sykdommer er en av de mest forferdelige dødelige sykdommene. De skyldes ofte genetiske mutasjoner og påfølgende feilregulering. For å forstå molekylære mekanismer av brain sykdommer, har evigvarende innsats å dechiffrere genomer av menneskelige pasienter oppdaget en rekke potensielle forårsaker gener. Så langt har germline genmodifiserte dyr modeller vært benyttet i vivo gevinst-av-funksjon (GOF) og tap-av-funksjon (LOF) analyser av slike kandidat gener. Akselerert utbygging av funksjonelle validering studier er et mer gjennomførbart og fleksibel i vivo genet analysen system for å studere gen funksjon ønskelig.
Bruk av en i vivo electroporation-baserte genet overføring-system for å utvikle musen hjernen er egnet for dette formålet. Faktisk, har flere studier bruker i utero electroporation vist sitt potensial til å utføre funksjonelle analyser i utvikle hjernen1,2,3. Faktisk, flere områder av musen hjernen, som hjernebarken4, netthinnen5, diencephalon6, hindbrain7, lillehjernen8og ryggmargen9 har vært målrettet av somatiske gen levering tilnærminger, så langt.
Faktisk har forbigående genuttrykk av i vivo electroporation på embryonale musen hjerner lenge vært brukt for GOF analyse. Siste transposon-baserte genomisk integrasjon teknologi ytterligere aktivert langsiktig og/eller betingede uttrykket av gener av rundt10,11, som er en fordel å dissekere gen funksjon på en romlig og tidsmessige måte under utvikling. I motsetning til GOF analyse er LOF analyse mer utfordrende. Mens forbigående hva siRNAs og shRNA-bærer plasmider ble utført, garanteres ikke langtidseffekter av LOF av gener på grunn av eventuell nedbrytning av exogenously introdusert nucleic syrer, for eksempel plasmider og dsRNAs. CRISPR/Cas teknologien gir imidlertid et gjennombrudd i LOF analyser. Gener som koder fluorescerende proteiner (f.eksGFP) eller bioluminescent proteiner (f.eksfirefly luciferase) har vært co transfekterte med CRISPR-Cas9 og sgRNAs for å merke cellene utsatt for CRISPR-Cas9-mediert somatiske mutasjoner. Likevel kan denne tilnærmingen ha begrensninger i funksjonelle studier på voksende celler, siden eksogene markør gener er utvannet og degradert etter langsiktige spredning. Mens de transfekterte cellene og deres datter gjennomgår CRISPR-indusert mutasjoner i deres genomer, kan sine fotavtrykk få tapt over tid. Dermed ville genetisk merking tilnærminger være egnet til å overvinne problemet.
Vi har nylig utviklet en CRISPR-baserte LOF metode i lillehjernen granule celler som gjennomgår langsiktige spredning under deres differensiering12. Hvis genetisk etiketten transfekterte cellene, vi bygget en plasmider bærer en sgRNA sammen med grobunn og introdusert av plasmider i cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus13 bruker i utero electroporation. I motsetning til vanlige plasmider vektorer koding EGFP, dette merket ble transfekterte-granulen Nevron prekursorer (GNPs) og deres datter celler. Denne metoden gir god støtte forstå i vivo funksjon av gener av interesse i voksende celler i normal hjernens utvikling og svulst utsatt bakgrunn.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble utført etter dyrevelferd forskrifter og er godkjent av de ansvarlige myndighetene (Regierungspräsidium Karlsruhe, godkjenning tall: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 og G133/14).
1. Generer pU6-sgRNA-Cbh-grobunn plasmider
- Utforme sgRNA å målrette en gen-of-interessepunkter i henhold til de tidligere publiserte protokollen14.
Merk: I dette eksperimentet, to sgRNAs er utformet for mus Top2b genet og en ikke-målrettede kontroll sgRNA (tabell 1). Å knockout gene(s) bruker CRISPR teknologi, må sgRNAs være utformet for å målrette enten koding sekvensen av 5' regionen eller viktige funksjonelle domenet protein. En praktisk utgangspunkt er å teste offentlig tilgjengelig forhåndsutformede sgRNA sekvenser, som GeCKO v2 musen knockout bassenget biblioteket15 fra Zhang lab. Alternativt sgRNAs kan utformes med offentlig tilgjengelig programvare til følgende nettsted: crispr.mit.edu. - Klone av sgRNAs i pU6-sgRNA-Cbh-grobunn vektoren.
Merk: PU6-sgRNA-Cbh-grobunn vektor12 brukt i denne studien er avledet fra de opprinnelige pX330 plasmider16 ved å erstatte koding sekvensen av SpCas9 med grobunn recombinase.- Syntetisere to DNA oligos som følger. Mening: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5.
Merk: 20 N er vist ovenfor stå for sgRNA forløp. - Fordøye pU6-sgRNA-Cbh-grobunn med BbsI i 30 min på 37 ° C ved hjelp av følgende reagensene laste fordøyd prøven til en 1% agarose gel og rense dem ved hjelp av en gel-utvinning kit. Bruk 3 µg plasmider; 3 µL Bbsjeg; 1 µL FastAP; 5 µL 10 x fordøyelsen buffer; legge til ddH2O for å bringe det totale volumet til 50 µL.
- Phosphorylate og anneal hvert par av sgRNA oligos med følgende reagenser (10 µL totalt volum): 1 µL tilpasset følelse oligo (100 mM); 1 µL tilpasset antisense oligo (100 mM); 1 µL 10 x T4 Ligation Buffer; 6.5 µL ddH2O; 0,5 ΜL T4 PNK. Inkuber i en thermo-cycler i 30 min ved 37 ° C, og 5 minutter til 95 ° C, og deretter rampe ned 25 ° C på 5 ° C/min.
- Definere følgende ligation reaksjon og ruge i 10 min ved romtemperatur (10 µL totalt volum): X µL Bbsjeg fordøyd plasmider (50 ng); 1 µL fosforylert og herdet, oligo dupleks (1:200 fortynning); 5 µL 2 x ligation buffer; X µL ddH2O; 1 µL rask ligase.
- Legge til 2 µL av hemorroider produktet i 50 µL av kjemisk kompetent DH5α Escherichia coli celler. Etter 30 min med inkubering på is, varme sjokk utvalget for 90 s på 42 ° C, og Inkuber i 2 minutter på is. Legg 100 µL av LB medium og plate det på en LB plate som inneholder 100 µg/mL ampicillin.
Merk: Integrering av sgRNA sekvensen i pU6-sgRNA-Cbh-grobunn plasmider utføres etter kloning trinnene for pX330 plasmider14. - Vaksinere to kolonier hver på 2 mL LB medium på 37 ° C i minst 6 h, og utføre en mini prep DNA isolasjon bruker en kit.
- Sanger sekvens mini prep DNA bruker hU6 fram primer, og identifisere kolonier med riktig innsetting av sgRNAs ved å samkjøre med rekkefølgen vist i trinn 1.2.1. Primer sekvensen er vist i tabell 1. Plasmider brukt i denne studien ble kalt pU6-sgTop2b-1-Cbh-grobunn, pU6-sgTop2b-2-Cbh-grobunn og pU6-sgControl-Cbh-grobunn.
- Vaksinere korrekt identifisert koloniene og rense den endotoxin-ledig plasmider DNA for i utero electroporation bruker en kit, f.eksfra Qiagen. Elute DNA med endotoxin-gratis TE-Buffer fortynnet i ddH2O på 1:10 (10% TE buffer). DNA konsentrasjonen av plasmider må være høyere enn 2 mg/mL.
Merk: Ikke bruk et vanlig maxi-prep kit for DNA forberedelse. Lagre plasmider-løsninger på 4 ° C for vanlige kortvarig bruk (opptil 4 uker) eller aliquot en passende volum på ca 25 µL og holde på 20 ° C for langtidslagring.
- Syntetisere to DNA oligos som følger. Mening: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5.
2. test effektiviteten av sgRNAs bruker EGxxFP plasmider System
Merk: Effektiviteten av sgRNAs er normalt testet av landmåler eller T7E1 (T7 endonuclease jeg) analyser. I denne protokollen brukes en enkel og effektiv alternativ tilnærming. Nøkkelen til denne tilnærmingen er å bruke pCAG-EGxxFP-plasmider som inneholder overlappende EGFP fragmenter atskilt med en DNA sekvens med sgRNA målretting området17. På uttrykk for pCAG-EGxxFP sgRNA og Cas9 i de transfekterte cellene, er Cas9-mediert dobbel strand pause (DSB) i målet sekvensen reparert av endogene homologi-avhengige mekanismer, som rekonstruerer EGFP uttrykk kassett.
- Utforme primere å forsterke genomisk regionen sentrert med sgRNA målretting sekvenser. PCR-amplicon er ca 500 bp. I dette eksperimentet, ble en DNA-samling brukt til å klone et PCR-forsterket fragment i pCAG-EGxxFP-plasmider.
Merk: Alternativt riktig begrensning nettsteder kan legges til 5' slutten av PCR primere. Tilgjengelige begrensning områder i pCAG-EGxxFP vektoren er BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI og EcoRV. - Forsterke genomisk DNA med designet primere ved hjelp av skjemaet og PCR parametre. Laste utvalget (være 19.7 µL H2O; 0,3 µL av 10 ng/µL musen genomisk DNA, 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F, 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R, 25 µL 2 X PCR master mix, 50 µL totale volumet) til en 1% agarose gel og gel-rense PCR fragmenter ved hjelp av en gel-utvinning kit. Bruk den følgende reaksjonen forhold: 95 ° C til 3 min; deretter 35 x sykluser av 98 ° C for 20 s, 60 ° C i 15 s, 72 ° C for 20 s og 72 ° C i 1 min; 4 ° C, uendelige.
Merk: I dette eksperimentet, en region i Top2b ekson 1 ble forsterket; finne primer sekvenser i tabell 1. - Ufullstendig pCAG-EGxxFP-vektor med begrensning enzymer BamHI og EcoRI for 2t ved 37 ° C, deretter laste utvalget på en 1% agarose gel og gel-rense vektor ryggraden med en gel-utvinning kit. Bruk følgende reagenser (50 µL totalt volum): X µL plasmider (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL EcoRI; 5 µL 10 x Buffer; X µL ddH2O.
- Definer DNA montering reaksjon18 i henhold til produsentens instruksjoner, og forvandle DH5α kompetent E. coli.
- Vaksinere to koloniene, hver i 2 mL LB medium på 37 ° C i minst 6 h og utføre en mini prep DNA isolasjon bruker en kit, f.eksfra Qiagen, og identifisere kolonier med riktig innsetting (heretter referert til som pCAG-F.eks-Top2b-FP) bruker Sanger sekvensering med EGxxFP-Top2b-F primer.
- Transfect HEK293T celler.
- Ætt av HEK293T celler i en 24-vel plate 24 timer før transfection.
Merk: Celler ble kultivert i en 37 ° C celle inkubator med 5% CO2 i DMEM med glutamin supplement som inneholder 10% FBS og 1% Penicillin/Streptomycin. Kontroller at cellene er 60% confluent ved transfection. I dette eksperimentet brukte vi Self-Made HEK293T celler uttrykke stabilt SpCas9 for å teste pU6-sgRNA-Cbh-grobunn. Wildtype HEK293T celler kan imidlertid brukes hvis et SpCas9 uttrykk vektor er angitt. - Transfect HEK293T cellene med polyethylenimine (PEI) reagensen. Transfect cellene med 120 ng/vel pCAG-F.eks-Top2b-FP plasmider12 og 120 ng/vel i pU6-sgTop2b-1-Cbh-grobunn eller pU6-sgTop2b-2-Cbh-grobunn i en 24-vel plate. Bland plasmider DNAs og den 1,8 µL av PEI reagensen i 80 µL av unsupplemented DMEM medium med glutamin supplement og ruge i 15 min ved romtemperatur etter vortexing.
- 6 t etter transfection, fjerne mediet og erstatte med fersk medium.
- Overvåke tilstedeværelsen av lever GFP+ celler 48 timer etter hva bruker fluorescens mikroskop på 20 x forstørrelse.
Merk: Antall GFP+ celler indikerer målretting effektiviteten av sgRNA. Resultatene av effektiv og ikke-effektiv sgRNAs (sgTop2b-1 og sgTop2b-2, henholdsvis) vises i figur 2A.
- Ætt av HEK293T celler i en 24-vel plate 24 timer før transfection.
3. Utfør Electroporation In Utero
- Rase 6 til 8-uke-gamle mus og forberede verktøyene i utero electroporation. Krysse mannlige homozygous Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus med kvinnelige CD-1 mus. Tid graviditet av CD-1 mus fra dagen vaginal pluggen er oppdaget (E0.5). Embryo er electroporated dag E13.5.
- Trekke Borosilikatglass kapillærene (innvendig diameter: 0,6 0,8 mm) med en brønnene avtrekker. Bruk følgende innstillinger: P = 500, varme = 560, trekke = 150, Vel = 75, tid = 250. Etiketten kapillær spissen med svart blekk for bedre visualisering under injeksjon. Trim kapillær taper under en stereomicroscope bruker en linjal og skarpe nålen pinsett og trimme spissen på en lengde på ca 6 mm.
- Vedlikehold av kapillærene å holde eksperimentet reproduserbare. Opprett en ensidig skråkant under trimmingen. Spissen bør være så skarp som mulig for enkel penetrasjon av livmor veggen og for å unngå skade på vev av embryoet.
Merk: Alternativt bruke en mikro vinkelsliper for å justere en 35° vinkel19. Kapillærene kan lagres ved romtemperatur i en 10 cm Petriskål under patogen-gratis forhold. - Autoclave Kirurgiske instrumenter.
- Bland sgRNA-plasmider i like deler med pT2K-IRES-Luc til en siste konsentrasjon av minst 1 µg/µL for hver plasmider og farge plasmider-løsningen med rask grønne (siste konsentrasjon på 0,05%). Forberede 1% rask grønne lagerløsning med endotoxin-gratis destillert vann og filter gjennom et 0.22 µm filter fjerne fargestoff partikler fra løsningen.
Merk: Co transfection av pT2K IRES-Luc er valgfritt, men gir identifikasjon av levedyktig electroporated dyr etter fødselen med bioluminescens imaging. Se trinn 3.5. Forberede en tilstrekkelig mengde plasmider-mix antall gravid mus drives. Bruke om 15-20 µL blande per mus (~ 12 embryo). Fortsett umiddelbart med kirurgi.
- Forberede mus kirurgi.
- Bedøve gravid CD-1 mus med isoflurane. Indusere anestesi i en boks med 3-4 vol-% isoflurane (oksygen strømningshastighet: 1,5 L/min) og opprettholde det med 2 vol-% under operasjonen via nesen kjegle.
Merk: Hele operasjonen bør ikke ta mer enn 30 min. redusere antall injisert og electroporated embryoer, om nødvendig. Bruk sterilt hansker for kirurgi. - Plasser musen på ryggen på en varmeputen og justere anestesi.
- Injisere smertestillende (Metamizol, 800 mg/kg kropp vekt, subcutaneously (SC), 24 h depot).
Merk: Du kan bruke andre autoriserte analgetika enn Metamizol. - Bruk øye ointment å forhindre øye tørrhet under operasjonen.
- Fikse lemmer med tape og sterilisere magen med et desinfeksjonsmiddel. Dekk musen med gasbind, forlater bare det kirurgiske området utsatt. Fordelt på 70% etanol kirurgiske området og gasbind.
- Gjøre en huden snitt av ca 2 cm i lengde og utvide gapet forsiktig med rett kirurgisk saks. Finn linea alba og gjøre litt mindre andre snitt gjennom peritoneum ved hjelp av vev saks med butt tupp.
- Fukt åpnet bukhulen forvarmes sterilt 1 x PBS.
- Nøye ekstra livmor hornene fra bukhulen bruker ring tang. Trekk forsiktig ved å flytte livmor veggen utelukkende på gapet mellom eggeplomme sacs av to nabokommunene embryo. Unngå noe press på fosteret mens trekke det gjennom snittet. Forstørre innsnitt eventuelt og ta ekstra forsiktighet å plassere livmor hornene på magen under ikke komprimering blodstrømmen gjennom livmor arterien.
Merk: I noen tilfeller er det anbefales å trekke ut en livmor horn på et tidspunkt og erstatte den før du fortsetter med andre livmor Hornet.
- Bedøve gravid CD-1 mus med isoflurane. Indusere anestesi i en boks med 3-4 vol-% isoflurane (oksygen strømningshastighet: 1,5 L/min) og opprettholde det med 2 vol-% under operasjonen via nesen kjegle.
- Injeksjon og electroporation av plasmider DNAs
- Sug opp ca 15 µL av farget plasmider-løsning med forberedt glass kapillær. Unngå eventuelle luftbobler under denne prosessen.
Merk: Plasmider-løsningen kan tette spissen lett hvis konsentrasjonen er høy. Test av kapillær ved å slippe noen DNA rett før injeksjon. - Forsiktig holder embryoet med ring tang og finne nakke-området.
Merk: Hvis embryoet er i en posisjon som er vanskelig å injisere, hoppe over det og gå for neste fosteret. Økt omplassering av fosteret kan øke sjansene for å skade dem. - Sakte pierce med spissen av tidligere forberedt glasset kapillær i fjerde ventrikkel ved å trenge gjennom det dorsal hindbrain og deretter injisere ca 1 µL av plasmider-mix. Kontroller at farget DNA ikke er lekket fra hjernen og vises som en diamant formet struktur.
Merk: Som et alternativ, bruke 2.5-fold forstørrelsesglass briller for bedre visualisering av fjerde ventrikkel og rundt blodkar. Levere elektriske pulser umiddelbart etter injeksjon for å hindre spredning av plasmider-løsningen til andre ventriklene. - Bruke elektrisk kvadrat pulser (5 pulser, 32 mV, 50 ms på 950 ms-off) med tang-lignende platina pinsett (se Tabell for materiale). Plassere elektrodene sidelengs med den negative Polen dekker øret og den positive Polen plassert på lillehjernen primordium over livmor veggen. Bruke 5 mm-diameter elektrode plater for effektiv electroporation av E13.5 embryo.
Merk: Øke overlevelse av pups ved å manipulere mindre enn 2/3rd antall av embryo per dam. Unngå embryo for nær livmorhalsen. Hvis manipulert, kan de føre til komplikasjoner i løpet av arbeidskraft og sette hele søppel. Hvis elektrodene er for fosterets hjerte, nær dette medfører hjertestans.
- Sug opp ca 15 µL av farget plasmider-løsning med forberedt glass kapillær. Unngå eventuelle luftbobler under denne prosessen.
- Post-electroporation og etter operasjonen
- Forsiktig plassere livmor horn tilbake i bukhulen og fyll med pre varmet sterilt 1 x PBS. La livmor horn lysbildet inn i en naturlig posisjon.
- Lukke peritoneum og huden separat med en enkel Sutur kontinuerlig.
Merk: Ta ekstra forsiktighet for ikke å pierce gjennom livmor veggen når du syr peritoneum. - Nedstenging av bedøvelsen og plassere dyret magen ned i en ny bur.
- Overvåke dyret under våkne fase og igjen 24 timer etter operasjonen. Sett byrået under en varme lampe, hvis de skjelvende ikke bedre innen en 15 min tidsramme og dyret starter ikke grooming.
- Bekrefte vellykket electroporation av luciferase bildebehandling.
- Kontroller at styres demninger slippe embryoer på gang (på E19.5).
Merk: Fødselsdatoen kan forsinkes neste dag sannsynligvis på grunn av operasjonen. - Bedøve electroporated valpene (P5-P7) med 2,5% isoflurane og injisere (intraperitoneal (IP)) med D-Luciferin (3 mg/kg kroppsvekt) 5 min før bildebehandling.
- Oppdage luciferase signaler i electroporated valpene bruker bioluminescens imager.
Merk: En 1 min eksponeringstid er tilstrekkelig til å gjenkjenne luciferase. Utstråling (p/s/cm2/sr) er ca > 1 x 106.
- Kontroller at styres demninger slippe embryoer på gang (på E19.5).
4. forberede Cryosections fra Electroporated-Cerebella
- Euthanize electroporated P7 valpene og dissekere ut lillehjernen.
Merk: GFP signalet kan observeres med en epifluorescent stereoscope. - Fastsette cerebella natten i 5 mL per hjernen på 4% PFA i PBS på 4 ° C.
- Overfør de faste cerebella overnatter i 10 mL per hjernen av 30% sukrose i PBS på 4 ° C.
Merk: Vevet skal nå bunnen av en 15-mL tube etter inkubasjon i sukrose løsningen. - Etter å ha opplevd den gjenværende sucrose løsningen med cellulose filter papir, fordype lillehjernen i en optimal kutte temperatur (OCT) compound i en engangs plast mold og fryse den på tørris. Kryogenisk blokken kan lagres ved-80 ° C før bruk.
Merk: Protokollen kan pauses her. - Skjær kryogene blokken i inndelinger med 10 µm tykkelse ved hjelp av en kryostaten og holde delene ved-80 ° C før bruk.
Merk: En kan bekrefte GFP uttrykk i delene etter vask ut Tilpasningsverktøy sammensatt med PBS.
5. Immunostaining av Cryosections
- Tørr skliene i room temperature i 30 min og vask to ganger for 10 min i PBS.
- Sirkel delene med en flytende blokkering og Inkuber delene i en sperring løsning (10% normal esel serum i PBS 0,1 prosent Triton-X100) 1t ved romtemperatur.
- Legg til primære antistoffer mot molekyler (f.eks, GFP og topoisomerase II beta (Top2B) i denne studien) interesse blokkerer løsningen og ruge over natten på 4 ° C.
Merk: Navnene og konsentrasjoner av antistoffer brukes er oppført i Tabellen for materiale. For å styrke GFP signaler, kan et anti-GFP antistoff eventuelt brukes sammen med andre antistoffer. - Vask lysbildene med 0,1% Triton inneholder PBST 3 X for 10 min. Incubate delene 1t ved romtemperatur med et fluorophore-konjugerte sekundære antistoff fortynnet i blokkering løsningen som inneholder DAPI.
- Vask lysbildene i PBS 3 X for 10 min. Mount lysbildene og holde på 4 ° C til bildebehandling.
Merk: Protokollen kan pauses her.
6. bildebehandling og analyse
- Bilde delene med AC confocal mikroskop på 20 x forstørrelse.
- Telle antall GFP positive celler å miste uttrykk for målet protein. Et representativt bilde vises i figur 2B.
- Kontroller molekylær fenotypen ved ablasjon av målet genene i GNPs og deres progenies ved immuostaining12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For i vivo funksjonell analyse er det avgjørende å identifisere celler som eksogene gene(s) har blitt innført. Mens uttrykket av en markør som GFP i ikke-voksende celler kan følges opp i lang tid, blir signalet fortløpende borte i voksende celler. En illustrasjon av denne effekten er demonstrert i figur 1. For å omgå mister fotavtrykk av transfekterte celler i LOF analyser, utviklet vi en ny tilnærming ved å kombinere electroporation-baserte gen levering med CRISPR/Cas9-teknologi.
Representant resultater er vist i figur 2. Funksjonaliteten til plasmider konstruksjoner er testet av forbigående transfection av pU6-sgTop2b-Cbh-grobunn og pCAG-F.eks-Top2b-FP17bærer sgTop2b målet sekvensen, i HEK293T celler uttrykke stabilt SpCas9 (figur 2A). SgRNA-guidede Cas9 endonuclease aktiviteten induserer DSB-mediert homologi-rettet reparasjon av EGFP uttrykk kassetten. Derfor, funksjonen til sgRNA var direkte analysert av gjenkjenning av GFP uttrykk. Ifølge Mashiko et al.angir en transfection effektiviteten av mer enn 30% en sgRNA som effektivt17.
GNPs kommer fra rhombic leppen (RL), et område som grenser taket av fjerde ventrikkel på embryonale stadier E12.5 til E16.5. Disse cellene har vært kjent å gjennomgå massiv spredning etter fødselen i ytre eksterne granule lag (oEGL) og skifte til den indre EGL (iEGL) etter spennende celle syklus20. Dermed er GNPs et aktuelle eksempel teste fordelene med vår genetiske etikettmetoden.
Ved å følge denne protokollen, tillater i utero electroporation av GNPs sporing av redigerte celler med GFP. Vi introdusert pU6-sgRNA-Cbh-grobunn plasmider uttrykke sgControl i lillehjernen primordium Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus på gryende scenen E13.5. Mus ble ofret ved postnatal dag P7 og sagittal deler av lillehjernen vev deler var farget av immunohistochemistry. Ytre og indre EGL ble definert av Ki67 uttrykk (oEGL) og p27 uttrykk (iEGL), henholdsvis. Til tross for under spredning og modning, beholdt modne lillehjernen granule neurons (CGNs) fortsatt sterke GFP uttrykk (figur 2B).
Understreker nytten av denne protokollen, brukt vi videre på sgRNA målretting DNA Top2b som et representativt eksempel. Eksperimentell prosedyrer ble utført som beskrevet ovenfor (se figur 2B). De fleste av GFP-positive cellene transfekterte med sgRNAs for Top2b utstilt tap av Top2b uttrykk i interne granule laget (IGL), mens innføring av kontroll sgRNAs ikke resulterte i reduksjon uttrykket (figur 2C). En kvantifisering av dette resultatet vises i figur 2D. Disse dataene presentere et verdifullt verktøy for sporing redigert celler for en lengre periode under utvikling eller tumor formasjon.
Figur 1: skjematisk fremstilling av GFP uttrykk i voksende og ikke-voksende celler. (A) når en eksogene genet koding GFP (f.eks, pCAG-EGFP) er transfekterte i ikke-voksende celler, celler kan uttrykke GFP i lang tid (øvre lane). I mellomtiden forsvinne GFP uttrykk i voksende celler på grunn av fortynning av eksogene GFP (midten kjørefelt). Derimot kan cellene som bærer LoxP-Stop-LoxP-GFP (LSL-GFP) transgene holde det GFP uttrykket under spredning etter hva med grobunn recombinase (nedre lane). (B) prinsippet om SpCas9-mediert genet stanse og GFP uttrykk etter grobunn og sgRNA hva i en Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP musen belastning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant bilder av resultater fra denne protokollen. (A) HEK293T celler uttrykke stabilt SpCas9 var transfekterte med pU6-sgTop2b-Cbh-grobunn og pCAG-F.eks-Top2b-FP plasmider. GFP uttrykk i lever celler var overvåket med et fluorescerende celle imager (se Tabell for materiale) 48 timer etter hva. Venstre og høyre panel viser en effektiv og ikke-effektiv sgRNA rekkefølge basert på GFP uttrykk, henholdsvis. Skalere barer: 100 µm. (B) Immunostaining GFP, Ki67 og p27 på P7 cerebella fra Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus utsatt for electroporation på E13.5 med pU6-sgRNA-Cbh-grobunn plasmider konstruksjoner uttrykke kontroll sgRNA. Delen er counterstained med DAPI (blå). Skalere barer: 50 µm; 20 x forstørrelse. Merk GFP-uttrykke celler i oEGL markert med Ki67. (C) immunostai-av GFP (grønn) og Top2b (magenta) på P7 cerebella fra Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus som var electroporated på E13.5 med pU6-sgRNA-Cbh-grobunn plasmider konstruerer uttrykke sgRNA mot Top2b (sgTop2b) og kontroll-sekvensen (sgControl). Pilene angir Top2b uttrykk i GFP+ celler i feltet. Skalere barer: 20 µm; 20 x forstørrelse. (D) kvantifisering av Top2b i electroporated (GFP-positive) celler i sgControl og sgTop2b eksperimenter. To og tre pups ble undersøkt for sgControl og sgTop2b, henholdsvis, og 25 celler fra hver hjernen ble analysert. Feilfelt representerer ± standardfeil av gjsnitt (SEM) og p-verdier ble beregnet av kortet t-test, *p = 0.0002. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| navn | Sekvens | Programmet | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA mål sekvens | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA mål sekvens | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA mål sekvens | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Kloning i pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Kloning i pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Sekvenser for sgRNA | |
Tabell 1: Sekvenser av oligos som brukes i denne studien.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bruker exo utero electroporation, har vi tidligere rapportert siRNA-basert i vivo funksjonelle analyser av Atoh1 på et tidlig stadium av lillehjernen granule celle differensiering8. SiRNA fortynning/fornedrelse og eksponering av embryo utenfor livmor veggen var fenotypiske analyse av electroporated-granulen cellene begrenset til embryonale stadier. Imidlertid aktivert det aktuelle metoden analyse av fenotypen av postnatal dyr.
Vår forrige studie viste at Cas9-mediert knockout av tumor suppressor Ptch1 via i utero electroporation ble indusert medulloblastoma2. Til sammenligning dagens tilnærming har to store fordeler: 1) Cas9 har ikke leveres med plasmider, slik at flere genet målrette ved å utføre flere sgRNA uttrykk kassetter i en enkelt plasmider i stedet. og 2) målet celler og deres progenies permanent merket med GFP, aktivere visualisering av levende celler og analyse av virkemåten til transformere svulst cellene i vivo.
De viktigste trinnene i denne protokollen er riktig injeksjon av plasmider DNAs til riktig sted og levering av elektriske pulser i de riktige stedene i hjernen. Lillehjernen neurons er født fra lillehjernen neuroepithelium sekvensielt på en måte som fødselsdato-avhengige. Ikke alle typer celler i lillehjernen primordium kan være målrettet via electroporation, fordi bare et bestemt vindu på E12.5-14.5 er teknisk mulig. Dypt lillehjernen kjerner neurons og Purkinje celler er kjent for å oppstå ved E10.5-11.5, når de ekstra-embryonale membranene er ikke gjennomsiktig, og embryoet er ikke synlig for DNA injeksjon. Senere Unipolare pensel celler er avledet fra E17.5 øvre RL (uRL), når fjerde ventrikkel er for smale for å injisere en tilstrekkelig mengde DNA i uRL. Dermed er vår metode bare aktuelt ved E12.5-14.5, som hovedsakelig mål midt - og senere født progenitors, som GNPs og hemmende interneurons. En annen ulempe metoden er at en full knockout fenotypen ikke er mulig i forhold til grobunn/LoxP-mediert germline GEMMs, siden bare tusenvis av lillehjernen celler kan målrettes etter electroporation i hver fosteret.
I en tidligere studie celler omtrent 80% av GFP-positive lillehjernen granule mistet uttrykk av målrettet genet12. Mens granule cellene identitet ble bekreftet av molekylære markører og deres distribusjon, kan denne identifikasjonen ikke være alltid anvendelig, som gener av interesse kan være involvert i markør uttrykk og neuronal migrasjon. Betinget aktivering av grobunn bruker en celle-spesifikke promoter ville løse problemet i dette tilfellet. Derfor kan den nåværende allestedsnærværende Cbh formidler i pU6-sgRNA-Cbh-grobunn plasmider erstattes med en celle-spesifikke promoter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim og Petra Schroeter for teknisk assistanse. Vi takker også Dr. K. Reifenberg og K. Dell P. Prückl nyttig hjelp for dyreforsøk på DKFZ; Imaging Core fasilitetene på DKFZ og Carl Zeiss Imaging Center i DKFZ for AC confocal mikroskopi bildebehandling. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (til dk).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
