Summary
ノックアウト動物を用いた遺伝子の機能喪失従来は、高価で時間のかかる多くの場合されています。CRISPR 媒介体細胞突然変異誘発のエレクトロポレーション ベースは遺伝子の生体内の機能を理解するための強力なツールです。小脳の細胞増殖にノックアウトの表現型を解析する手法を報告する.
Abstract
脳の奇形はしばしば遺伝の突然変異によって引き起こされます。解読患者由来組織の突然変異は病気の潜在的な原因となる要因を識別しています。発病する変異遺伝子の機能不全の貢献度を検証するため、突然変異を運ぶ動物モデルの生成はわかりやすいアプローチの 1 つです。生殖細胞系遺伝子組み換えマウス モデル (GEMMs) 人気のある生物学的ツールと再現性のある結果を展示、それは時間とコストによって制限されています。一方、非生殖 GEMMs は、しばしばより現実的な方法で探索の遺伝子機能を有効にします。いくつかの脳から体に起因する病気 (例えば、脳腫瘍) が見えて、ない生殖細胞系突然変異、非生殖細胞キメラ マウス モデル、正常と異常な細胞が共存疾患関連する分析のために有用かもしれない。本研究では、小脳に CRISPR 媒介体細胞突然変異の誘導法を報告します。具体的には、利用条件付きノックアウトのマウス、 Cas9とGFPの慢性的なアクティブ化するCAG (CMV エンハンサー/鶏 β-アクチン) プロモーターでCre後-ゲノムの組換えを介した。自己設計されていたシングル ガイド Rna (sgRNAs) と単一プラスミド構築でエンコードされた両方 Cre リコンビナーゼ シーケンスは、子宮内でエレクトロポレーションを使用して萌芽期の段階で小脳幹/前駆細胞に渡されました。その結果、transfected セルおよびその娘細胞は緑色蛍光タンパク質 (GFP) ため、さらに表現型解析が容易で付けられました。したがって、このメソッドは、胚性小脳細胞へのエレクトロポレーション法による遺伝子導入を示すだけでなく、また CRISPR 媒介機能喪失の表現型を評価する定量的手法を提案します。
Introduction
脳疾患は、最も恐ろしいの致命的な病気の一つです。彼らはしばしば起因遺伝的変異とその後破綻。脳疾患の分子機構を理解するには、人間の患者のゲノムを解読する永遠に続く努力は、潜在的な原因となる遺伝子の数を発見しました。これまでのところ、体内の利得の機能 (GOF) とそのような候補者の遺伝子の機能喪失 (LOF) 解析の生殖細胞系遺伝子組み換え動物モデルが利用されています。機能検証研究の加速の開発によりより実現可能で柔軟な生体内遺伝子アッセイ系遺伝子の機能を研究するためお勧めします。
マウス脳の発達する生体内でエレクトロポレーションを用いた遺伝子伝達システムのアプリケーションは、この目的に適しています。実際、子宮内エレクトロポレーションを使用していくつかの研究は、発展途上の脳1,2,3の機能解析を行うことの可能性を示しています。実際には、マウスの脳、大脳皮質4網膜5間脳6、7菱脳、小脳8脊髄9などのいくつかの地域は、体細胞の遺伝子導入による対象となっています。これまでアプローチ。
確かに、マウス萌芽期の脳に生体内でエレクトロポレーションによる一時的な遺伝子発現は GOF 分析のため長い間使用されています。さらに最近のトランスポゾンを用いたゲノム統合技術有効利息10,11, 遺伝子の長期および/または条件式中に空間的で、一時的な方法で遺伝子機能を解剖に有利であります。開発。GOF 解析と対照をなして LOF 分析は難しくされています。Sirna と shRNA 運ぶプラスミドのトランスフェクションが実行されますが、外因に導入された核酸、プラスミドなど二本の最終的な劣化による遺伝子の LOF の長期効果は保証されません。ただし、LOF 解析におけるブレークスルー CRISPR/Cas 技術を提供します。蛍光蛋白質 (例えばGFP) または (例えばホタルのルシフェラーゼ) の発光タンパク質をコードする遺伝子は、CRISPR Cas9 と sgRNAs CRISPR Cas9 媒介体細胞突然変異の細胞をラベルする co transfected されて持っています。それにもかかわらず、このアプローチ制限機能研究では増殖細胞外因性マーカー遺伝子を希釈し、長期的な増殖後低下するので。Transfected セルおよびその娘細胞は、CRISPR による突然変異、ゲノムを受ける中、彼らの足跡を時間をかけて失われて得るかもしれない。したがって、遺伝的ラベリングのアプローチはこの問題を克服するために適当でしょう。
我々 は最近、分化12長期的な増殖を受ける小脳顆粒細胞における CRISPR ベース LOF 方式を開発しました。遺伝子 transfected セルにラベルを付ける、 Creと共に sgRNA を運ぶプラスミドを構築し、Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP マウス13 子宮内エレクトロポレーションを用いた小脳にプラスミドを導入します。異なり、通常のプラスミッドのベクトルは EGFP をエンコード、このアプローチ ラベル付け transfected 顆粒ニューロン前駆体 (GNPs) とその娘細胞。このメソッドは、通常の脳の発達と腫瘍が発生しやすい背景における増殖細胞に興味の遺伝子の生体内で機能を理解する上で素晴らしいサポートを提供します。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
すべての動物実験は動物福祉規則に従って実施し、責任がある権限によって承認されている (Regierungspräsidium カールスルーエ、承認番号: G133/14、G48/14、G32/14 G176/13 G90/13)。
1. pU6-sgRNA-Cbh-Cre プラスミドを生成します。
- 以前に発行されたプロトコル14によると - 興味の遺伝子を対象とする sgRNA をデザインします。
注: この実験では、2 つの sgRNAs マウスTop2b遺伝子と非ターゲット コントロール sgRNA (表 1) をターゲットに設計されています。ノックアウト遺伝子 CRISPR 技術を使用して、sgRNAs 5' 領域のコード配列または蛋白質の不可欠の機能ドメインをターゲットに設計する必要があります。1 つの便利な出発点は、GeCKO v2 マウス ノックアウト プール図書館15張研究室からシーケンスなどの公開前設計されていた sgRNA をテストすることです。また、sgRNAs は、次のウェブサイトなど公共利用可能なソフトウェアを使用してデザインできるようにする: crispr.mit.edu。 - PU6-sgRNA-Cbh-Cre ベクトルに、sgRNAs を複製します。
注: 本研究で用いた pU6-sgRNA-Cbh-Cre ベクター12は、 Creリコンビナーゼ SpCas9 のコーディング シーケンスを置き換えることによってオリジナルの pX330 プラスミド16から派生されます。- 2 つの DNA oligos をとおり合成します。意味: 5 ' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3';アンチセンス: 3 ' 5' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA。
注: 20 N の sgRNA シーケンスのためのスタンド上に示した。 - PU6-sgRNA-Cbh-Cre BbsI で次の試薬を用いる 37 ° C で 30 分間のダイジェスト、1% のアガロースゲルを消化のサンプルをロードし、ゲルの抽出キットを使用してそれらを浄化します。3 μ g のプラスミド;3 μ L掲示板;1 μ L FastAP;5 μ L 10 x 消化バッファー;ddH2O 50 μ L の総ボリュームをさせるを追加します。
- リン酸化し、(10 μ L 容量) の次の試薬を用いる sgRNA oligos の各ペアをアニール: 1 μ L カスタマイズ感覚オリゴ (100 mM);1 μ L カスタマイズ アンチセンス オリゴ (100 mM);1 μ L 10 x T4 結紮バッファー;6.5 μ L ddH2O;0.5 Μ L T4 PNK。37 ° C で 30 分間熱 cycler で孵化させなさいと 95 ° C、5 ° C/分で 25 ° C までランプで 5 分。
- 次の ligation の反作用を設定し、室内温度 (10 μ L 容量) で 10 分間インキュベート: プラスミッドを消化され X µL掲示板(50 ng);1 μ L のリン酸化し、焼なまし、oligo 二重 (1: 200 希釈);5 μ L 2 x 結紮バッファー;X µL ddH2O;1 μ L クイック リガーゼ。
- DH5α大腸菌の化学的に有能なセルの 50 μ L に結紮製品の 2 μ L を追加します。氷のインキュベーションの 30 分後に熱衝撃 90 のサンプル s、42 ° C で氷の上 2 分間インキュベートし、。LB 培地の 100 μ L を追加し、100 μ g/mL アンピシリン含有 LB プレート上にプレートします。
メモ: pU6-sgRNA-Cbh-Cre プラスミドに sgRNA シーケンスの統合は pX330 プラスミド14クローン作成の手順に従って実行されます。 - 6 h 以上の 37 ° C で LB 培地 2 mL にそれぞれ 2 つのコロニーを接種し、キットを使用して小型準備 DNA 分離を実行します。
- サンガーは、hU6 フォワード プライマーを用いた小型準備 DNA のシーケンスし、ステップ 1.2.1 に示すシーケンスと合わせ、sgRNAs の正しい挿入したコロニーを識別します。プライマー シーケンスを表 1に示します。この研究に供するプラスミドは、pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre、pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre と pU6-sgControl-Cbh-Cre に名付けられました。
- 正しく識別されるコロニーを接種して、例えば、Qiagen からキットを使用して子宮内エレクトロポレーションのエンドトキシンのプラスミド DNA を浄化します。1:10 (10 %te バッファー) で ddH2O で希釈したエンドトキシン TE バッファーと DNA を溶出します。プラスミッドの DNA 濃度は、2 mg/mL よりも高くする必要があります。
注: は、DNA の準備のため正規マキシ準備キットを使用しないでください。約 25 μ L の適切なボリュームを定期的に短期使用 (4 週間)、または因数の 4 ° C でプラスミド ソリューションに格納し、長期保存のための-20 ° C で保管します。
- 2 つの DNA oligos をとおり合成します。意味: 5 ' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3';アンチセンス: 3 ' 5' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA。
2. EGxxFP プラスミドを用いた sgRNAs の効率性をテストします。
注: sgRNAs の効率は通常の測量または T7E1 によってテストされる (T7 エンドヌクレアーゼ私) 試金。このプロトコルでは、簡単で効率的な方法が使用されます。このアプローチのキーは、ターゲット サイト17sgRNA を含む DNA シーケンスで区切られた重複の EGFP フラグメントが含まれている pCAG EGxxFP プラスミドを使うことです。Transfected セルで Cas9、sgRNA と pCAG EGxxFP の発現、ターゲット シーケンスの Cas9 を介した二重鎖切断 (DSB) が修復される内因性の相同性に依存したメカニズムによって EGFP 発現を再構成します。カセット。
- シーケンスをターゲット sgRNA を中心としたゲノム領域を増幅するプライマーを設計します。PCR 増幅が約 500 bp。この実験では DNA アセンブリは pCAG EGxxFP プラスミドに PCR 増幅断片のクローンに適用されました。
注: 別の方法として、適切な制限のサイト追加できます、PCR のプライマーの 5' 末端に。PCAG EGxxFP ベクトルの利用制限のサイトは、病原、NheI、PstI、サリ、EcoRI、EcoRV。 - フォームと PCR パラメーター以下の使用に設計されたプライマーとゲノム DNA を増幅します。サンプルをロード (19.7 μ L H2O; 0.3 μ L の 10 ng/μ L マウス genomic DNA; 2.5 μ 10 μ M EGxxFP-Top2b-F; 2.5 μ 10 μ M EGxxFP-Top2b-R; 25 μ L 2 PCR マスター ミックス X 50 μ L の総ボリューム) 1% の agarose ゲル、ゲルはゲルの抽出キットを使用して PCR のフラグメントを浄化します。次の反応条件: 95 ° C を使用して、3 分。35 x サイクル 98 ° C の 20 s、60 ° C、15 s、72 ° C の 20 s、72 ° C 1 分;4 ° C、無期限に。
注: この実験Top2bエクソン 1 の 1 つの領域が増幅されました。表 1のプライマー シーケンスを見つけます。 - ダイジェスト病原と 1% アガロースゲルにサンプルをロードし、37 ° C で 2 h の EcoRI 制限の酵素と pCAG EGxxFP ベクトル ゲル、ゲルはゲルの抽出キットを使用してベクター バックボーンを浄化します。次の試薬 (50 μ L 容量) を使用して、: X µL プラスミド (3 μ g);2 μ L 病原;2 μ L の EcoRI;5 μ L 10 x バッファー;X µL ddH2o.
- 製造元の指示に従って DNA アセンブリ反応18を設定し、DH5α 有能なエシェリヒア属大腸菌に変換します。
- 2 人のコロニーを接種する、6 h 以上の 37 ° C で LB 培地に各 2 mL、例えばQiagen からキットを使用して小型準備の DNA の隔離を実行し、(以下、pCAG-例えば-Top2b-FP) 正しい挿入したコロニーを識別サンガーを使用してEGxxFP-Top2b-F プライマーによるシーケンス。
- Transfect HEK293T 細胞。
- 種子、HEK293T 細胞トランスフェクション前に 24 h 24 ウェル プレートに。
注: 細胞培養した結果 37 ° C セルのインキュベーターで 5% CO2 DMEM でグルタミン 10 %fbs および 1% を含むペニシリン/ストレプトマイシン。セルが当日 transfection の 60% の合流であるを確認します。この実験は、自作 HEK293T 細胞安定に発現する SpCas9 を使用 pU6-sgRNA-Cbh-Cre をテストします。ただし、SpCas9 表現のベクトルを指定した場合は、野生型 HEK293T 細胞を使用できます。 - ポリエチレンイミン (PEI) 試薬を用いた HEK293T 細胞を transfect します。Transfect 120 ng/pCAG-例えば-Top2b-FP プラスミド12ウェルの細胞と 120 ng/pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre の pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre 24 ウェル プレートでも。プラスミド Dna をミックスしてボルテックス後室温で 15 分間インキュベート 1.8 μ L グルタミンと培 DMEM 培地 80 μ L でペイ試薬の補足。
- 6 h、トランスフェクション後は、メディアを削除し、新鮮な培地で置き換えます。
- 20 倍の倍率で蛍光顕微鏡を用いてトランスフェクション後生きている GFP+セル 48 h の存在を監視します。
注: GFP+細胞の数は、sgRNA のターゲット効率を示します。効果的かつ非効果的な sgRNAs の結果 (sgTop2b 1、sgTop2b 2、それぞれ)、図 2 aに示すように。
- 種子、HEK293T 細胞トランスフェクション前に 24 h 24 ウェル プレートに。
3.子宮内エレクトロポレーションを実行します。
- 8 週齢のマウスに 6 を繁殖し、子宮内エレクトロポレーション用ツールを準備します。男性ホモRosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFPクロス女性 CD 1 マウスとマウス。膣のプラグは日から CD 1 マウスの妊娠を検出 (E0.5) 時間。胚は、日 E13.5 electroporated です。
- ホウケイ酸ガラス管を引く (内径: 0.6 0.8 mm) マイクロ ピペット引き手と。次の設定を使用: P = 500、熱 560、プルを = = 150、ヴェル = 75、時間 = 250。注入中のより良い視覚化の黒インクで先端部にキャピラリーをラベル付けします。定規を使って顕微鏡下毛細血管のテーパをトリムし、鋭い針ピンセット約 6 mm の長さで先端をトリミングします。
- 実験の再現性を保つために毛細血管の単一性を維持します。トリミング時に片側面取りエッジを作成します。先端は、浸透しやすい子宮壁の胚の組織の損傷を避けるために、できるだけシャープにする必要があります。
注: また、1935 ° の角度を調整するのにマイクロ グラインダーを使用します。毛細血管は、10 cm シャーレ病原体フリーの条件下で常温保存できます。 - オートクレーブ手術器具。
- 高速グリーン (最終濃度 0.05%) とプラスミド ソリューション pT2K IRES-リュック プラスミドとカラーごとに少なくとも 1 μ g/μ L の最終濃度に等しい部品の sgRNA プラスミドをミックスします。色素粒子をソリューションから削除する 0.22 μ m のフィルターを通してエンドトキシン蒸留水とフィルター 1% 高速グリーン原液を準備します。
注: pT2K IRES リュックとの共トランスフェクションはオプションですを実行可能な electroporated 動物の生物発光イメージングを使用して出生後に識別できます。3.5 の手順を参照してください。妊娠マウス操作の合計数のプラスミド ミックスの十分な量を準備します。について使用マウスあたり 15-20 μ L ミックス (〜 12 胚)。すぐに手術を進めます。
- マウスを手術に備えます。
- イソフルランと妊娠の CD 1 マウスを麻酔します。3-4 vol % イソフルランとボックスの麻酔 (酸素流量: 1.5 L/分) 鼻の円錐形によって手術中 2 vol % とそれを維持します。
メモ: 完全な手術所要時間は 30 分の数を減らすよりも注入と electroporated の胚は、必要に応じて。外科用滅菌手袋を使用します。 - 加熱パッドの上にマウスを置くし、麻酔を調整します。
- 鎮痛剤を注入 (Metamizol, 800 mg/kg 本体重量、皮下 (サウスカロライナ)、24 h デポ)。
注: Metamizol よりもその他の承認された鎮痛薬を使用可能性があります。 - 手術中に目の乾燥を防ぐために眼軟膏を適用します。
- テープで手足を固定し、殺菌消毒剤で腹部。公開手術の領域だけを残して、ガーゼでマウスをカバーします。外科領域とガーゼに 70% エタノールを広がってください。
- 長さ約 2 cm の皮膚切開を行うし、外科用のはさみでそっとのギャップを広げます。リネアを見つけてアルバとわずかに小さい第 2 組織を用いた腹膜切開鈍チップではさみ。
- あらかじめ加温滅菌 1 で開かれた腹腔内を湿らせて PBS x。
- リング鉗子を用いた腹腔内から子宮角を慎重に抽出します。2 つの近隣の胚の卵黄嚢の間のギャップのみを子宮壁を掴んで軽く引き出します。切開して引きながら胚の任意の圧力を避けます。必要に応じて切開を拡大し、子宮動脈の血流を圧縮しないしながら腹部に子宮角の位置に余分な世話をします。
注: いくつかのケースでそれを勧め、時に片側子宮角を抽出し、それを置き換える 2 番目の子宮角に進む前に。
- イソフルランと妊娠の CD 1 マウスを麻酔します。3-4 vol % イソフルランとボックスの麻酔 (酸素流量: 1.5 L/分) 鼻の円錐形によって手術中 2 vol % とそれを維持します。
- 注射とプラスミド Dna へのエレクトロポレーション
- 準備のガラス管を着色プラスミド溶液の約 15 μ L を吸い出しなさい。このプロセス中に任意の気泡を避けるため。
注: プラスミド ソリューションすることができます先端簡単に詰まらせるその濃度が高い場合。注射の前にいくつかの DNA を解放することによって、毛細血管をテストします。 - 優しくリング鉗子で胎児を保持し、首のエリアを探します。
注: 胎児が注入する困難な位置にある場合、それをスキップして、次の胚のために行きます。胚の増加を再配置すると、それらに損傷のチャンスが増加します。 - ゆっくりと背側の後脳を貫通して第 4 脳室に事前に準備されたガラス管の先端で穴を開けるし、その後プラスミド ミックス約 1 μ L を注入します。染めの DNA、脳からリークされていない、菱形の構造として表示されますを確認します。
注: オプションとして第 4 脳室のより良い視覚化のため 2.5-fold ルーペを使用して、血管を囲んでします。他の心室にプラスミド溶液の拡散を防ぐために注入後すぐに電気パルスを提供します。 - 電気正方形パルスを適用 (32 5 パルス mV、50 ms で、950 ms オフ) 鉗子のようなプラチナ ピンセット (材料の表を参照してください)。耳と子宮壁を置いた小脳原基の肯定的な棒をカバーする否定的な棒で横方向に電極を配置します。E13.5 胚への効果的なエレクトロポレーション用 5 mm 径の電極板を使用します。
注: は、ダムあたりの胚の合計数未満の 2/3rdを操作することによって子犬の生存率を高めます。子宮に胚を余りに近くは避けてください。操作された場合、彼らは分娩中に合併症を引き起こす可能性があります、全体のごみを危険にさらします。場合は電極があまりにも胎児の心臓に近いこれは心停止を引き起こす可能性があります。
- 準備のガラス管を着色プラスミド溶液の約 15 μ L を吸い出しなさい。このプロセス中に任意の気泡を避けるため。
- ポスト エレクトロポレーションと手術後のケア
- 慎重に子宮角を腹腔内に配置し、塗りつぶしを予め加温滅菌 1 × PBS。自然な位置に子宮角スライドができます。
- 腹膜と個別に簡単な連続縫合で皮膚を閉じます。
注: は、腹膜の縫合時に子宮の壁を貫通しないように注意して余分なを取る。 - シャット ダウン、麻酔、新しいケージに動物の腹を下に置きます。
- 手術後覚醒の位相と再び 24 時間中に動物を監視します。15 分の期間内で改善されない震えと動物は毛づくろいを起動しない場合は、加熱ランプの下でケージを配置します。
- ルシフェラーゼ イメージングによる成功のエレクトロポレーションを確認します。
- 運営のダム (E19.5) 時に胚は削除ことを確認します。
注: 生年月日遅れる可能性があります次の日におそらく操作のため。 - 2.5% イソフルランと electroporated の子犬 (P5 P7) を麻酔し、イメージングの前に 5 分 D-ルシフェリン (3 mg/kg 体重) と (腹腔内 (i. p.)) を挿入します。
- 生物発光の撮像素子を使用して electroporated の仔ラットのルシフェラーゼ信号を検出します。
注: 1 分露光時間はルシフェラーゼ信号を検出するのに十分です。ラディアンス (/sr p/s/cm2) が約 > 1 × 106。
- 運営のダム (E19.5) 時に胚は削除ことを確認します。
4. Electroporated 小脳から凍結切片を準備します。
- Electroporated P7 子犬を安楽死させるし、小脳を分析します。
注: GFP 信号は、epifluorescent 立体を使用して観察できます。 - 4% の脳あたり 5 mL で一晩、小脳を修正 4 ° C で PBS で PFA
- 10 mL の PBS で 4 ° C で 30% ショ糖の脳あたりに一晩固定の小脳を転送します。
注: 組織ショ糖液で培養後 15 mL チューブの下部に到達する必要があります。 - セルロースろ紙の部分で残りのショ糖液を浸漬後最適な切削温度 (OCT) 使い捨てプラスチック金型の複合で小脳のドライアイスで凍結します。極低温のブロックは、使用するまで-80 ° C で保存できます。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。 - クライオスタットを用いた膜厚で 10 μ m のセクションに極低温ブロックをカットし、使用するまで-80 ° c のセクションを保ちます。
注: 1 つは OCT を PBS で化合物を洗浄した後のセクションで GFP 発現を確認できます。
5、凍結切片の免疫染色
- 30 分間室温、PBS で 10 分のため 2 回の洗浄でスライドを乾燥させます。
- 液体ブロッカー ペンでセクションを一周し、ブロッキング液でセクションを孵化させなさい (0.1% を含む PBS で 10% 通常ロバ血清トリトン X100) 室温で 1 時間。
- ブロッキング剤 (例えばGFP、トポイソメラーゼ II ベータ版 (Top2B) 本研究で) 興味の分子に対する一次抗体を追加し、4 ° C で一晩インキュベート
注: 名前と使用される抗体の濃度は、材料表に表示されます。GFP 信号を高めるために、他の抗体と抗 GFP 抗体を必要に応じて使用できます。 - DAPI を含むブロッキング液で希釈した蛍光標識二次抗体で室温で 1 時間セクション 0.1% トリトン含む pbst; 3 X で 10 分間加温してスライドを洗ってください。
- 洗浄は PBS 3 X 10 分山で滑るスライドとイメージングまで 4 ° c を維持します。
注: プロトコルはここで一時停止することができます。
6. 画像処理と解析
- 20 倍の倍率で共焦点の顕微鏡を使用してセクションをイメージします。
- ターゲット蛋白質の表現を失う GFP 陽性細胞数をカウントします。代表的な画像を図 2 bに示します。
- Immuostaining12GNPs とその後代のターゲット遺伝子のアブレーションに分子表現型を確認してください。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
生体内機能解析、外因性遺伝子が導入された細胞を識別するために重要です。マーカーの表現は、非増殖細胞における GFP でくフォロー アップの時間の長い期間のような信号は細胞増殖に順番に失われます。この効果の実例は、図 1に示されています。LOF 分析 transfected セルのフット プリントを失うことを回避するために CRISPR/Cas9 技術とエレクトロポレーション法による遺伝子導入を組み合わせることで新しいアプローチを開発しました。
代表的な結果は、図 2のとおりです。PU6-sgTop2b-Cbh-Cre のトランスフェクションによってプラスミドの構成要素の機能をテストし、安定に発現する SpCas9 細胞の pCAG の-例えば-Top2b-FP17、sgTop2b ターゲット シーケンス、HEK293T を運ぶ (図 2 a)。SgRNA ガイド Cas9 a エンドヌクレアーゼ活性は EGFP 発現カセットの DSB を介したホモロジー監督修理を誘導します。したがって、sgRNA の機能は、GFP 発現の検出によって直接行った。益子らによると 30% 以上のトランスフェクション効率は効果的な17として、sgRNA を決定します。
GNPs は菱形リップ (RL)、E16.5 まで E12.5 の胚の段階で第 4 脳室の屋根に接する地域に属します。これらの細胞は、細胞周期20の終了後外外部顆粒層 (oEGL)、(iEGL) の内部の EGL へのシフトで出生後大規模な増殖を受けることを知られています。したがって、GNPs は、私たちの遺伝的ラベリング手法の利点をテストする適切な例です。
このプロトコルに従うことによって GNPs の子宮内エレクトロポレーションは GFP で編集されたセルのトレースをできます。胎生期 E13.5 にRosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFPマウスの小脳原基に sgControl を発現 pU6-sgRNA-Cbh-Cre プラスミドを導入しました。マウスは生後、P7 でささげられたし、矢状セクション小脳組織切片の免疫組織化学的染色します。外側と内側の EGL はそれぞれキ67 式 (oEGL) と p27 の式 (iEGL) によって定義されました。増殖と成熟を実施したが、成熟した小脳顆粒ニューロン (CGNs) はまだ強い GFP 発現 (図 2 b) を保持します。
このプロトコルのユーティリティを重視し、我々 はさらに代表的な例として DNA Top2b をターゲット sgRNA を使用しました。実験プロシージャを行った (図 2 bを参照してください) 上記のよう。Top2bの sgRNAs をトランスフェクトした GFP 陽性細胞のほとんどは、sgRNAs がその表現 (図 2) の明確な減少で起因しなかった制御導入し内部顆粒層 (IGL) で Top2b 式の損失を展示しました。この結果の定量化が図 2 Dで表示されます。これらのデータは現在の開発や腫瘍の形成間の長い期間の編集されたセルをトレースするための貴重なツールです。
図 1: 増殖と非増殖細胞における GFP 発現の略図。(A) エンコードGFP (例えば、pCAG EGFP) は非増殖細胞、細胞にトランスフェクションする外因性の遺伝子は長い間 (上部レーン) GFP を述べることができるとき。一方、GFP 発現は外因性GFP (中央の車線) の希釈による細胞増殖に消えることができます。対照的に、 , 停止, GFP (LSL GFP) 遺伝子を運ぶ細胞は Cre リコンビナーゼ (低いレーン) のトランスフェクション後増殖 GFP 発現を保つことができます。(B) の原理 SpCas9 を介した遺伝子サイレンシングとCreと sgRNA、Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP トランスフェクション後の GFP 発現マウス緊張。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: このプロトコルからの結果の代表的なイメージです。(A) HEK293T の安定に発現する SpCas9 細胞が pU6-sgTop2b-Cbh-Cre と pCAG の-例えば-Top2b-FP プラスミドをトランスフェクトしました。蛍光セルの撮像素子を使用して生きた細胞における GFP 発現モニタリング (材料表参照) トランスフェクション後 48 h。左と右のパネルは、それぞれ GFP 発現に基づく効果的かつ非効果的な sgRNA シーケンスを示します。スケール バー: 100 μ m. GFP、キ67、 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFPマウスから P7 小脳の p27 の (B) 免疫染色を受ける E13.5 にエレクトロポレーション pU6-sgRNA-Cbh-Cre プラスミドの構造制御 sgRNA を表現するのに。セクションは、DAPI (青) と counterstained です。スケール バー: 50 μ m;20 倍の倍率。キ67 でマーク oEGL の GFP 発現細胞を注意してください。(C) GFP 免疫染色 (緑) と Top2b (マゼンタ) pU6-sgRNA-Cbh-Cre プラスミド E13.5 に electroporated をしたRosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFPマウスから P7 小脳の構築 Top2b に対して表現する sgRNA (sgTop2b) と制御シーケンス (sgControl)。矢印は、同じフィールドで GFP+細胞における Top2b の発現を示します。スケール バー: 20 μ m;20 倍の倍率。(D) 定量化の Top2b sgControl、sgTop2b の実験では electroporated (GFP 陽性) 細胞で。それぞれ、sgControl と sgTop2b、2 つのと 3 つの子犬を調べたし、25 それぞれの脳細胞を分析しました。誤差範囲を表す平均 (SEM) とp± 標準誤差-対になっていないtで算出した値-テスト、*p = 0.0002。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 名 | シーケンス | アプリケーション | |
| sgTop2b 1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA ターゲット シーケンス | |
| sgTop2b 2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA ターゲット シーケンス | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA ターゲット シーケンス | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | PCAG EGxxFP へのクローニング | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | PCAG EGxxFP へのクローニング | |
| hU6 F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | SgRNA のシーケンス | |
表 1: 本研究で使用されている oligos のシーケンス。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exo 子宮エレクトロポレーションを使用すると、以前 siRNA ベースは生体内での機能解析 Atoh1 小脳顆粒の初期の段階で細胞分化8を報告した.SiRNA 希釈/劣化と子宮壁外胚の露出のため electroporated 顆粒細胞の表現型の分析は、胚の段階に限られていた。ただし、現在のメソッドは生後動物の表現型の分析を有効にします。
私たちの以前の研究を示した子宮内エレクトロポレーションに成功した髄芽腫2を介して腫瘍のサプレッサー Ptch1の Cas9 を介したノックアウト。比較では、現在のアプローチは、2 つの主要な利点を展示: 1) Cas9 する必要はありません、プラスミドで配信される複数遺伝子の代わりに単一のプラスミドで複数の sgRNA 式カセットを運ぶことによってターゲットを可能にします。・ 2) 標的細胞とその後代が永久に付け GFP、生きた細胞の可視化を有効にして、 in vivo細胞腫瘍を変換の動作の解析。
このプロトコルの最も重要な手順は、プラスミド Dna を適切な場所に適切な注入と脳の適切な場所に電気パルスの配信です。小脳のニューロンは、小脳の神経上皮から生年月日依存的に順番に生まれています。小脳原基の細胞のすべての種類は、E12.5 14.5 で特定期間は技術的に可能なので、エレクトロポレーション、を介して対象できます。深部小脳核ニューロンとプルキンエ細胞は、胚体外膜が透明でないと胚は DNA 注入にはっきりと写っていないときに E10.5-11.5 で発生する知られています。その後、単極ブラシ細胞由来 E17.5 上部 RL (uRL)、第 4 脳室は、uRL 近傍の DNA の十分な量を注入には狭すぎます。したがって、本手法のみ E12.5-14.5, GNPs と抑制性介在ニューロンなどの半ば、後-生まれ前駆細胞を主にターゲットに適用されます。メソッドのもう一つの欠点は完全ノックアウトの表現型がそれぞれの胚でエレクトロポレーションの小脳の細胞のだけ何千も対象にできるので、Cre/LoxP を介した生殖 GEMMs と比較されたとき実行可能なできない場合があります。
以前の研究では、GFP 陽性小脳顆粒の約 80% は失われた12の目標とされた遺伝子発現を細胞します。顆粒細胞の分子マーカーとその分布によって確認された、一方この識別する方法常に適用されない、興味の遺伝子をマーカーの発現と神経細胞移動に関与することに。Creセル固有のプロモーターを使用して条件付き活性化は、ここでは問題を解決するでしょう。したがって、セル固有のプロモーターと pU6-sgRNA-Cbh-Cre プラスミドで現在ユビキタス Cbh プロモーターを置き換えることができます。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
テクニカル サポートにローラ ジーバー、アンナ Neuerburg、ヤシン ハリムとペトラ, を申し上げます。我々 もありがとう夫妻・ k ・ Reifenberg、k. デル、P. Prückl DKFZ; で動物実験の支援イメージング コアの施設、DKFZ とカール ツァイス イメージング センター、DKFZ 共焦点顕微鏡画像。この作品は、ドイツ研究振興協会、KA 4472/1-1 (に称えられ) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
