Summary
Konventionelle Verlustfunktion-Studien von Genen mit Knockout-Tiere wurden oft kostspielig und zeitaufwendig. Elektroporation-basierte CRISPR-vermittelte somatische Mutagenese ist ein leistungsfähiges Werkzeug, gen in VivoFunktionen zu verstehen. Hier berichten wir über eine Methode, um Ko-Phänotypen in proliferierenden Zellen des Kleinhirns zu analysieren.
Abstract
Fehlbildung des Gehirns wird oft durch genetische Mutationen verursacht. Entschlüsselung der Mutationen bei Patienten gewonnenem Gewebe hat mögliche ursächliche Faktoren der Krankheiten identifiziert. Um den Beitrag der eine Dysfunktion der mutierten Gene zur Krankheitsentwicklung zu validieren, ist die Generation von Tiermodellen, die Mutationen tragen ein offensichtlicher Ansatz. Während Keimbahn gentechnisch Mausmodellen (GEMMs) sind beliebte biologische Hilfsmittel und reproduzierbare Ergebnisse aufweisen, ist beschränkt durch die Zeit und Kosten. Unterdessen können nicht Keimbahn GEMMs oft erkunden Genfunktion in praktikabler Weise. Da einige Gehirn Krankheiten (z.B. Hirntumoren) scheinen aus somatischen ergeben aber nicht Keimbahn-Mutationen, nicht Keimbahn chimärer Maus-Modellen, in der normale und abnormale Zellen nebeneinander bestehen, für die krankheitsrelevanten Analyse hilfreich sein könnte. In dieser Studie berichten wir über eine Methode zur Einarbeitung von CRISPR-vermittelte somatische Mutationen im Kleinhirn. Speziell, wir nutzten bedingte Knock-in Mäusen, in denen Cas9 und GFP chronisch durch die CAG (CMV Enhancer/Huhn ß-Actin) Projektträger nach Cre aktiviert sind-vermittelten Rekombination des Genoms. Selbst entworfene Single-Guide RNAs (SgRNAs) und die Cre-Rekombinase-Sequenz, beide in einer einzigen Plasmid-Konstruktion, kodiert wurden in zerebelläre Stamm/Vorläuferzellen im Anfangsstadium mit in Utero Elektroporation geliefert. Infolgedessen wurden transfizierten Zellen und ihre Tochterzellen mit grün fluoreszierenden Proteins (GFP), und erleichtert so die phänotypische Analysen beschriftet. Daher ist diese Methode nicht nur Elektroporation-basierte gen Lieferung in zerebelläre Embryonalzellen zeigen aber auch vorschlagen einen neuartigen quantitativen Ansatz um CRISPR-vermittelten Verlustfunktion-Phänotypen zu beurteilen.
Introduction
Erkrankungen des Gehirns sind eines der schrecklichsten tödlichen Krankheiten. Sie resultieren oft aus genetischen Mutationen und anschließende Dysregulation. Zum Verständnis der molekularer Mechanismen von Erkrankungen des Gehirns haben immer anhaltende Anstrengungen zu entschlüsseln, die Genome von menschlichen Patienten eine Reihe von möglichen begründenden Genen entdeckt. Bisher wurden Keimbahn gentechnisch Tiermodellen in Vivo Gain-of-Function (GOF) und Verlustfunktion (LOF) Analysen von solchen Kandidatengenen genutzt. Durch die beschleunigte Entwicklung von funktionalen Validierungsstudien ist eine praktikable und flexible in Vivo gen Testsystem für das Studium der Genfunktion wünschenswert.
Die Anwendung einer in Vivo -Elektroporation-basierte gen-Transfer-System, das sich entwickelnde mausgehirn ist für diesen Zweck geeignet. In der Tat haben mehrere Studien in Utero Elektroporation mit ihr Potenzial durchzuführen Funktionsanalysen in die entwickelnde Gehirn1,2,3gezeigt. Tatsächlich haben mehrere Regionen des Gehirns Maus, z. B. die Großhirnrinde4Retina5, Zwischenhirn6, Hinterhirn7, Kleinhirn8und Rückenmark9 durch somatische Gentherapie Lieferung ins Visier genommen Ansätze, so weit.
In der Tat hat transiente Genexpression von in Vivo Elektroporation auf embryonale mäusegehirnen lange für GOF-Analyse verwendet. Den letzten Transposon-basierte genomische Integrationstechnologien weiter aktiviert langfristige und/oder bedingte Expression von Genen Interesse10,11, was vorteilhaft in einer räumlichen und zeitlichen Weise während der Genfunktion sezieren ist Entwicklung. Im Gegensatz zu GOF Analyse wurde LOF Analyse schwieriger. Während die Transiente Transfektion von SiRNAs und ShRNA-tragenden Plasmide durchgeführt wurde, sind Langzeitwirkungen von LOF Gene nicht wegen eventuellen Abbau von exogen eingeführten Nukleinsäuren wie Plasmide und DsRNAs garantiert. Die CRISPR/Cas-Technologie bietet jedoch einen Durchbruch im LOF Analysen. Genen Codierung fluoreszierende Proteine (z. B.GFP) oder biolumineszenter Proteine (z.B.Firefly Luciferase) haben gemeinsam mit CRISPR-Cas9 und SgRNAs der Zellen, CRISPR-Cas9-vermittelte somatische Mutationen zu kennzeichnen transfiziert wurden. Trotzdem, dieser Ansatz hätte Einschränkungen in funktionelle Studien auf Proliferierende Zellen da exogene Markergene verdünnt und nach langfristigen Verbreitung abgebaut. Während die transfizierten Zellen und ihre Tochterzellen CRISPR-induzierte Mutationen in ihrem Genom unterziehen, können ihre Spuren im Laufe der Zeit verloren gehen. Genetische Kennzeichnung Ansätze wäre daher geeignet, um dieses Problem zu umgehen.
Vor kurzem haben wir eine LOF CRISPR-basierte Methode in zerebelläre Granulat-Zellen, die eine langfristige Verbreitung während ihrer Differenzierung12durchlaufen entwickelt. Um den transfizierten Zellen genetisch zu beschriften, wir ein Plasmid trägt eine SgRNA zusammen mit Cre gebaut und Cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Mäuse13 in Utero Elektroporation mit das Plasmid eingeführt. Im Gegensatz zu normalen Plasmid-Vektoren Codierung EGFP, dieser Ansatz erfolgreich mit der Bezeichnung transfizierten Granulat Neuron Vorstufen (festzulegenden) und ihre Tochterzellen. Diese Methode bietet großen Unterstützung in Vivo -Funktion von Genen des Interesses an proliferierenden Zellen im normalen Gehirnentwicklung und einem Tumor neigende Hintergrund zu verstehen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach Tierschutzbestimmungen durchgeführt und von den zuständigen Behörden genehmigt wurden (Regierungspräsidium Karlsruhe, Zulassungsnummern: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 und G133/14).
1. erzeugen Sie pU6-SgRNA-Cbh-Cre Plasmide
- Entwerfen Sie die SgRNA auf ein Gen von Interesse nach der zuvor veröffentlichten Protokoll Nr.14.
Hinweis: In diesem Experiment sind zwei SgRNAs entwickelt, um die Maus Top2b gen und eine ungezielte Kontrolle SgRNA (Tabelle 1) Ziel. SgRNAs müssen ko ursächlich mit der CRISPR-Technologie entwickelt werden, um entweder die kodierende Sequenz der 5'-Region oder die wesentlichen funktionalen Domäne des Proteins Ziel. Ein idealer Ausgangspunkt ist öffentlich verfügbaren vorgefertigten SgRNA Sequenzen, wie der GeCKO v2 Maus ko-Pool Bibliothek15 aus dem Zhang-Labor testen. Alternativ können SgRNAs entworfen werden, mit öffentlich verfügbaren Software wie z. B. die folgenden-Website: crispr.mit.edu. - Klonen Sie die SgRNAs in den pU6-SgRNA-Cbh-Cre-Vektor.
Hinweis: PU6-SgRNA-Cbh-Cre Vektor12 in dieser Studie verwendet wird aus dem ursprünglichen pX330 Plasmid16 abgeleitet, indem die kodierende Sequenz des SpCas9 mit der Cre -Rekombinase.- Zwei DNA-Oligos wie folgt zu synthetisieren. Sinn: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Hinweis: 20 N der oben stehen für die SgRNA-Sequenz gezeigt. - Verdauen Sie pU6-SgRNA-Cbh-Cre mit BbsI für 30 min bei 37 ° C unter Verwendung der folgenden Reagenzien zu, laden Sie die verdaute Probe zu einem 1 % Agarosegel, und reinigen sie mit einem Gel-Extraktion-Kit. Verwenden Sie 3 µg Plasmid; 3 µL Bbsich; 1 µL FastAP; 5 µL 10 x Verdauung Puffer; Fügen Sie DdH2O um das Gesamtvolumen zu 50 µL zu bringen.
- Phosphorylieren und Tempern jedes Paar von SgRNA Oligos unter Verwendung der folgenden Reagenzien (10 µL Gesamtvolumen): 1 µL Customized Sinn Oligo (100 mM); 1 µL angepasst antisense Oligo (100 mM); 1 µL 10 x T4 Ligation Puffer; 6.5 µL DdH2O; 0,5 ΜL T4 PNK. In einem Thermo-Cycler für 30 min bei 37 ° C inkubieren und 5 min bei 95 ° C, und dann die Rampe bis zu 25 ° C bei 5 ° C/min.
- Richten Sie die folgende Ligation Reaktion und inkubieren Sie für 10 min bei Raumtemperatur (10 µL Gesamtvolumen): X µL Bbsich verdaut Plasmid (50 ng); 1 µL phosphoryliert und geglüht, Oligo Duplex (Verdünnung 1: 200); 5 µL 2 x Ligatur Puffer; X µl DdH2O; 1 µL schnelle Ligase.
- Fügen Sie 2 µL des Messguts Ligatur in 50 µL chemisch kompetenten DH5α Escherichia coli Zellen. Nach 30 min Inkubation auf Eis, Hitze Schock die Probe für 90 s bei 42 ° C und inkubieren Sie für 2 min auf Eis. 100 µL LB-Medium hinzufügen und auf eine LB-Platte mit 100 µg/mL Ampicillin Platte.
Hinweis: Die Integration der SgRNA-Sequenz in der pU6-SgRNA-Cbh-Cre-Plasmid erfolgt nach den Klonen Schritte für die pX330-Plasmid-14. - Impfen Sie zwei Kolonien, jeweils in 2 mL LB-Medium bei 37 ° C für mindestens 6 h zu und führen Sie eine Mini-Vorbereitung DNA-Isolierung mit einem Kit.
- Sanger Sequenz der Mini-Vorbereitung-DNA mit Hilfe des hU6-Forward Primers und Kolonien mit der korrekten Einfügung von SgRNAs durch Angleichung an die Reihenfolge in Schritt 1.2.1 identifizieren. Primer Sequenz ist in Tabelle 1dargestellt. In dieser Studie verwendeten Plasmide hießen pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre und pU6-SgControl-Cbh-Cre.
- Impfen Sie die Kolonien korrekt identifiziert und reinigen Sie die Endotoxin-freie Plasmid DNA für in Utero Elektroporation mit einem Kit, z. B.von Qiagen. Eluieren Sie die DNA mit Endotoxin-freie TE-Puffer verdünnt in DdH2O 01:10 (10 %-TE-Puffer). Die DNA-Konzentration des Plasmids muss höher als 2 mg/mL.
Hinweis: Verwenden Sie eine regelmäßige Maxi-Prep Kit nicht für DNA-Vorbereitung. Lagern Sie Plasmid-Lösungen bei 4 ° C für kurzfristigen Gebrauch (bis zu 4 Wochen) oder Aliquote einem entsprechenden Volumen von etwa 25 µL und bei-20 ° C für die langfristige Lagerung.
- Zwei DNA-Oligos wie folgt zu synthetisieren. Sinn: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. Prüfung der Effizienz der SgRNAs mit dem EGxxFP-Plasmid-System
Hinweis: Die Effizienz der SgRNAs wird normalerweise von Surveyor oder T7E1 getestet (T7-Endonuklease ich) Assays. In diesem Protokoll wird eine einfache und effiziente Alternative verwendet. Der Schlüssel dieses Ansatzes ist die pCAG-EGxxFP-Plasmid zu verwenden, das überlappende EGFP Fragmente getrennt durch eine DNA-Sequenz mit der SgRNA Ausrichtung auf Seite17enthält. Auf den Ausdruck der pCAG-EGxxFP zusammen mit den SgRNA und Cas9 in den transfizierten Zellen ist die Cas9-vermittelten Doppelstrang-Pause (DSB) in der Zielsequenz durch endogene Homologie-abhängige Mechanismen, repariert die wiederherstellt EGFP Ausdruck Kassette.
- Design-Primer an die genomische Region zentriert mit den SgRNA Sequenzen gezielt zu verstärken. Der PCR-Amplifikate beträgt ca. 500 bp. In diesem Experiment wurde eine DNA-Versammlung angewandt, um ein Fragment PCR verstärkt in die pCAG-EGxxFP-Plasmid zu klonen.
Hinweis: Alternativ können entsprechende Restriktionsschnittstellen der PCR-Primer 5'-Ende hinzugefügt werden. Verfügbaren Restriktionsschnittstellen im pCAG-EGxxFP Vektor BamHI NheI, PstI, SalI, EcoRI und sind EcoRV. - Verstärken Sie die genomische DNA mit gestalteten Primer unter Verwendung der Form und PCR die folgenden Parameter. Laden die Probe (19.7 µL H2O; 0,3 µL 10 ng/µL Maus genomischer DNA; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µL 2 X PCR-master-Mix; 50 µL Gesamtvolumen) auf einem 1 % Agarose gel und der PCR-Fragmente mit einem Gel-Extraktion Kit Gel zu reinigen. Verwenden Sie die folgende Reaktion Bedingungen: 95 ° C für 3 min; dann 35 X Zyklen von 98 ° C für 20 s, 60 ° C für 15 s, 72 ° C für 20 s und 72 ° C für 1 min; 4 ° C, auf unbestimmte Zeit.
Hinweis: In diesem Experiment wurde eine Region in Top2b Exon 1 verstärkt; die Primer-Sequenzen in Tabelle 1zu finden. - Digest der pCAG-EGxxFP-Vektor mit Restriktionsenzymen BamHI und EcoRI für 2 h bei 37 ° C, dann laden Sie die Probe auf eine 1 % Agarose gel und der Vektor-Backbone mit einem Gel-Extraktion Kit Gel zu reinigen. Verwenden Sie die folgenden Reagenzien (50 µL Gesamtvolumen): X µL Plasmid (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL EcoRI; 5 µL 10 x Buffer; X µl DdH2O.
- Richten Sie die DNA Montage Reaktion18 gemäß den Anweisungen des Herstellers, und verwandeln Sie sich in DH5α kompetente E. Coli.
- Zwei Kolonien zu impfen, jeweils in 2 mL LB-Medium bei 37 ° C für mindestens 6 h, führen Sie eine Mini-Vorbereitung DNA-Isolierung mit einem Kit, z. B.von Qiagen, und Kolonien zu identifizieren, mit dem richtigen einsetzen (nachfolgend pCAG-EG-Top2b-FP) mit Sanger Sequenzierung mit dem EGxxFP-Top2b-F-Primer.
- HEK293T Zellen zu transfizieren.
- Der HEK293T Samenzellen in einer 24-Well-Platte 24 h vor Transfektion.
Hinweis: Zellen wurden kultiviert in einem 37 ° C Zelle Inkubator mit 5 % CO2, in DMEM mit Glutamin Ergänzung mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin. Stellen Sie sicher, dass die Zellen 60 % Zusammenfluss am Tag der Transfektion. In diesem Experiment verwendet wir selbstgemachte HEK293T Zellen stabil mit dem Ausdruck SpCas9 pU6-SgRNA-Cbh-Cre zu testen. Wildtyp HEK293T Zellen können jedoch verwendet werden, wenn ein SpCas9 Expressionsvektor zur Verfügung gestellt wird. - Transfizieren Sie die HEK293T Zellen unter Verwendung der Polyethylenimine (PEI) Reagenz. Transfizieren Sie, die Zellen mit 120 ng/Well pCAG-EG-Top2b-FP-Plasmid12 und 120 ng/Well pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre oder pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre in einer 24-Well-Platte. Mischen Sie das Plasmid DNA und 1,8 µL PEI Reagenz in 80 µL unsupplemented DMEM Medium mit Glutamin ergänzen und 15 min bei Raumtemperatur inkubieren, nach dem aufschütteln.
- 6 h nach der Transfektion Medium zu entfernen und ersetzen Sie durch frisches Medium.
- Überwachen Sie das Vorhandensein von lebenden Zellen GFP+ 48 h nach Transfektion mit einem Fluoreszenzmikroskop mit 20 X Vergrößerung.
Hinweis: Die Anzahl der GFP+ Zellen zeigt die targeting Effizienz der SgRNA. Ergebnisse der wirksame und unwirksame SgRNAs (sgTop2b-1 und sgTop2b-2, beziehungsweise) sind in Abbildung 2Adargestellt.
- Der HEK293T Samenzellen in einer 24-Well-Platte 24 h vor Transfektion.
3. führen Sie im Mutterleib Elektroporation
- 6 bis 8 Wochen alten Mäusen zu züchten und die Werkzeuge in Utero Elektroporation vorzubereiten. Überqueren Sie männliche homozygot Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Mäuse mit weiblichen Mäusen CD-1. Zeit die Schwangerschaft von den Mäusen CD-1 ab dem Tag, den der vaginal Plug ist (E0.5) erkannt. Embryonen sind elektroporiert am Tag E13.5.
- Borosilikatglas Kapillaren ziehen (Innendurchmesser: 0,6-0,8 mm) mit einer Mikropipette Abzieher. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: P = 500, Wärme = 560, Pull = 150, Vel = 75, Zeit = 250. Beschriften Sie die Kapillare Spitze mit schwarzer Tinte zur besseren Visualisierung während der Injektion. Schneiden Sie die Kapillare Verjüngung unter einem Stereomikroskop mit einem Lineal und scharfe Nadel Pinzette und schneiden Sie die Spitze mit einer Länge von ca. 6 mm.
- Pflegen Sie die Einheit der Kapillaren, das Experiment reproduzierbar zu halten. Erstellen Sie eine einseitige abgeschrägte Kante während dem trimmen. Die Spitze sollte so scharf wie möglich für leichtes Eindringen von der Gebärmutterwand und Gewebeschäden des Embryos zu vermeiden.
Hinweis: Alternativ können Sie ein Mikro-Schleifer eine 35° Winkel19anpassen. Die Kapillaren können bei Raumtemperatur in einer 10 cm Petrischale Pathogen-freies Bedingungen gespeichert werden. - Autoklaven der chirurgischen Instrumente.
- SgRNA-Plasmide zu gleichen Teilen mit pT2K-IRES-Luc, eine Endkonzentration von mindestens 1 µg/µL pro Plasmid und Farbe die Plasmid-Lösung mit schnell grün (Endkonzentration von 0,05 %) mischen. Bereiten Sie 1 % schnell grün-Stammlösung mit Endotoxin-freie destilliertes Wasser und Filter durch einen 0,22 µm-Filter, Farbstoff Teilchen aus der Lösung zu entfernen.
Hinweis: Co-Transfektion von pT2K IRES-Luc ist optional, aber ermöglicht die Identifizierung von lebensfähigen elektroporiert Tiere nach der Geburt mit Biolumineszenz Bildgebung. Bitte siehe Punkt 3.5. Bereiten Sie eine ausreichende Menge an Plasmid-Mix für die Gesamtzahl der schwangeren Mäusen betrieben werden. Verwenden Sie etwa 15-20 µL mischen per Mausklick (~ 12 Embryonen). Gehen Sie sofort mit der Operation.
- Mäuse für die Operation vorbereiten.
- Schwanger-CD 1-Mäuse mit Isofluran zu betäuben. Anästhesie in einer Box mit 3-4 Vol-% Isofluran induzieren (Sauerstoff-Durchfluss: 1,5 L/min) und pflegen sie mit 2 Vol% während der Operation über bugnase.
Hinweis: Die komplette Operation sollte nicht länger als 30 min. reduzieren die Anzahl der injiziert und elektroporiert Embryonen, wenn nötig. Verwenden Sie sterile Handschuhe für Chirurgie. - Platzieren Sie den Mauszeiger auf dem Rücken auf ein Heizkissen und passen Sie Anästhesie an.
- Injizieren Sie Schmerzmittel (Metamizol, 800 mg/kg Körpergewicht, subkutan (s.c.), 24 h-Depot).
Hinweis: Sie können andere autorisierte Analgetika als Metamizol verwenden. - Gelten Sie Augensalbe um Augentrockenheit während der Operation zu verhindern.
- Glieder mit Klebeband befestigen und den Bauch mit einem Desinfektionsmittel desinfizieren. Decken Sie die Maus mit Gaze, so dass nur der OP-Bereich ausgesetzt. OP-Bereich und Gaze 70 % igem Ethanol verteilt.
- Machen Sie einen Hautschnitt von ca. 2 cm in der Länge und die Kluft sanft mit gerade chirurgische Scheren. Suchen Sie die Linea Alba und machen ein etwas kleinerer zweiten Schnitt durch das Bauchfell mit Gewebe mit stumpfen Spitze Schere.
- Befeuchten Sie die geöffnete Bauchhöhle mit vorgewärmten sterilen 1 x PBS.
- Extrahieren Sie sorgfältig die uterine Hörner aus der Bauchhöhle mit Ring Pinzette. Ziehen Sie vorsichtig durch die Gebärmutterwand ausschließlich auf die Lücke zwischen der Eigelb-Säcke von zwei benachbarten Embryonen greifen. Vermeiden Sie Druck auf den Embryo und ziehen Sie es durch den Schnitt. Vergrößern des Schnittes, wenn nötig, und seien Sie besonders vorsichtig, die uterine Hörner auf den Bauch zu positionieren, während der Blutfluss durch die uterine Arterie nicht komprimieren.
Hinweis: In einigen Fällen ist es ratsam, eine uterine Horn zu einem Zeitpunkt zu extrahieren und ersetzen Sie es bevor Sie mit dem zweiten uterine Horn.
- Schwanger-CD 1-Mäuse mit Isofluran zu betäuben. Anästhesie in einer Box mit 3-4 Vol-% Isofluran induzieren (Sauerstoff-Durchfluss: 1,5 L/min) und pflegen sie mit 2 Vol% während der Operation über bugnase.
- Injektion und Elektroporation von Plasmid DNA
- Aspirieren Sie ca. 15 µL farbigen Plasmid-Lösung mit dem vorbereiteten Glas Kapillare. Während dieses Prozesses vermeiden Sie Luftblasen.
Hinweis: Die Plasmid-Lösung kann die Spitze leicht verstopfen wenn seine Konzentration hoch ist. Testen Sie die Kapillare durch die Freigabe einiger DNA direkt vor der Injektion. - Sanft halten Sie den Embryo mit Ring Zange und suchen Sie den Halsbereich.
Hinweis: Wenn der Embryo in der Lage, die schwer ist zu injizieren, überspringen Sie es und gehen Sie für die nächste Embryo. Erhöhte Neupositionierung des Embryos kann Chancen auf Schaden zu erhöhen. - Langsam injizieren Pierce mit der Spitze der Kapillare in den vierten Ventrikel dringt durch die dorsalen Hinterhirn und anschließend vorbereitete Glas ca. 1 µL Plasmid-Mix. Bestätigen Sie, dass die gefärbte DNA nicht vom Gehirn zugespielt ist und als einer rautenförmigen Struktur sichtbar ist.
Hinweis: Als Option, 2,5-fache Lupen für bessere Visualisierung des vierten Ventrikels und umliegenden Blutgefäße. Liefern Sie elektrische Impulse sofort nach der Injektion, Diffusion der Plasmid-Lösung auf den anderen Ventrikeln zu verhindern. - Elektrische Impulse quadratische gelten (5 Impulse, 32 mV, 50 ms-auf 950 ms-off) mit Zange-wie Platin Pinzette (siehe Tabelle der Materialien). Platzieren Sie die Elektroden seitlich mit dem Minuspol für das Ohr und der Positive Pol an der zerebelläre Primordium über die Gebärmutterwand positioniert. Verwenden Sie 5 mm Durchmesser Elektrodenplatten für effektive Electroporation E13.5 Embryonen.
Hinweis: Erhöht die Überlebensrate der Jungtiere durch die Manipulation von weniger als 2/3rd an der Gesamtzahl der Embryonen pro Damm. Vermeiden Sie Embryonen zu nah an den Muttermund. Wenn manipuliert, sie verursachen Komplikationen während der wehen und gefährden die gesamte Streu. Wenn Elektroden auch sind eine Herzensangelegenheit des Embryos, dadurch kann Herzstillstand.
- Aspirieren Sie ca. 15 µL farbigen Plasmid-Lösung mit dem vorbereiteten Glas Kapillare. Während dieses Prozesses vermeiden Sie Luftblasen.
- Post-Elektroporation und postoperative Pflege
- Legen Sie vorsichtig uterine Hörner zurück in die Bauchhöhle und füllen sich mit vorgewärmt sterilen 1 x PBS. Lassen Sie den uterinen Hörner Schlitten in einer natürlichen Position.
- Schließen Sie das Peritoneum und die Haut separat mit einer einfachen kontinuierliche Naht.
Hinweis: Seien Sie besonders vorsichtig, nicht zu der Gebärmutterwand durchdringen, wenn das Peritoneum zu nähen. - Abschaltung der Narkose und legen Sie das Tier Bauch nach unten in einen neuen Käfig.
- Überwachen Sie das Tier während der Wachen und wieder 24 h nach der Operation. Legen Sie den Käfig unter einer Wärmelampe, wenn innerhalb von 15 min Zeitrahmen nicht das Zittern verbessert und das Tier wird nicht gestartet, Pflege.
- Erfolgreiche Elektroporation durch Luciferase-Bildgebung zu bestätigen.
- Stellen Sie sicher, dass die betriebenen Dämme Embryonen auf Zeit (bei E19.5 fallen).
Hinweis: Das Geburtsdatum kann auf den nächsten Tag wahrscheinlich wegen der Operation verzögert werden. - Betäuben Sie die elektroporiert Welpen (P5-P7) mit 2,5 % Isofluran zu und Spritzen Sie (intraperitoneal (i.p.)) mit D-Luciferin (3 mg/kg Körpergewicht) 5 min vor der Bildgebung.
- Erkennen Sie in die elektroporiert Welpen mit der Biolumineszenz-Imager Luciferase Signale.
Hinweis: Eine Belichtungszeit von 1 min ist ausreichend um das Luciferase-Signal zu erkennen. Radiance (p/s/cm2/sr) ist ca. > 1 x 106.
- Stellen Sie sicher, dass die betriebenen Dämme Embryonen auf Zeit (bei E19.5 fallen).
4. bereiten Sie Cryosections aus der Elektroporiert Cerebella
- Einzuschläfern Sie die elektroporiert P7 Welpen und sezieren Sie, das Kleinhirn.
Hinweis: Das GFP-Signal kann mit einem Epifluorescent Stereoskop beobachtet werden. - Korrigieren Sie die Cerebella über Nacht in 5 mL pro Gehirn von 4 % PFA mit PBS-Puffer bei 4 ° C.
- Übertragen der festen Cerebella Übernachtung in 10 mL pro Gehirn von 30 % Saccharose mit PBS-Puffer bei 4 ° C.
Hinweis: Das Gewebe sollte das untere Ende eine 15-mL-Tube nach der Inkubation in der Saccharoselösung erreichen. - Nach dem Einweichen die restlichen Saccharose-Lösung mit einem Stück Filterpapier Zellulose, Tauchen Sie das Kleinhirn in eine optimale Arbeitstemperatur (OCT) Verbindung in eine Einweg-Kunststoff-Formenbau und auf trockenem Eis einfrieren. Die kryogene Block kann bei-80 ° C bis zum Gebrauch gespeichert werden.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden. - Schneiden Sie den kryogenen Block in Abschnitte mit 10 µm Dicke mit einem Kryostaten und halten Sie in den Abschnitten bei-80 ° C bis zur Verwendung.
Hinweis: Man kann GFP Ausdruck in den Abschnitten nach dem Waschen, das Office-Anpassungstool Verbindung mit PBS bestätigen.
5. Immunostaining von der Cryosections
- Trocknen Sie die Folien bei Raumtemperatur für 30 min und waschen zweimal für 10 min in PBS.
- Kreisen Sie die Abschnitte mit einem flüssigen Blocker Stift und inkubieren Sie die Abschnitte in einer blockierenden Lösung (10 % normale Esel Serum mit PBS-Puffer mit 0,1 % Triton-X100) für 1 h bei Raumtemperatur.
- Primäre Antikörper gegen die Moleküle des Interesses (z. B.GFP und Topoisomerase II Beta (Top2B) in dieser Studie) an die blockierende Lösung hinzufügen und über Nacht bei 4 ° c inkubieren
Hinweis: Die Namen und die Konzentrationen von Antikörpern verwendet werden in der Tabelle der Materialienaufgeführt. Um GFP Signale zu verstärken, kann optional Antikörpers Anti-GLP zusammen mit den anderen Antikörper verwendet werden. - Waschen Sie den Folien mit 0,1 % Triton-haltigen PBST 3 X 10 min Inkubation die Abschnitte für 1 h bei Raumtemperatur mit einem Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörper verdünnt in den blockierenden Lösung mit DAPI.
- Waschen Sie den Folien in PBS 3 X 10 min. Mount Folien und bei 4 ° C bis Bildgebung.
Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.
6. Bildgebung und Analyse
- Bild in den Abschnitten mit einem konfokalen Mikroskop mit 20 X Vergrößerung.
- Die Anzahl der GFP positive Zellen verlieren den Ausdruck des Zielproteins. Ein repräsentatives Bild ist in Abbildung 2 bdargestellt.
- Überprüfen des molekularen Phänotyps bei der Ablation von Zielgene in festzulegenden und ihre Nachkommen von Immuostaining12.
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Representative Results
Für in Vivo Funktionsanalyse ist es entscheidend, die Zellen zu identifizieren, in denen exogene-Gens eingeführt wurden. Während der Ausdruck eines Markers wie GFP in nicht wuchernden Zellen für einen langen Zeitraum hinweg, weiterverfolgt kann sein das Signal nacheinander in proliferierenden Zellen verirrt. Ein Beispiel für diesen Effekt ist in Abbildung 1gezeigt. Zur Umgehung den Fußabdruck von transfizierten Zellen in LOF Analysen zu verlieren, haben wir einen neuartigen Ansatz durch die Kombination von Elektroporation-basierte gen Lieferung mit der CRISPR/Cas9-Technologie entwickelt.
Repräsentative Ergebnisse sind in Abbildung 2dargestellt. Funktionalität der Plasmid-Konstrukte durch Transiente Transfektion von pU6-sgTop2b-Cbh-Cre getestet und pCAG-EG-Top2b-FP17, tragen die sgTop2b Zielsequenz in HEK293T Zellen stabil mit dem Ausdruck SpCas9 (Abbildung 2A). Die SgRNA geführte Cas9 Endonuklease Aktivität induziert DSB-vermittelten Homologie gerichtete Reparatur von EGFP-Expressionskassette. Daher wurde die Funktion der SgRNA direkt durch den Nachweis von GFP Ausdruck analysiert. Nach Mashiko Et Al.bestimmt ein Transfektion Wirkungsgrad von mehr als 30 % einer SgRNA als effektive17.
Festzulegenden stammen aus der rhombischen Lippe (RL), einer Region an der Grenze des Dachs des vierten Ventrikels embryonalen Stadium E12.5 bis E16.5. Diese Zellen sind dafür bekannt, massive Verbreitung nach der Geburt in den äußeren externe Granulat Schicht (oEGL) und Verlagerung auf die innere EGL (iEGL) nach dem Verlassen der Zelle Zyklus20zu unterziehen. Festzulegenden sind daher ein geeignetes Beispiel testen Sie die Vorteile unseres genetischen Kennzeichnung Ansatzes.
Anhand dieses Protokolls kann in Utero Elektroporation von festzulegenden Rückverfolgung von bearbeiteten Zellen mit GFP. Wir haben das pU6-SgRNA-Cbh-Cre-Plasmid mit dem Ausdruck SgControl in die zerebelläre Primordium Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Mäuse im embryonalen Stadium E13.5 eingeführt. Mäuse wurden geopfert, um postnatale Tag P7 und sagittale Abschnitte der zerebelläre Gewebeschnitte waren voller Flecken von Immunohistochemistry. Äußeren und inneren EGL wurden durch Ki67 Ausdruck (oEGL) und p27 Ausdruck (iEGL), bzw. definiert. Trotz Vermehrung und Reifung unterzogen, behielten Reife zerebelläre Granulat Neuronen (CGNs) noch starken GFP Ausdruck (Abb. 2 b).
Betonend, dass das Dienstprogramm dieses Protokolls, nutzten wir außerdem die SgRNA Ausrichtung auf DNA-Top2b als ein repräsentatives Beispiel. Experimentelle Verfahren wurden durchgeführt, wie oben (siehe Abb. 2 b) beschrieben. Die meisten der GFP-positiven Zellen mit SgRNAs für Top2b transfiziert ausgestellt einen Verlust der Top2b Ausdruck in der internen Granulat-Schicht (IGL), während die Einführung der Kontrolle, die SgRNAs nicht zu deutliche Reduzierung des Ausdrucks (Abbildung 2) geführt hat. Eine Quantifizierung dieses Ergebnis ist in Abb. 2Ddargestellt. Diese Daten stellen ein wertvolles Werkzeug für die Verfolgung von bearbeiteten Zellen für längere Zeit während der Entwicklung oder Tumor Anordnung.
Abbildung 1: Schematische Darstellung der GFP Ausdruck in wuchernden und nicht wuchernden Zellen. (A) Wenn eine exogene gen, die Codierung GFP (z.B. pCAG-EGFP) in nicht wuchernden Zellen, die Zellen transfiziert ist GLP für eine lange Zeit (Obere Gasse) zum Ausdruck bringen kann. Unterdessen könnte GFP Ausdruck in proliferierenden Zellen durch Verdünnung der exogenen GFP (mittlere Spur) verschwinden. Im Gegensatz dazu können die Zellen, die das Transgen LoxP-Stop-LoxP-GLP (LSL-GFP) tragen die GFP Expression während Verbreitung nach Transfektion mit Cre-Rekombinase (untere Lane) halten. (B) das Prinzip der SpCas9-vermittelte gen-silencing und GFP Expression nach Transfektion von Cre und SgRNA in eine Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Maus Belastung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der Ergebnisse aus diesem Protokoll. (A) HEK293T Zellen stabil mit dem Ausdruck SpCas9 wurden mit pU6-sgTop2b-Cbh-Cre und pCAG-EG-Top2b-FP Plasmide transfiziert. GFP Ausdruck in lebenden Zellen wurde mit einem fluoreszierenden Zelle Imager überwacht (siehe Tabelle der Materialien) 48 h nach Transfektion. Linken und Rechte Tafeln zeigen eine wirksame und unwirksame SgRNA Sequenz basierend auf GFP Ausdruck, beziehungsweise. Skalieren Sie Bars: 100 µm. (B) Immunostaining GFP, Ki67 und p27 auf P7 Cerebella aus einer Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Maus ausgesetzt Electroporation in E13.5 mit pU6-SgRNA-Cbh-Cre Plasmid-Konstrukten, die Kontrolle SgRNA zum Ausdruck zu bringen. Der Abschnitt ist mit DAPI (blau) counterstained. Skalieren Sie Bars: 50 µm; 20 X Vergrößerung. Beachten Sie die GFP exprimierenden Zellen in der oEGL von Ki67 geprägt. (C) Immunostaining der GFP (grün) und Top2b (Magenta) auf die P7 Cerebella aus eine Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP Maus, die elektroporiert am E13.5 mit pU6-SgRNA-Cbh-Cre Plasmid wurde erstellt mit dem Ausdruck ihrer SgRNA gegen Top2b (sgTop2b) und eine Steuersequenz (SgControl). Pfeile zeigen Top2b Ausdruck in GFP+ Zellen in dem selben Gebiet. Skalieren von Balken: 20 µm; 20 X Vergrößerung. (D) Quantifizierung von Top2b in elektroporiert (GFP-positiven) Zellen in SgControl und sgTop2b Experimente. Zwei und drei Welpen wurden für SgControl und sgTop2b, bzw. untersucht, und 25 Zellen aus jedem Gehirn analysiert wurden. Fehlerbalken darzustellen ± Standardfehler der mittleren (SEM) und p-Werte wurden berechnet, indem ungepaarten t-test, *p = 0,0002. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Name | Sequenz | Anwendung | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | SgRNA Ziel-Sequenz | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | SgRNA Ziel-Sequenz | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | SgRNA Ziel-Sequenz | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Klonen in pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Klonen in pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Sequenzierung für sgRNA | |
Tabelle 1: Sequenzen von Oligos in dieser Studie verwendet wird.
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Discussion
Mit Exo Utero Elektroporation, haben wir bereits berichtet, dass SiRNA basierenden in Vivo Funktionsanalysen des Atoh1 in einem frühen Stadium der zerebelläre Granulat Zell-Differenzierung8. Durch SiRNA Verdünnung/Abbau und Exposition von Embryonen außerhalb der Gebärmutterwand beschränkte sich die phänotypische Analyse der elektroporiert Granulat Zellen auf embryonalen Phase. Jedoch aktiviert die aktuelle Methode Analyse des Phänotyps der postnatalen Tiere.
Unsere früheren Studie zeigte, dass Cas9-vermittelten ko von Tumorsuppressor Ptch1 über in Utero Elektroporation erfolgreich induziert Medulloblastom2. Im Vergleich dazu der aktuelle Ansatz weist zwei wesentliche Vorteile: 1) Cas9 muss nicht unbedingt mit dem Plasmid lieferbar so dass für mehrere Gene targeting mit mehreren SgRNA Expressionskassetten in einem einzigen Plasmid statt; und 2) den Zielzellen und ihre Stammarten sind dauerhaft beschriftet mit GFP, ermöglicht die Visualisierung von lebenden Zellen und Analyse des Verhaltens der Umwandlung von Tumor-Zellen in Vivo.
Die wichtigsten Schritte dieses Protokolls sind die korrekte Injektion von Plasmid DNA in die richtige Position und die Lieferung der elektrischen Impulse in den entsprechenden Stellen im Gehirn. Zerebelläre Neuronen werden vom Kleinhirn Neuroepithelium nacheinander in ein Geburtsdatum-abhängigen Weise geboren. Nicht alle Arten von Zellen im Kleinhirn Primordium können über Elektroporation, gezielt werden, da nur bestimmte Zeitfenster bei E12.5-14.5 technisch machbar ist. Tief zerebelläre Kerne Neuronen und Purkinje-Zellen sind dafür bekannt, bei E10.5-11,5, entstehen, wenn die extraembryonalen Membranen nicht transparent sind, und der Embryo nicht sichtbar für die DNA-Injektion ist. Später, unipolare Bürste Zellen stammen aus E17.5 oberen RL (uRL), wenn der vierte Ventrikel ist zu schmal, um eine ausreichende Menge an DNA in der Nähe der uRL zu injizieren. Unsere Methode ist also nur anwendbar bei E12.5-14,5, die Mitte und später-geborene Vorfahren wie festzulegenden und hemmende Interneurone hauptsächlich abzielt. Ein weiterer Nachteil der Methode ist, dass ein vollständige ko-Phänotyp möglicherweise nicht durchführbar, wenn im Vergleich zu Cre/LoxP-vermittelten Keimbahn GEMMs, da nur Tausende von zerebelläre Zellen durch Elektroporation in jedem Embryo ausgerichtet werden können.
In einer früheren Studie Zellen ca. 80 % der GFP-positiven zerebelläre Granulat verloren Ausdruck der gezielte gen12. Während die Identität der Granulat-Zellen von molekularen Markern und ihre Verteilung bestätigt wurde, könnte dieser Identifikation Ansatz nicht immer anwendbar, wie Gene von Interesse für die Marker Ausdruck und neuronalen Migration beteiligt sein könnten. Bedingte Aktivierung des Cre zellspezifische Förderer mit würde in diesem Fall das Problem lösen. Daher kann die aktuelle allgegenwärtigen Cbh-Promotor in pU6-SgRNA-Cbh-Cre-Plasmid mit einem Promotor zellspezifische ersetzt werden.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir schätzen Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim und Petra Schroeter für technische Hilfe. Wir danken auch DRS. K. Reifenberg, K. Dell und P. Prückl für hilfreiche Unterstützung für Tierversuche am DKFZ; die Imaging Core Facilities des DKFZ und Carl Zeiss Imaging Center im DKFZ für die Bildgebung der konfokalen Mikroskopie. Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (DK) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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