Summary
Conventionele studies van de verlies-van-functie van genen met behulp van knock-out dieren zijn vaak kostbare en tijdrovende geweest. Electroporation gebaseerde CRISPR-gemedieerde somatische mutagenese is een krachtig hulpmiddel om te begrijpen gen functioneert in vivo. Wij rapporteren hier een methode voor het analyseren van de knock-out fenotypen in delende cellen van het cerebellum.
Abstract
Misvorming van de hersenen wordt vaak veroorzaakt door genetische mutaties. Ontcijferen van de mutaties in de patiënt-afgeleide weefsels geconstateerd mogelijke oorzakelijke factoren van de ziekten. Voor het valideren van de bijdrage van een dysfunctie van de gemuteerde genen voor de ontwikkeling van de ziekte, is de generatie van diermodellen uitvoering de mutaties een voor de hand liggende aanpak. Terwijl germline genetisch gemanipuleerde Muismodellen (GEMMs) zijn populaire biologische tools en reproduceerbare resultaten vertonen, wordt beperkt door tijd en kosten. Ondertussen, niet-germline GEMMs inschakelen vaak verkennen genfunctie in een meer haalbare wijze. Sinds sommige hersenen ziekten (b.v., hersentumoren) lijken te leiden tot van somatische maar niet germline mutaties, niet-germline chimeer muismodellen, waarin naast de normale en abnormale cellen, nuttig voor ziekte-relevante analyse zou kunnen zijn. In deze studie rapporteren we een methode voor de inductie van CRISPR-gemedieerde somatische mutaties in het cerebellum. Specifiek, we gebruikt voorwaardelijke knock-in muizen, waarin Cas9 en GFP worden chronisch geactiveerd door de promotor van CAG (CMV versterker/kip ß-actine) na Cre-gemedieerde recombinatie van het genoom. De zelf ontworpen single-gids RNAs (sgRNAs) en de Cre recombinase volgorde, zowel gecodeerd in een enkele plasmide construct, werden geleverd in cerebellaire stam/voorlopercellen in een embryonaal stadium in utero electroporation gebruiken. Bijgevolg, transfected cellen en hun dochter cellen waren gemarkeerd met groen fluorescente proteïne (GFP), waardoor verdere fenotypische analyses. Vandaar, deze methode is niet alleen tonen gene electroporation gebaseerde levering in embryonale cerebellaire cellen maar ook voorstellen voor een nieuwe kwantitatieve benadering om te beoordelen van de CRISPR-gemedieerde verlies-van-functie fenotypen.
Introduction
Hersenziekten zijn een van de meest verschrikkelijke dodelijke ziekten. Ze gevolg vaak van genetische mutaties en latere disregulatie. Om te begrijpen van moleculaire mechanismen van hersenaandoeningen, hebben de ooit-blijvende inspanningen te ontcijferen van het genoom van menselijke patiënten een aantal mogelijke oorzakelijke genen ontdekt. Germline genetisch gemanipuleerde dierlijke modellen hebben tot nu toe gebruikt voor in vivo winst-van-functie (GOF) en verlies-van-functie (LOF) analyses van dergelijke kandidaat-genen. Als gevolg van de versnelde ontwikkeling van functionele validatieonderzoek, een meer haalbaar en flexibel in vivo gene assay systeem voor het bestuderen van genfuncties is wenselijk.
De toepassing van een in vivo electroporation gebaseerde gene transfersysteem aan de ontwikkelende hersenen van de muis is geschikt voor dit doel. In feite, hebben verscheidene studies met in utero electroporation hun potentieel functionele analyses in de ontwikkelende hersenen1,2,3uit te voeren aangetoond. Eigenlijk, zijn verscheidene gebieden van de hersenen van de muis, zoals de hersenschors4retina5, diencephalon6, hindbrain7, cerebellum8en ruggenmerg9 doelwit geweest door somatische gene levering benaderingen, tot nu toe.
Inderdaad, voorbijgaande genexpressie door in vivo electroporation op embryonale muis hersenen heeft lange tijd gebruikt voor GOF analyse. Recente genomic integratie transposon gebaseerde technologieën verder ingeschakeld op lange termijn en/of voorwaardelijke expressie van genen van belang10,11, die is het voordelig om te ontleden genfunctie in een ruimtelijke en temporele wijze tijdens ontwikkeling. In tegenstelling tot de GOF analyse, analyse van LOF geweest uitdagender. Terwijl voorbijgaande transfectie van siRNAs en shRNA-uitvoering plasmiden werd uitgevoerd, langetermijneffecten van LOF van genen niet worden gegarandeerd vanwege eventuele aantasting van de exogenously geïntroduceerde nucleic zuren, zoals plasmiden en dsRNAs. De CRISPR/Cas-technologie zorgt echter voor een doorbraak in LOF analyses. Genen coderend voor fluorescerende eiwitten (bijvoorbeeldGFP) of bioluminescente eiwitten (bijvoorbeeldfirefly luciferase) hebben samen met CRISPR-Cas9 en sgRNAs op het etiket van de cellen die blootgesteld aan CRISPR-Cas9-gemedieerde somatische mutaties zijn transfected. Deze aanpak zou toch beperkingen in functionele studies op delende cellen, aangezien exogene markers zijn verdund en gedegradeerd na lange termijn proliferatie. Terwijl de transfected cellen en hun dochter cellen ondergaan CRISPR-geïnduceerde mutaties in hun genoom, misschien hun voetafdrukken na verloop van tijd de weg kwijt. Dus zou genetische labeling benaderingen geschikt zijn voor dit probleem.
Recent ontwikkelde we een CRISPR gebaseerde LOF methode in cerebellaire submodule cellen die op lange termijn proliferatie tijdens hun differentiatie12ondergaan. Om genetisch label transfected cellen, we gebouwd een plasmide uitvoering van een sgRNA samen met Cre en het plasmide in de cerebella van Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP muizen13 gebruiken in utero electroporation geïntroduceerd. In tegenstelling tot regelmatige plasmide vectoren EGFP codering, deze aanpak met succes met het label transfected submodule neuron precursoren (BNP) en de cellen van hun dochter. Deze methode biedt veel steun bij het begrijpen van in vivo functie van genen van belang in de delende cellen in de ontwikkeling van de normale hersenen en een tumor-naar voren gebogen achtergrond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven verliepen dierenwelzijn reglementeringen en zijn goedgekeurd door de verantwoordelijke autoriteiten (Regierungspräsidium Karlsruhe, erkenningsnummers: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 en G133/14).
1. het genereren van pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmiden
- Het ontwerp van de sgRNA te richten op een gen-of-interest volgens de eerder gepubliceerde protocol14.
Opmerking: In dit experiment, twee sgRNAs zijn ontworpen om het richten van de muis Top2b gen en een niet-gerichte controle sgRNA (tabel 1). Knock-out gene(s) met behulp van de technologie van de CRISPR, moeten sgRNAs worden ontworpen om te richten van de codering opeenvolging van de 5'-regio of de essentiële domein met het domeinfunctionaliteitsniveau van het eiwit. Een handig vertrekpunt is het testen van openbaar vooraf ontworpen sgRNA sequenties, zoals de GeCKO v2 muis knockout zwembad bibliotheek15 van de Zhang lab. Anderzijds kunnen sgRNAs worden ontworpen met behulp van publiek beschikbare software zoals de volgende website: crispr.mit.edu. - Het klonen van de sgRNAs in de pU6-sgRNA-Cbh-Cre-vector.
Opmerking: De pU6-sgRNA-Cbh-Cre vector12 gebruikt in deze studie is afgeleid van de oorspronkelijke pX330 plasmide16 door vervanging van de codering volgorde van SpCas9 met de recombinase van de Cre .- Twee oligos van DNA als volgt samenvatten. Sense: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Opmerking: De 20 N de stand voor de sgRNA reeks hierboven. - PU6-sgRNA-Cbh-Cre met BbsI gedurende 30 minuten bij 37 ° C met behulp van de volgende reagentia te verteren, het verteerd monster, tot een 1% agarose gel te laden en zuiveren met behulp van een gel-extractie-kit. Gebruik 3 µg plasmide; 3 µL Bbsik; 1 µL FastAP; 5 µL 10 x spijsvertering buffer; ddH2O om het totale volume aan 50 µL toevoegen.
- Phosphorylate en ontharden van elk paar van oligos van de sgRNA met behulp van de volgende reagentia (10 µL totale volume): 1 µL aangepast zin oligo (100 mM); 1 µL aangepast antisense oligo (100 mM); 1 µL 10 x T4 afbinding Buffer; 6.5 µL ddH2O; 0,5 ΜL T4 PNK. Incubeer in een thermo-cycler gedurende 30 minuten bij 37 ° C, en 5 min bij 95 ° C, en vervolgens oprit tot 25 ° C bij 5 ° C/min.
- De volgende reactie van de afbinding instellen en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (10 µL totale volume): X µL Bbsik verteerd plasmide (50 ng); 1 µL phosphorylated en gegloeid, oligo duplex (1:200 verdunning); 5 µL 2 x afbinding buffer; X µL ddH2O; 1 µL snelle ligase.
- Voeg 2 µL van het product van de afbinding in 50 µL van chemisch bevoegde DH5α Escherichia coli cellen. Na 30 min van incubatie op ijs, vuur schok het monster voor 90 bij 42 ° C, s en incubeer gedurende 2 min op ijs. Voeg 100 µL van LB medium en het op een bord van de LB met 100 µg/mL ampicilline plaat.
Opmerking: De integratie van de volgorde van de sgRNA in het pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide wordt uitgevoerd volgens de klonen stappen voor de pX330 plasmide14. - Inoculeer twee kolonies, elk in 2 mL zuiver LB medium bij 37 ° C gedurende ten minste 6 uur, en het uitvoeren van een mini prep DNA isolatie met behulp van een kit.
- Sanger sequentie van het DNA van de mini prep met behulp van de hU6-Forward primer en de identificatie van de kolonies met de juiste invoeging van sgRNAs door uitlijnen met de volgorde getoond in stap 1.2.1. De primer-sequentie is getoond in tabel 1. Plasmiden gebruikt in deze studie werden genoemd pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre en pU6-sgControl-Cbh-Cre.
- Enten van de kolonies correct geïdentificeerd en zuiveren de endotoxine-vrije plasmide DNA voor in utero electroporation met behulp van een kit, bijvoorbeeldvan Qiagen. Elueer het DNA met endotoxine-gratis TE-Buffer verdund in ddH2O om 1:10 (10% TE buffer). De DNA-concentratie van de plasmide moet hoger zijn dan 2 mg/mL.
Opmerking: Gebruik geen een regelmatige maxi-prep-kit voor de voorbereiding van het DNA. Plasmide-oplossingen bij 4 ° C voor regelmatig op korte termijn gebruik (maximaal 4 weken) of hoeveelheid een passende omvang van ongeveer 25 µL opslaan en houd bij-20 ° C voor langdurige opslag.
- Twee oligos van DNA als volgt samenvatten. Sense: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. testen van de efficiëntie van de sgRNAs met behulp van het systeem van de plasmide EGxxFP
Opmerking: De efficiëntie van de sgRNAs wordt normaal getest door landmeter of T7E1 (T7 endonuclease ik) testen. In dit protocol, wordt een gemakkelijke en efficiënte alternatieve benadering gebruikt. De sleutel van deze benadering is het gebruik van de pCAG-EGxxFP-plasmide waarin overlappende EGFP fragmenten gescheiden door een DNA-sequentie met de sgRNA dat targeting site17. Op de uitdrukking van pCAG-EGxxFP samen met de sgRNA en de Cas9 in de transfected cellen, wordt de dubbele streng Cas9-gemedieerde onderbreking (DSB) in de opeenvolging van het doel hersteld door endogene homologie-afhankelijke mechanismen, die de expressie van EGFP reconstitutes cassette.
- Inleidingen aan het versterken van de genomic regio gecentreerd met de sgRNA dat targeting sequenties te ontwerpen. De PCR-amplicon is ongeveer 500 bp. In dit experiment, werd een DNA-vergadering toegepast om het klonen van een PCR-amplified fragment in het pCAG-EGxxFP-plasmide.
Opmerking: U kunt ook passende beperkingsplaatsen kunnen worden toegevoegd aan het einde 5' van de PCR inleidingen. Beschikbare beperkingsplaatsen in de pCAG-EGxxFP-vector zijn BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI en EcoRV. - Versterken de genomic DNA met ontworpen inleidingen met formulier en PCR parameters hieronder. Laden van het monster (19.7 µL H2O; 0,3 µL van 10 ng/µL muis genomic DNA; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R, 25 µL 2 X PCR master mix; 50 µL totale volume) op een 1% agarose gel en gel-zuiveren van de PCR-fragmenten met behulp van een gel-extractie-kit. Gebruik de volgende reactie voorwaarden: 95 ° C gedurende 3 minuten; dan 35 x cycli van 98 ° C voor 20 s, 60 ° C gedurende 15 s, 72 ° C voor 20 s, en 72 ° C gedurende 1 min; 4 ° C, voor onbepaalde tijd.
Opmerking: In dit experiment, een regio in Top2b exon 1 werd versterkt; in tabel 1vindt u de primer sequenties. - Digest de pCAG-EGxxFP-vector met restrictie-enzymen BamHI en EcoRI gedurende 2 uur bij 37 ° C, dan laden van het monster op een 1% agarose gel en gel-zuiveren de ruggengraat van de vector met behulp van een gel-extractie-kit. Gebruik de volgende reagentia (50 µL totale volume): X µL plasmide (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL EcoRI; 5 µL 10 x Buffer; X µL ddH2O.
- Instellen van de DNA vergadering reactie18 volgens de instructies van de fabrikant, en transformeren in DH5α bevoegde E. coli.
- Enten twee kolonies, elk in 2 mL van LB medium bij 37 ° C gedurende ten minste 6 uur, een mini prep DNA isolatie met behulp van een kit, bijvoorbeeldvan Qiagen, uitvoeren en kolonies identificeren met de juiste invoeging (hierna te noemen de pCAG-EG-Top2b-FP) met behulp van Sanger sequencing met de EGxxFP-Top2b-F-primer.
- Transfect HEK293T cellen.
- Zaad de HEK293T cellen in een 24-well plaat 24u voor Transfectie.
Opmerking: Cellen waren in een cel incubator van 37 ° C met 5% CO2, in DMEM gekweekt met glutamine supplement met 10% FBS en 1% penicilline/streptomycine. Zorg ervoor dat de cellen 60% heuvels op de dag van de transfectie. In dit experiment gebruikten we zelf-gemaakte HEK293T cellen stabiel uiting van SpCas9 voor het testen van pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Wildtype HEK293T cellen kunnen echter worden gebruikt als een vector SpCas9 expressie wordt verstrekt. - Transfect de HEK293T cellen met behulp van het reagens polyethylenimine (PEI). Transfect van de cellen met 120 ng/putje van pCAG-EG-Top2b-FP plasmide12 en 120 ng/putje van pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre of pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre in een 24-well-plate. Meng de plasmide ANI's en de 1.8 µL van PEI reagens in 80 µL van unsupplemented DMEM medium met glutamine supplement en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur na vortexing.
- 6 uur na de transfectie, verwijder het medium en vervang met verse medium.
- Toezicht op de aanwezigheid van levende GFP+ cellen 48u na transfectie met behulp van een fluorescentie Microscoop op 20 x vergroting.
Opmerking: Het aantal GFP+ cellen geeft de targeting efficiëntie van de sgRNA. Resultaten van effectieve en niet-effectieve sgRNAs (sgTop2b-1 en sgTop2b-2, respectievelijk) worden weergegeven in figuur 2A.
- Zaad de HEK293T cellen in een 24-well plaat 24u voor Transfectie.
3. Voer In Utero Electroporation
- 6 tot 8 weken oude muizen fokken en de hulpprogramma's voorbereiden in utero electroporation. Kruis mannelijke homozygoot Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP muizen met vrouwelijke CD-1 mice. Tijd de zwangerschap van de CD-1 mice vanaf de dag dat de stekker van de vaginale is gedetecteerd (E0.5). Embryo's zijn dag E13.5 electroporated.
- Trekken van borosilicaatglas haarvaten (binnendiameter: 0,6-0,8 mm) met een trekker van de micropipet. Gebruik de volgende instellingen: P = 500, warmte = 560, Pull = 150, Vel = 75, tijd = 250. Label de capillaire tip met zwarte inkt voor betere visualisatie tijdens de injectie. Trim de capillaire conus onder een stereomicroscoop met behulp van een liniaal en scherpe naald pincet en trim de tip op een lengte van ongeveer 6 mm.
- Het handhaven van de eenheid van de haarvaten te houden van het experiment kunnen worden gereproduceerd. Maak een eenzijdige afgeschuinde rand tijdens het wegsnijden. De tip moet zo scherp mogelijk voor gemakkelijk penetratie in de baarmoederwand en het vermijden van weefselschade van het embryo.
Opmerking: Gebruik als alternatief een micro molen aan te passen een hoek 35°19. De haarvaten kunnen worden opgeslagen op kamertemperatuur in een 10 cm petrischaal pathogenen vrije omstandigheden. - Autoclaaf de chirurgische instrumenten.
- Meng de sgRNA-plasmiden in gelijke delen met pT2K-IRES-Luc om een eindconcentratie van ten minste 1 µg/µL voor elke plasmide en kleur de plasmide-oplossing met snel groen (eindconcentratie van 0,05%). 1% snel groene stockoplossing met gedestilleerd water endotoxine-vrije en filter voor te bereiden door een 0,22 µm filter kleurstof om deeltjes te verwijderen uit de oplossing.
Opmerking: Co transfectie van pT2K IRES-Luc is optioneel, maar kan voor identificatie van levensvatbare electroporated dieren na de geboorte met bioluminescentie imaging. Gelieve te zien stap 3.5. Een voldoende hoeveelheid van de plasmide-mix voorbereiden op het totale aantal zwangere muizen worden geëxploiteerd. Gebruiken ongeveer 15-20 µL Meng per muis (~ 12 embryo's). Meteen doorgaan met de operatie.
- Muizen voorbereiden op operatie.
- Anesthetize zwangere CD-1 mice met Isofluraan. Verdoving in een doos met 3-4 vol-% Isofluraan induceren (zuurstof debiet: 1,5 L/min) en het onderhouden met 2 vol-% tijdens de operatie via de neus.
Opmerking: De volledige operatie moet niet langer duren dan 30 min. verminderen het aantal geïnjecteerd en electroporated embryo's, indien nodig. Gebruik van steriele handschoenen voor chirurgie. - Plaats de muis op de rug een verwarming pad en aanpassen van de verdoving.
- Pijnstiller injecteren (Metamizol, 800 mg/kg lichaamsgewicht, subcutaan (SC), 24u depot).
Opmerking: U kunt andere geautoriseerde pijnstillers dan Metamizol. - Toepassing oog zalf om te voorkomen dat oog-droogte tijdens de operatie.
- Ledematen met tape vast te stellen en steriliseren van de buik met een ontsmettingsmiddel. Dekking van de muis met gaas, waardoor alleen het chirurgische gebied blootgesteld. 70% ethanol verspreid over chirurgische gebied en gaas.
- Maak een huid incisie ongeveer 2 cm in lengte en verbreden van de kloof zachtjes met een rechte chirurgische schaar. Zoek de linea alba en maken een iets kleinere tweede snede via het buikvlies weefsel met schaar met stompe punt.
- Bevochtig de geopende buikholte met voorverwarmde steriele 1 x PBS.
- Pak zorgvuldig de baarmoeder horens uit de buikholte met behulp van ring pincet. Trek voorzichtig door grijpen de baarmoederwand uitsluitend op de kloof tussen de dooier zakjes van twee naburige embryo's. Vermijd elke druk op het embryo terwijl te trekken door middel van de incisie. Vergroten van de incisie, indien nodig en extra zorg om de positie van de baarmoeder hoorns op de buik terwijl de bloedstroom door de slagader in de baarmoeder niet te comprimeren.
Opmerking: In sommige gevallen is het aangeraden om een baarmoeder hoorn tegelijk uitpakken en vervangen voordat u verdergaat met de tweede uteriene hoorn.
- Anesthetize zwangere CD-1 mice met Isofluraan. Verdoving in een doos met 3-4 vol-% Isofluraan induceren (zuurstof debiet: 1,5 L/min) en het onderhouden met 2 vol-% tijdens de operatie via de neus.
- Injectie en electroporation van plasmide Ani
- Ongeveer 15 µL van gekleurde plasmide-oplossing met de bereid glazen capillaire gecombineerd. Vermijd alle luchtbellen tijdens dit proces.
Opmerking: De plasmide-oplossing kan verstoppen de tip gemakkelijk als de concentratie hoog is. Test het capillair door het vrijgeven van sommige DNA vlak voor de injectie. - Zachtjes Houd het embryo met een ring Tang en ga naar het gedeelte van de nek.
Opmerking: Als het embryo zich in een positie die moeilijk te injecteren, overslaan en ga voor de volgende embryo. Verhoogde herpositionering van het embryo kan verhogen kans op schade aan hen. - Langzaam doorboren met het topje van de eerder bereid glazen capillaire in de vierde ventrikel door dringen via de dorsale hindbrain en vervolgens ongeveer 1 µL van de plasmide-mix te injecteren. Bevestigen dat de geverfde DNA niet uit de hersenen gelekt is en zichtbaar als een ruitvormige structuur is.
Opmerking: Als een optie, 2.5-fold vergrootglazen te gebruiken voor betere visualisatie van de vierde ventrikel en omringende bloedvaten. Leveren elektrische pulsen onmiddellijk na de inspuiting ter voorkoming van verspreiding van de plasmide-oplossing aan de andere ventrikels. - Toepassing van elektrische vierkante pulsen (5 pulsen, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) met platina pincet Tang-achtige (Zie Tabel van materialen). Plaats de elektroden lateraal met de minpool die betrekking hebben op het oor en de positieve pool op de cerebellaire primordium geplaatst over de baarmoederwand. 5 mm-diameter elektrode platen voor effectieve electroporation van E13.5 embryo's gebruiken.
Opmerking: Verhogen de overlevingskans van pups door het manipuleren van minder dan 2/3rd van het totale aantal embryo's per dam. Embryo's te dicht op de baarmoederhals voorkomen. Als gemanipuleerd, kunnen ze leiden tot complicaties tijdens arbeid en in gevaar brengen het hele nest. Indien de elektroden zijn ook het hart van het embryo, dit kan leiden tot een hartstilstand.
- Ongeveer 15 µL van gekleurde plasmide-oplossing met de bereid glazen capillaire gecombineerd. Vermijd alle luchtbellen tijdens dit proces.
- Post-electroporation en na chirurgie care
- Zorgvuldig plaats baarmoeder horens terug in de buikholte en vullen met vooraf opgewarmd steriele 1 x PBS. Laat de baarmoeder horens dia in een natuurlijke positie.
- Sluit het buikvlies en de huid apart verder met een eenvoudige continu hechtdraad.
Opmerking: Neem extra zorg niet te doorboren via de baarmoederwand, wanneer wordt het buikvlies. - Shut-down de narcose en plaats het dier buik-down in een nieuwe kooi.
- Het dier volgen tijdens de wakende fase en weer 24 uur na de operatie. Schakel de kooi onder een lamp van Verwarming, als het beven niet binnen een 15 min tijd-frame verbeteren en het dier niet start grooming.
- Bevestig succesvolle electroporation door luciferase imaging.
- Zorg ervoor dat de bediende dammen embryo's op tijd (op E19.5 dalen).
Opmerking: De geboortedatum kan worden uitgesteld tot de volgende dag waarschijnlijk vanwege de operatie. - Anesthetize de electroporated pups (P5-P7) met 2,5% Isofluraan en injecteren (intraperitoneaal (i.p.)) met D-luciferine (3 mg/kg lichaamsgewicht) 5 minuten voorafgaand aan de beeldvorming.
- Detecteren luciferase signalen in de electroporated pups met behulp van de Bioluminescentie imager.
Opmerking: Een belichtingstijd van 1 min is voldoende om het luciferase signaal te detecteren. Radiance (p/s/cm2/sr) is ongeveer > 1 x 106.
- Zorg ervoor dat de bediende dammen embryo's op tijd (op E19.5 dalen).
4. bereid cryosecties van de Electroporated Cerebella
- De electroporated P7 pups euthanaseren en ontleden uit het cerebellum.
Opmerking: Het GFP-signaal kan worden waargenomen met behulp van een stereoscoop epifluorescerende. - 'S nachts herstellen van de cerebella in 5 mL per hersenen van 4% PFA in PBS bij 4 ° C.
- Overdracht van de vaste cerebella overnachting in 10 mL per hersenen van 30% sucrose in PBS bij 4 ° C.
Opmerking: Het weefsel moet bereiken de onderkant van een buis 15 mL na incubatie in de sacharoseoplossing. - Na het inweken van de resterende sacharoseoplossing met een stuk van cellulose filtreerpapier, dompel het cerebellum in een optimale scherpe temperatuur (OCT) samengestelde in een wegwerp plastic mal en bevriezen op droog ijs. Het cryogene blok kan worden achtergelaten bij-80 ° C tot gebruik.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd. - Snijd het cryogene blok in secties met 10 µm in dikte met behulp van een cryostaat en houden van de secties bij-80 ° C tot gebruik.
Opmerking: Men kan bevestigen GFP expressie in de secties, na het wassen uit de LGO samengestelde met PBS.
5. immunokleuring van de cryosecties
- Droog de dia's op room temperature voor 30 min en wassen tweemaal voor 10 min in PBS.
- Cirkel van de secties met een vloeibare blocker-pen en de secties in een blokkerende oplossing uit te broeden (10% normale ezel serum in PBS met 0,1% Triton-X100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Toevoegen van primaire antilichamen tegen de moleculen van belang (b.v., GFP en topoisomerase II bèta (Top2B) in deze studie) in de blokkerende oplossing en na een nacht bebroeden bij 4 ° C.
Opmerking: De namen en de concentraties van antilichamen gebruikt staan in de Tabel van materialen. Om te vergroten GFP signalen, kan een anti-GFP-antilichaam optioneel worden gebruikt samen met de andere antistoffen. - De dia's met 0,1% Triton-bevattende PBST 3 X 10 min. Incubate de secties gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met een fluorophore-geconjugeerde secundair antilichaam verdund in de blokkerende oplossing met DAPI wassen.
- Wassen van de dia's in PBS 3 X 10 min. Mount de dia's en houd bij 4 ° C tot imaging.
Opmerking: Het protocol kan hier worden gepauzeerd.
6. imaging en analyse
- Het imago van de secties met behulp van een confocal microscoop op 20 x vergroting.
- Het aantal positieve cellen GFP verliezen de expressie van het target-eiwit. Een representatieve afbeelding wordt getoond in figuur 2B.
- Controleer het moleculaire fenotype bij ablatie van de doelgenen in BNP en hun nakomelingschap door immuostaining12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Voor in vivo functionele analyse is het cruciaal voor het identificeren van de cellen waarin exogene gene(s) bijgekomen. Terwijl de expressie van een markering, zoals GFP in niet-prolifererende cellen kan worden gevolgd-up voor een lange periode van tijd, het signaal sequentieel verdwaalt in delende cellen. Een illustratie van dit effect wordt geïllustreerd in Figuur 1. Om te omzeilen de voetafdruk van transfected cellen in LOF analyses verliezen, ontwikkeld wij een nieuwe benadering door gene electroporation gebaseerde levering te combineren met de CRISPR/Cas9-technologie.
Representatieve resultaten worden weergegeven in Figuur 2. Functionaliteit van de plasmide constructies is getest door voorbijgaande transfectie van pU6-sgTop2b-Cbh-Cre en pCAG-EG-Top2b-FP17, uitvoering van de doel-reeks van sgTop2b, in HEK293T cellen stabiel uitdrukken SpCas9 (figuur 2A). De activiteit Cas9 endonuclease sgRNA-geleide induceert DSB-gemedieerde homologie geleide reparatie van de EGFP expressie cassette. Vandaar, was de functie van de sgRNA rechtstreeks geanalyseerd door detectie van GFP expressie. Volgens Mashiko et al.bepaalt een efficiëntie van de transfectie van meer dan 30% een sgRNA als effectief17.
Het BNP is afkomstig van de romboëdrisch lip (RL), een regio die grenst aan het dak van de vierde ventrikel in embryonale stadia E12.5 tot E16.5. Deze cellen zijn gekend om te ondergaan van massale verspreiding na de geboorte in de buitenste externe submodule laag (oEGL) en de verschuiving naar de innerlijke EGL (iEGL) na het verlaten van de celcyclus20. Het BNP zijn dus een passend voorbeeld om te testen van de voordelen van onze genetische labeling aanpak.
Door het volgen van dit protocol, kunt in utero electroporation van BNP traceren van bewerkte cellen met GFP. Wij introduceerden de pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide sgControl uitdrukken in de cerebellaire primordium van Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP muizen embryonale stadium E13.5. Muizen werden geofferd op postnatale dag P7, en Sagittaal secties van cerebellaire weefselsecties werden gekleurd door immunohistochemie. Uiterlijke en innerlijke EGL werden gedefinieerd door Ki67 expressie (oEGL) en p27 expressie (iEGL), respectievelijk. Ondanks het ondergaan proliferatie en rijping, behouden de volwassen cerebellaire submodule neuronen (CGNs) nog steeds sterke GFP expressie (figuur 2B).
Nadruk op het nut van dit protocol, gebruikten we bovendien de sgRNA dat targeting DNA Top2b als een representatief voorbeeld. Experimentele procedures werden uitgevoerd zoals eerder beschreven (Zie figuur 2B). Allermeest naar de GFP-positieve cellen transfected met sgRNAs voor Top2b tentoongesteld een verlies van Top2b expressie in de interne submodule laag (IGL), terwijl de invoering van controle sgRNAs niet in duidelijke vermindering van de expressie (figuur 2C resulteren). Een kwantificering van dit resultaat is afgebeeld in figuur 2D. Deze gegevens dienen een waardevol hulpmiddel voor het traceren van bewerkte cellen voor een lange periode van tijd tijdens ontwikkeling of tumor vorming.
Figuur 1: schematische weergave van GFP expressie in cellen delende en niet-prolifererende. (A) wanneer een exogene gen die coderen GFP (b.v., pCAG-EGFP) is in niet-prolifererende cellen, cellen transfected GFP voor een lange tijd (bovenste lane uitspreken kan). Ondertussen, GFP expressie zouden verdwijnen in de delende cellen door verdunning van exogene GFP (middelste rijstrook). Daarentegen kunnen de cellen die de LoxP-Stop-LoxP-GFP (LSL-GFP) transgenic voeren het GFP-expressie tijdens proliferatie na transfectie met Cre recombinase (lagere lane) houden. (B) het beginsel van SpCas9-gemedieerde gene zwijgen en GFP expressie na Cre en sgRNA transfectie in een Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP muis stam. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: vertegenwoordiger afbeeldingen van de resultaten van dit protocol. (A) HEK293T cellen stabiel uiting van SpCas9 met pU6-sgTop2b-Cbh-Cre en pCAG-EG-Top2b-FP plasmiden zijn transfected. GFP expressie in levende cellen werd gecontroleerd met behulp van een fluorescerende cel imager (Zie Tabel van materialen) 48 h na transfectie. Links en rechts panelen tonen een effectieve en niet-effectieve sgRNA reeks gebaseerd op GFP expressie, respectievelijk. Schaal bars: 100 µm. (B) immunokleuring van GFP, Ki67 en p27 op de P7-cerebella van een Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP muis onderworpen aan electroporation op E13.5 met pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide constructies uiting controle sgRNA. De sectie is counterstained met de DAPI (blauw). Schaal bars: 50 µm; 20 x vergroting. Opmerking cellen GFP-uiting in de oEGL gekenmerkt door Ki67. (C) immunokleuring van GFP (groen) en Top2b (magenta) op de P7-cerebella van een Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP muis die electroporated op E13.5 met pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide was construeert waarin sgRNA tegen Top2b (sgTop2b) en een sequentie (sgControl). Pijlen geven aan Top2b expressie in GFP+ cellen in hetzelfde veld. Schaal bars: 20 µm; 20 x vergroting. (D) kwantificering van Top2b in electroporated (GFP-positief) cellen in sgControl en sgTop2b experimenten. Twee en drie pups werden onderzocht voor sgControl en sgTop2b, respectievelijk, en 25 cellen van elke hersenen werden geanalyseerd. Foutbalken vertegenwoordigen ± standaardafwijking van het gemiddelde (SEM) en de p-waarden werden berekend door ongepaarde t-testen, *p = 0.0002. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| Naam | Volgorde | Toepassing | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA doel volgorde | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA doel volgorde | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA doel volgorde | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Klonen in pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Klonen in pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Volgorde van sgRNA | |
Tabel 1: Sequenties van oligos worden gebruikt in deze studie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met behulp van exo utero electroporation, hebben we eerder gemeld op basis van siRNA in vivo functionele analyses van Atoh1 in een vroeg stadium voor cerebellaire granule cel differentiatie8. Als gevolg van siRNA verdunning/afbraak en blootstelling van embryo's buiten de baarmoederwand was fenotypische analyse van de cellen van de submodule electroporated beperkt tot de embryonale stadia. Analyse van het fenotype van postnatale dieren is echter de huidige methode ingeschakeld.
Onze vorige studie aangetoond dat Cas9-gemedieerde knockout van tumor suppressor Ptch1 via in utero electroporation succesvol geïnduceerde medulloblastoom2. Ter vergelijking: de huidige aanpak vertoont twee belangrijke voordelen: 1) Cas9 hoeft niet te worden geleverd met de plasmide, waardoor meerdere gentargeting door middel van meerdere cassettes van de expressie van de sgRNA in een enkele plasmide in plaats daarvan; en 2) de doelcellen en hun nakomelingschap worden permanent aangeduid met GFP, waardoor de visualisatie van de levende cellen en analyse van het gedrag van de omvorming van de tumor cellen in vivo.
De belangrijkste stappen van dit protocol zijn de juiste injectie van plasmide ANI's naar de correcte locatie en de levering van elektrische pulsen in de aangewezen plaatsen in de hersenen. Cerebellaire neuronen zijn geboren uit de cerebellaire neuroepithelium opeenvolgend in een geboortedatum-afhankelijke manier. Niet alle soorten cellen in de cerebellaire primordium kunnen worden gericht via electroporation, omdat slechts een bepaalde tijd venster bij E12.5-14,5 technisch haalbaar is. Diep cerebellaire kernen neuronen en Purkinje cellen zijn gekend ontstaan op E10.5-11,5, wanneer de extra-embryonale vliezen niet transparant zijn en het embryo niet duidelijk zichtbaar voor DNA injectie is. Later, unipolaire borstel cellen zijn afgeleid van E17.5 bovenste RL (uRL), wanneer de vierde ventrikel is te smal om te injecteren een voldoende hoeveelheid van DNA in de nabijheid van de uRL. Onze methode is dus alleen van toepassing op E12.5-14,5, die voornamelijk gericht is op Midden - en hoger-geboren progenitorcellen, zoals van het BNP en remmende interneuronen. Een ander nadeel van de methode is dat het fenotype van een volledige knock-out niet mogelijk in vergelijking met Cre/LoxP-gemedieerde germline GEMMs, aangezien de enige duizenden cerebellaire cellen kunnen worden gericht door electroporation in elk embryo.
In een eerdere studie cellen ongeveer 80% van de cerebellaire submodule GFP-positieve verloren expressie van de gerichte gene12. Terwijl de identiteit van de submodule cellen werd bevestigd door moleculaire merkers en de verdeling daarvan, deze identificatie aanpak mogelijk niet altijd van toepassing, zoals genen van belang zou kunnen worden betrokken bij de markeerdraad expressie en neuronale migratie. Voorwaardelijke activering van Cre met behulp van een cel-specifieke promotor zou in dit geval het probleem oplossen. Daarom kan de huidige alomtegenwoordige Cbh promotor in het pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide worden vervangen door een cel-specifieke promotor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij waarderen Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim en Petra Schroeter voor technische bijstand. Wij danken ook Drs. K. Reifenberg, K. Dell en P. Prückl voor nuttige bijstand voor dierproeven op DKFZ; de Imaging Core faciliteiten van de DKFZ en de Carl Zeiss Imaging Center in de DKFZ voor confocale microscopie imaging. Dit werk werd gesteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (DK).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
