Summary
पारंपरिक नुकसान-की-समारोह जीन नॉकआउट जानवरों का उपयोग कर के अध्ययन अक्सर महंगा हो गया है और समय लेने वाली । Electroporation आधारित CRISPR-मध्यस्थता दैहिक mutagenesis vivo मेंजीन कार्यों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । यहां, हम सेरिबैलम के proliferating कोशिकाओं में नॉकआउट phenotypes का विश्लेषण करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट ।
Abstract
मस्तिष्क कुरूपता अक्सर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण होता है । रोगी-व्युत्पन्न ऊतकों में उत्परिवर्तनों का गूढ़ रूप से रोगों के संभावित करणीय कारकों की पहचान की है । रोग के विकास के लिए रूपांतरित जीन की एक शिथिलता के योगदान को मांय करने के लिए, पशु उत्परिवर्तनों ले मॉडल की पीढ़ी के एक स्पष्ट दृष्टिकोण है । जबकि germline आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) लोकप्रिय जैविक उपकरण और प्रदर्शन reproducible परिणाम हैं, यह समय और लागत से प्रतिबंधित है । इस बीच, गैर germline GEMMs अक्सर एक अधिक व्यावहारिक तरीके से जीन समारोह की खोज सक्षम करें । के बाद से कुछ मस्तिष्क रोगों (जैसे, ब्रेन ट्यूमर) दैहिक लेकिन नहीं germline उत्परिवर्तनों से परिणाम दिखाई देते हैं, गैर germline chimeric माउस मॉडल, जिसमें सामांय और असामांय कोशिकाओं के एक साथ रहना, रोग प्रासंगिक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है । इस अध्ययन में, हम सेरिबैलम में CRISPR की मध्यस्थता दैहिक उत्परिवर्तनों की प्रेरण के लिए एक विधि की रिपोर्ट । विशेष रूप से, हमने सशर्त दस्तक-चूहों का उपयोग किया, जिसमें Cas9 और GFP के जीनोम के Cre-मध्यस्थ पुनर्संयोजन के बाद सीएजी (सीएमवी बढ़ाने वाले/चिकन अ ß य-actin) प्रवर्तक द्वारा जीर्ण रूप से सक्रिय किए जाते हैं । स्व-डिजाइन एकल गाइड RNAs (sgRNAs) और Cre recombinase अनुक्रम, दोनों एक एकल प्लाज्मिड निर्माण में इनकोडिंग, अनुमस्तिष्क स्टेम में एक भ्रूण जनक utero में उपयोग कर चरण/electroporation कोशिकाओं में वितरित किया गया । नतीजतन, transfected कोशिकाओं और उनकी बेटी कोशिकाओं को हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), इस प्रकार आगे phenotypic विश्लेषण की सुविधा के साथ लेबल थे । इसलिए, इस विधि electroporation नहीं दिखा रहा है केवल भ्रूण अनुमस्तिष्क कोशिकाओं में जीन वितरण आधारित है, लेकिन यह भी एक उपंयास मात्रात्मक दृष्टिकोण के लिए CRISPR-मध्यस्थता हानि-समारोह phenotypes का आकलन का प्रस्ताव ।
Introduction
मस्तिष्क रोगों सबसे भयानक नश्वर रोगों में से एक हैं । वे अक्सर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और बाद में dysregulation से परिणाम । मस्तिष्क रोगों के आणविक तंत्र को समझने के लिए, कभी मानव रोगियों के जीनोम को समझने के लिए स्थाई प्रयासों संभावित करणीय जीन की एक संख्या की खोज की है । अब तक, germline आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल vivo लाभ में समारोह के लिए उपयोग किया गया है (गोफ) और नुकसान की-समारोह (LOF) ऐसे उंमीदवार जीन का विश्लेषण । कार्यात्मक सत्यापन अध्ययन के त्वरित विकास के कारण, एक और अधिक व्यवहार्य और व्यावहारिक जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए vivo जीन परख प्रणाली में लचीला वांछनीय है ।
vivo electroporation-आधारित जीन अंतरण प्रणाली में विकासशील माउस मस्तिष्क के लिए एक के आवेदन इस प्रयोजन के लिए उपयुक्त है । वास्तव में, कई अध्ययनों utero electroporation में उपयोग कर अपनी क्षमता के लिए विकासशील मस्तिष्क1,2,3में कार्यात्मक विश्लेषण आचरण दिखाया है । दरअसल, इस तरह के सेरेब्रल प्रांतस्था4के रूप में माउस मस्तिष्क, के कई क्षेत्रों, रेटिना5, diencephalon6, hindbrain7, सेरिबैलम8, और रीढ़ की हड्डी9 दैहिक जीन डिलिवरी द्वारा लक्षित किया गया है दृष्टिकोण, अब तक ।
दरअसल, भ्रूण माउस दिमाग पर vivo electroporation में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति लंबे समय गोफ विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में transposon आधारित जीनोमिक एकीकरण प्रौद्योगिकियों के आगे सक्षम दीर्घकालिक और/या ब्याज की जीन की सशर्त अभिव्यक्ति10,11, जो के दौरान एक स्थानिक और लौकिक तरीके से काटना जीन समारोह के लिए लाभप्रद है विकास. गोफ विश्लेषण के विपरीत LOF विश्लेषण अधिक चुनौतीपूर्ण रहा है । जबकि siRNAs और shRNA के क्षणिक अभिकर्मक-ले plasmids प्रदर्शन किया गया था, जीन की LOF के दीर्घकालिक प्रभाव exogenously और न्यूक्लिक जैसे plasmids एसिड, शुरू की अंतिम गिरावट के कारण की गारंटी नहीं कर रहे हैं । हालांकि, CRISPR/Cas प्रौद्योगिकी LOF विश्लेषण में एक ब्रेक के माध्यम से प्रदान करता है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग जीन (जैसे, GFP) या bioluminescent प्रोटीन (जैसे, जुगनू luciferase) गया है सह CRISPR के साथ transfected-Cas9 और sgRNAs-CRISPR-मध्यस्थता दैहिक उत्परिवर्तनों से अवगत कराया कोशिकाओं लेबल के लिए । फिर भी, इस दृष्टिकोण proliferating कोशिकाओं पर कार्यात्मक अध्ययन में सीमाएं हो सकती है, के बाद से exogenous मार्कर जीन पतला और लंबी अवधि के प्रसार के बाद नीचा दिखा रहे हैं । जबकि transfected कोशिकाओं और उनकी बेटी की कोशिकाओं को अपने जीनोम में CRISPR-प्रेरित उत्परिवर्तनों से गुजरना, उनके पैरों के निशान समय पर खो सकता है । इस प्रकार, आनुवंशिक लेबलिंग दृष्टिकोण इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए उपयुक्त होगा ।
हम हाल ही में अनुमस्तिष्क granules कोशिकाओं है कि उनके भेदभाव12के दौरान लंबी अवधि के प्रसार से गुजरना में एक CRISPR आधारित LOF विधि विकसित की है । transfected कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से लेबल करने के लिए, हमने Cre के साथ एक sgRNA ले जा रहे प्लाज्मिड का निर्माण किया और प्लाज्मिड cerebella-सीएजी-Rosa26-LSL-Cas9-P2A चूहों13 EGFP के utero में शुरू कर दिया । नियमित प्लाज्मिड वैक्टर EGFP एंकोडिंग के विपरीत, इस दृष्टिकोण सफलतापूर्वक transfected granules ंयूरॉन पुरोगामी (GNPs) और उनकी बेटी कोशिकाओं लेबल । इस विधि सामांय मस्तिष्क विकास और एक ट्यूमर की संभावना पृष्ठभूमि में proliferating कोशिकाओं में रुचि के जीन के समारोह vivo में समझ में महान समर्थन प्रदान करता है ।
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Protocol
पशु कल्याण विनियमों के अनुसार सभी पशु प्रयोग किए गए थे और इन्हें उत्तरदायी प्राधिकारियों द्वारा अनुमोदित किया गया है (Regierungspräsidium कार्ल्सृहे, अनुमोदन संख्या: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14, और G133/
१. उत्पन्न pU6-sgRNA-Cbh-Cre Plasmids
- डिजाइन sgRNA एक जीन के लक्ष्य के लिए पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल14के अनुसार ब्याज ।
नोट: इस प्रयोग में, दो sgRNAs माउस Top2b जीन और एक गैर लक्षित नियंत्रण sgRNA (तालिका 1) को लक्षित करने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । को पीटकर जीन (ओं) CRISPR प्रौद्योगिकी का उपयोग कर, sgRNAs के लिए या तो 5 ' क्षेत्र या प्रोटीन के आवश्यक कार्यात्मक डोमेन के कोडिंग अनुक्रम लक्ष्य डिजाइन किए जाने की जरूरत है । एक सुविधाजनक प्रारंभिक बिंदु के लिए सार्वजनिक रूप से उपलब्ध पूर्व परीक्षण के लिए sgRNA दृश्यों, छिपकली v2 माउस पीटकर पूल लाइब्रेरी15 की तरह झांग लैब से तैयार है । वैकल्पिक रूप से, sgRNAs ऐसे निंनलिखित वेबसाइट के रूप में सार्वजनिक उपलब्ध सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डिजाइन किया जा सकता है: crispr.mit.edu । - pU6-sgRNA-Cbh-Cre वेक्टर में sgRNAs क्लोन ।
नोट: pU6-sgRNA-Cbh-Cre वेक्टर12 इस अध्ययन में प्रयुक्त pX330 प्लाज्मिड के साथ SpCas9 के कोडिंग अनुक्रम की जगह द्वारा16 Cre मूल recombinase से व्युत्पंन है ।- संश्लेषित दो डीएनए ओलिगोस्पर्मिया निम्नानुसार है. भाव: 5 '-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3 '; Antisense: ३ '-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-५ '.
नोट: 20 N sgRNA अनुक्रम के लिए खड़े ऊपर दिखाया गया है । - डाइजेस्ट pU6-sgRNA-Cbh-Cre के लिए BbsI के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए निम्न reagents का उपयोग कर, डाइजेस्टर नमूना एक 1% agarose जेल में लोड, और उन्हें एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर शुद्ध । उपयोग 3 µ g प्लाज्मिड; 3 µ l किउI; 1 µ l FastAP; 5 µ एल 10x पाचन बफर; जोड़ें ddH2O कुल मात्रा को लाने के लिए ५० µ l.
- Phosphorylate और एनएन sgRNA ओलिगोस्पर्मिया के प्रत्येक जोड़ी का उपयोग कर निम्नलिखित रिएजेंट (10 µ l कुल मात्रा): 1 µ l अनुकूलित नब्ज oligo (१०० mM); 1 µ l स्वनिर्धारित antisense oligo (१०० mM); 1 µ एल 10x टी-4 बंधाव बफर; ६.५ µ l ddH2हे; ०.५ µ l टी-4 PNK । ३७ ° c पर 30 मिनट के लिए एक थर्मामीटर-साइकिल चालक में मशीन, और ९५ डिग्री सेल्सियस से कम 5 मिनट, और फिर 25 डिग्री सेल्सियस से कम 5 डिग्री सेल्सियस/
- निंनलिखित बंधाव प्रतिक्रिया सेट करें, और कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन (10 µ l कुल मात्रा): X µ l किउमैं पचा प्लाज्मिड (५० एनजी); 1 µ l phosphorylated और annealed, oligo द्वैध (1:200 कमजोर पड़ने); 5 µ l 2x बंधाव बफर; X µ l ddH2हे; 1 µ l त् ligase ।
- रासायनिक सक्षम DH5α ई कोलाई कोशिकाओं के ५० µ एल में बंधाव उत्पाद के 2 µ एल जोड़ें । बर्फ पर मशीन के 30 मिनट के बाद, गर्मी ४२ ° c पर ९० s के लिए नमूना झटका, और बर्फ पर 2 मिनट के लिए मशीन । पौंड मध्यम के १०० µ एल जोड़ें और यह एक पौंड प्लेट १०० µ g/एमएल एम्पीसिलीन युक्त पर प्लेट ।
नोट: pU6-sgRNA-Cbh-Cre प्लाज्मिड में sgRNA अनुक्रम के एकीकरण pX330 प्लाज्मिड14के लिए क्लोनिंग चरणों के अनुसार किया जाता है । - Inoculate दो कालोनियों, पौंड मध्यम के 2 मिलीलीटर में प्रत्येक 6 घंटे की एक ंयूनतम के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, और एक किट का उपयोग कर एक मिनी तैयारी डीएनए अलगाव प्रदर्शन ।
- सैंज अनुक्रम मिनी तैयारी डीएनए hU6-आगे प्राइमर का उपयोग कर, और कदम 1.2.1 में दिखाया अनुक्रम के साथ संरेखित करके sgRNAs की सही प्रविष्टि के साथ कालोनियों की पहचान । प्राइमर अनुक्रम तालिका 1में दिखाया गया है । इस अध्ययन में प्रयुक्त Plasmids का नाम pU6-sgTop2b-१-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-२-Cbh-Cre, और pU6-sgControl-Cbh-Cre है.
- Inoculate सही ढंग से पहचान की कालोनियों और utero electroporation में के लिए endotoxin मुक्त प्लाज्मिड डीएनए शुद्ध एक किट का उपयोग कर, उदाहरणके लिए, Qiagen से । Elute endotoxin के साथ डीएनए-मुक्त ते-ddH में पतला बफर2हे 1:10 (10% ते बफर) पर । प्लाज्मिड की डीएनए एकाग्रता 2 मिलीग्राम/एमएल से अधिक होने की जरूरत है ।
नोट: डीएनए तैयार करने के लिए एक नियमित मैक्सी-तैयारी किट का उपयोग न करें । स्टोर प्लाज्मिड-समाधान 4 डिग्री सेल्सियस पर नियमित रूप से अल्पकालिक उपयोग के लिए (अप करने के लिए 4 सप्ताह), या aliquot के बारे में एक उपयुक्त मात्रा 25 µ एल और लंबी अवधि के भंडारण के लिए-20 डिग्री सेल्सियस पर रहते हैं ।
- संश्लेषित दो डीएनए ओलिगोस्पर्मिया निम्नानुसार है. भाव: 5 '-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3 '; Antisense: ३ '-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-५ '.
2. EGxxFP प्लाज्मिड प्रणाली का उपयोग कर sgRNAs की दक्षता का परीक्षण
नोट: sgRNAs की दक्षता आम तौर पर सर्वेयर या T7E1 (T7 endonuclease मैं) परख द्वारा परीक्षण किया जाता है । इस प्रोटोकॉल में, एक आसान और कुशल वैकल्पिक दृष्टिकोण का प्रयोग किया जाता है । इस दृष्टिकोण की कुंजी है pCAG-EGxxFP प्लाज्मिड जो sgRNA लक्ष्यीकरण साइट17युक्त डीएनए अनुक्रम द्वारा अलग अतिव्यापी EGFP टुकड़े शामिल है का उपयोग करने के लिए है । की अभिव्यक्ति पर pCAG-EGxxFP के साथ एक साथ sgRNA और Cas9 transfected कोशिकाओं में, Cas9-मध्यस्थता डबल किनारा तोड़ (DSB) लक्ष्य अनुक्रम में अंतर्जात समरूपता-निर्भर तंत्र, जो EGFP अभिव्यक्ति का पुनर्गठन द्वारा मरंमत की है कैसेट.
- डिजाइन प्राइमर sgRNA लक्ष्यीकरण दृश्यों के साथ केंद्रित जीनोमिक क्षेत्र बढ़ाना । पीसीआर amplicon लगभग ५०० बीपी है । इस प्रयोग में, एक डीएनए विधानसभा pCAG-EGxxFP प्लाज्मिड में एक पीसीआर-प्रवर्धित टुकड़ा क्लोन करने के लिए लागू किया गया था ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, उचित प्रतिबंध साइटों को पीसीआर प्राइमरों के 5 ' अंत में जोड़ा जा सकता है । उपलब्ध प्रतिबंध साइटें pCAG-EGxxFP वेक्टर में BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI, और EcoRV हैं । - नीचे फार्म और पीसीआर मापदंडों का उपयोग कर डिजाइन प्राइमरों के साथ जीनोमिक डीएनए बढ़ाना । नमूना लोड (१९.७ µ एल एच2ओ; ०.३ µ एल के 10 एनजी/µ एल माउस जीनोमिक डीएनए; २.५ µ l 10 µ m EGxxFP-Top2b-च; २.५ µ l 10 µ m EGxxFP-Top2b-R; 25 µ l 2x पीसीआर मास्टर मिक्स; ५० µ l कुल मात्रा) पर एक 1% agarose जेल और जेल-एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर पीसीआर टुकड़े शुद्ध । निम्नलिखित प्रतिक्रिया की स्थिति का उपयोग करें: 3 मिनट के लिए 95 ° c; उसके बाद 20 एस के लिए ९८ डिग्री सेल्सियस के 35x चक्र, ६० डिग्री सेल्सियस के लिए 15 एस, ७२ ° c 20 s के लिए, और ७२ ° c 1 मिनट के लिए; 4 ° c, अनिश्चित काल तक ।
नोट: इस प्रयोग में, Top2b एक्सॉन 1 में एक क्षेत्र परिवर्धित किया गया था; 1 टेबलमें प्राइमरी दृश्यों का पता लगाएं । - डाइजेस्ट pCAG-EGxxFP प्रतिबंध एंजाइमों BamHI और EcoRI के लिए 2 एच ३७ डिग्री सेल्सियस पर, तो एक 1% agarose जेल और जेल पर नमूना लोड-वेक्टर रीढ़ एक जेल निष्कर्षण किट का उपयोग कर शुद्ध । निम्नलिखित रिएजेंट का उपयोग करें (५० µ l कुल मात्रा): X µ l प्लाज्मिड (3 µ g); 2 µ l BamHI; 2 µ l EcoRI; 5 µ एल 10x बफर; X µ l ddH2हे.
- स्थापित डीएनए विधानसभा प्रतिक्रिया18 निर्माता के निर्देशों के अनुसार, और DH5α सक्षम ई. कोलाईमें बदलना ।
- Inoculate दो कालोनियां, पौंड मध्यम के 2 मिलीलीटर में प्रत्येक 6 एच की एक ंयूनतम के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस, एक मिनी तैयारी डीएनए एक किट का उपयोग कर अलगाव प्रदर्शन, उदाहरणके लिए, Qiagen से, और सही प्रविष्टि के साथ कालोनियों की पहचान (इसके बाद pCAG के रूप में संदर्भित-जैसे-Top2b-FP) सैंज का उपयोग EGxxFP-Top2b-F प्राइमर के साथ अनुक्रमण ।
- Transfect HEK293T कोशिकाओं.
- अभिकर्मक से पहले 24-वेल प्लेट 24 एच में HEK293T कोशिकाओं को सीड कर लीजिये.
नोट: कोशिकाओं को ३७ ° c सेल मशीन में 5% CO 2 के साथ, glutamine पूरक के साथ DMEM में कल्चरित थे 10% FBS और 1% पेनिसिलिन/Streptomycin । सुनिश्चित करें कि कोशिकाओं ६०% अभिकर्मक के दिन पर धाराप्रवाह हैं । इस प्रयोग में हमने pU6-sgRNA-Cbh-Cre का परीक्षण करने के लिए SpCas9 को छुरा व्यक्त करते हुए स्वयं निर्मित HEK293T कोशिकाओं का उपयोग किया. हालांकि, wildtype HEK293T कक्षों का उपयोग किया जा सकता यदि कोई SpCas9 व्यंजक वेक्टर प्रदान किया गया है । - Transfect HEK293T polyethylenimine (पी) एजेंट का उपयोग कर कोशिकाओं । Transfect कोशिकाओं के साथ १२० एनजी के/pCAG-EG-Top2b-FP प्लाज्मिड12 और १२० के एनजी/अच्छी तरह से pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre या pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre एक 24 में अच्छी तरह से थाली । प्लाज्मिड DNAs और DMEM पूरक के साथ पूरक glutamine माध्यम के ८० µ एल में पी एजेंट के १.८ µ एल मिश्रण और भंवर के बाद कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए गर्मी ।
- 6 एच के बाद अभिकर्मक, मध्यम निकालें और ताजा माध्यम के साथ बदलें ।
- 20x आवर्धन पर एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग अभिकर्मक के बाद लाइव GFP+ कोशिकाओं ४८ ज की उपस्थिति की निगरानी ।
नोट: GFP+ कोशिकाओं की संख्या sgRNA की लक्ष्यीकरण क्षमता को इंगित करता है । प्रभावी और गैर प्रभावी sgRNAs (sgTop2b-1 और sgTop2b-2, क्रमशः) के परिणाम चित्रा 2aमें दिखाए जाते हैं ।
- अभिकर्मक से पहले 24-वेल प्लेट 24 एच में HEK293T कोशिकाओं को सीड कर लीजिये.
3. Utero Electroporation में परफॉर्म करें
- 6 से 8 सप्ताह पुराने चूहों नस्ल और utero electroporation में के लिए उपकरण तैयार करते हैं । क्रॉस नर homozygous Rosa26-सीएजी-LSL-Cas9-P2A-EGFP चूहों वाली मादा सीडी-१ चूहों के साथ. गर्भावस् था के समय CD-1 चूहों से दिन में योनि प्लग का पता लगाया जाता है (e 0.5) । भ्रूण दिन ई 13.5 पर electroporated हैं ।
- एक micropipette खींचने के साथ borosilicate ग्लास केशिकाओं (व्यास के अंदर: 0.6-0.8 मिमी) खींचो । निंन सेटिंग्स का उपयोग करें: P = ५००, हीट = ५६०, Pull = १५०, Vel = ७५, समय = २५० । इंजेक्शन के दौरान बेहतर दृश्य के लिए काली स्याही के साथ केशिका टिप लेबल । एक शासक और तेज सुई चिमटी का उपयोग कर एक stereomicroscope के तहत केशिका शंकु ट्रिम और के बारे में 6 मिमी की लंबाई पर टिप ट्रिम कर दीजिए ।
- प्रयोग reproducible रखने के लिए केशिकाओं की एकता बनाए रखें । ट्रिमिंग के दौरान एक-तरफा बेवल्ड किनारा बनाएं । टिप गर्भाशय की दीवार के आसान प्रवेश के लिए के रूप में संभव के रूप में तेज होना चाहिए और भ्रूण के ऊतकों को नुकसान से बचने के लिए ।
नोट: वैकल्पिक रूप से, एक माइक्रो चक्की का उपयोग करने के लिए एक ३५ ° कोण19समायोजित करें । रोगजनक मुक्त शर्तों के तहत एक 10 सेमी पेट्री डिश में कमरे के तापमान पर केशिकाओं संग्रहित किया जा सकता है । - शल्य यंत्रों को आटोक्लेव ।
- sgRNA-plasmids को pT2K-आयरेस-ल्यूक के साथ बराबर भागों में मिलाकर प्रत्येक µ के लिए एक अंतिम एकाग्रता के लिए µ एल प्लाज्मिड और रंग प्लाज्मिड-समाधान के साथ तेजी से हरे (०.०५% की अंतिम एकाग्रता) । समाधान से डाई कणों को दूर करने के लिए एक ०.२२ µm फिल्टर के माध्यम से endotoxin-मुक्त आसुत जल और फिल्टर के साथ 1% तेजी से हरी स्टॉक समाधान तैयार करें ।
नोट: pT2K आयरेस-ल्यूक के सह-अभिकर्मक वैकल्पिक है, लेकिन electroporated इमेजिंग का उपयोग कर जंम के बाद व्यवहार्य bioluminescence पशुओं की पहचान के लिए अनुमति देता है । कृपया चरण ३.५ देखें । गर्भवती चूहों की कुल संख्या के लिए प्लाज्मिड-मिश्रण की एक पर्याप्त मात्रा में तैयार करने के लिए संचालित किया जाना है । माउस (~ 12 भ्रूण) प्रति 15-20 µ एल मिश्रण के बारे में प्रयोग करें । सर्जरी के साथ तुरंत आगे बढ़ें ।
- सर्जरी के लिए चूहों को तैयार करें ।
- Anesthetize गर्भवती सीडी-1 चूहों isoflurane के साथ । 3-4 vol-% isoflurane (ऑक्सीजन प्रवाह दर: १.५ L/मिनट) के साथ एक बॉक्स में संज्ञाहरण प्रेरित और नाक शंकु के माध्यम से सर्जरी के दौरान 2 vol-% के साथ इसे बनाए रखने ।
नोट: पूर्ण शल्य चिकित्सा 30 मिनट से अधिक समय नहीं लेना चाहिए । इंजेक्शन और electroporated भ्रूण की संख्या को कम करने, यदि आवश्यक हो । शल्य चिकित्सा के लिए बाँझ दस्ताने का उपयोग करें । - एक हीटिंग पैड पर अपनी पीठ पर माउस प्लेस और संज्ञाहरण समायोजित करें ।
- एनाल्जेसिक सुई (Metamizol, ८०० मिलीग्राम/किलोग्राम शरीर के वजन, चमड़े के नीचे (एस॰सी॰), 24 एच डिपो) ।
नोट: आप Metamizol से अन्य अधिकृत एनाल्जेसिक का उपयोग कर सकते हैं. - सर्जरी के दौरान आंख सूखापन को रोकने के लिए आंख मरहम लागू करें ।
- टेप के साथ अंगों को ठीक करें और एक संक्रमित के साथ पेट को निष्फल । धुंध के साथ माउस को कवर, केवल शल्य क्षेत्र उजागर छोड़कर । सर्जिकल क्षेत्र और धुंध पर ७०% इथेनॉल फैला ।
- लंबाई में के बारे में 2 सेमी की एक त्वचा चीरा बनाओ और सीधे शल्य कैंची के साथ धीरे अंतराल को चौड़ा । लीनिया अल्बा का पता लगाने और कुंद टिप के साथ ऊतक कैंची का उपयोग कर एक थोड़ा छोटा दूसरा चीरा करने के लिए ।
- पूर्व गर्म बाँझ 1x पंजाबियों के साथ खोला उदर गुहा गीला ।
- ध्यान से उदर गुहा से अंगूठी संदंश का उपयोग कर गर्भाशय के सींग निकालने । दो पड़ोसी भ्रूण की जर्दी sacs के बीच के अंतर पर पूरी तरह से गर्भाशय की दीवार कब्जाने से धीरे खींचो । यह चीरा के माध्यम से खींच जबकि भ्रूण पर किसी भी दबाव से बचें । चीरा यदि आवश्यक हो तो और अतिरिक्त देखभाल पेट पर गर्भाशय सींग की स्थिति के लिए ले जबकि गर्भाशय धमनी के माध्यम से रक्त के प्रवाह को संपीड़ित नहीं ।
नोट: कुछ मामलों में, यह एक समय में एक गर्भाशय सींग निकालने और दूसरा गर्भाशय के सींग के साथ आगे बढ़ने से पहले इसे बदलने की सलाह दी है ।
- Anesthetize गर्भवती सीडी-1 चूहों isoflurane के साथ । 3-4 vol-% isoflurane (ऑक्सीजन प्रवाह दर: १.५ L/मिनट) के साथ एक बॉक्स में संज्ञाहरण प्रेरित और नाक शंकु के माध्यम से सर्जरी के दौरान 2 vol-% के साथ इसे बनाए रखने ।
- इंजेक्शन और प्लाज्मिड DNAs के electroporation
- महाप्राण रंग प्लाज्मिड के लगभग 15 µ एल-तैयार कांच केशिका के साथ समाधान । इस प्रक्रिया के दौरान किसी भी हवा-बुलबुले से बचें ।
नोट: प्लाज्मिड-समाधान टिप आसानी से रोकना अगर इसकी एकाग्रता उच्च है सकते हैं । इंजेक्शन से पहले कुछ डीएनए सही जारी करके केशिका परीक्षण । - धीरे अंगूठी संदंश के साथ भ्रूण पकड़ और गर्दन क्षेत्र का पता लगाने ।
नोट: यदि भ्रूण एक स्थिति के लिए सुई मुश्किल में है, इसे छोड़ और अगले भ्रूण के लिए जाना । भ्रूण की स्थिति में वृद्धि से उन्हें नुकसान की संभावना बढ़ सकती है । - धीरे से चौथे निलय में पहले से तैयार कांच केशिका के टिप के साथ पृष्ठीय hindbrain के माध्यम से मर्मज्ञ द्वारा पियर्स और बाद में प्लाज्मिड के बारे में 1 µ एल सुई मिश्रण । पुष्टि करें कि रंगे डीएनए मस्तिष्क से लीक नहीं है और एक हीरे के आकार का संरचना के रूप में दिखाई देता है ।
नोट: एक विकल्प के रूप में, चौथे निलय और आसपास के रक्त वाहिकाओं के बेहतर दृश्य के लिए २.५ गुना आवर्धक चश्मा का उपयोग करें । प्लाज्मिड के प्रसार को रोकने के लिए इंजेक्शन के तुरंत बाद बिजली दालों उद्धार-अन्य निलय के लिए समाधान. - संदंश-like प्लैटिनम चिमटी ( सामग्री की तालिकादेखें) के साथ बिजली वर्ग दालों (5 दालें, ३२ एमवी, ५० एमएस-ऑन, ९५० एमएस-ऑफ) लागू करें । इलेक्ट्रोड के बाद नकारात्मक ध्रुव कान को कवर और सकारात्मक अनुमस्तिष्क primordium पर गर्भाशय की दीवार पर तैनात ध्रुव के साथ रखें । ई 13.5 भ्रूण के प्रभावी electroporation के लिए 5 मिमी व्यास इलेक्ट्रोड प्लेट का प्रयोग करें ।
नोट: बांध प्रति भ्रूण की कुल संख्या के 2/3rd से कम जोड़ तोड़ से पिल्ले की जीवित रहने की दर में वृद्धि । भ्रूण भी गर्भाशय ग्रीवा के करीब से बचें । यदि हेरफेर, वे परिश्रम के दौरान जटिलताओं के कारण और पूरे कूड़े ख़तरे में डालना हो सकता है । यदि इलेक्ट्रोड भी भ्रूण के दिल के करीब हैं, यह हृदय की गिरफ्तारी का कारण हो सकता है ।
- महाप्राण रंग प्लाज्मिड के लगभग 15 µ एल-तैयार कांच केशिका के साथ समाधान । इस प्रक्रिया के दौरान किसी भी हवा-बुलबुले से बचें ।
- पोस्ट-electroporation और सर्जरी के बाद देखभाल
- ध्यान से उदर गुहा में वापस गर्भाशय सींग जगह और पूर्व गर्म बाँझ 1x पंजाबियों के साथ भरें । एक प्राकृतिक स्थिति में गर्भाशय सींग स्लाइड चलो ।
- एक साधारण सतत सीवन के साथ अलग से और आँख बंद करें ।
नोट: अतिरिक्त ध्यान रखना करने के लिए गर्भाशय की दीवार के माध्यम से नहीं पियर्स जब suturing । - बंद संज्ञाहरण नीचे और एक नया पिंजरे में पशु पेट नीचे जगह है ।
- जागते चरण के दौरान पशु पर निगरानी रखें और सर्जरी के बाद फिर से 24 ज. एक हीटिंग लैंप के तहत पिंजरे प्लेस, अगर कांप एक 15 मिनट के भीतर सुधार नहीं है समय-सीमा और पशु सौंदर्य शुरू नहीं करता है ।
- luciferase इमेजिंग द्वारा सफल electroporation की पुष्टि करें ।
- सुनिश्चित करें कि संचालित बांधों समय पर भ्रूण छोड़ (ई 19.5 पर) ।
नोट: जन्मतिथि के कारण शायद अगले दिन तक देरी हो सकती है. - Anesthetize electroporated पिल्ले (P5-P7) के साथ २.५% isoflurane और सुई (intraperitoneal (आईएफसआई)) के साथ डी-Luciferin (3 मिलीग्राम/किलो शरीर के वजन) 5 मिनट इमेजिंग करने से पहले ।
- electroporated पिल्ले में luciferase संकेतों का पता लगाने bioluminescence imager का उपयोग कर.
नोट: luciferase सिग्नल का पता लगाने के लिए एक 1 min एक्सपोज़र समय पर्याप्त है. चमक (p/s/cm2/sr) लगभग > 1 x 106है ।
- सुनिश्चित करें कि संचालित बांधों समय पर भ्रूण छोड़ (ई 19.5 पर) ।
4. Electroporated Cerebella से Cryosections तैयार करना
- Euthanize को electroporated P7 पिल्लर और काटना बाहर सेरिबैलम ।
नोट: GFP संकेत एक epifluorescent stereoscope का उपयोग करके देखा जा सकता है । - 4 ° c पर पंजाब में 4% पीएफए के मस्तिष्क प्रति 5 मिलीलीटर में रातोंरात cerebella को ठीक करें ।
- पंजाब में 4 डिग्री सेल्सियस पर 30% सुक्रोज के मस्तिष्क प्रति 10 मिलीलीटर में रातोंरात तय cerebella हस्तांतरण ।
नोट: ऊतक सुक्रोज समाधान में मशीन के बाद एक 15 मिलीलीटर ट्यूब के नीचे तक पहुंच जाना चाहिए । - फाइबर फिल्टर कागज का एक टुकड़ा के साथ शेष सुक्रोज समाधान भिगोने के बाद, एक डिस्पोजेबल प्लास्टिक मोल्ड में एक इष्टतम काटने तापमान (OCT) यौगिक में सेरिबैलम विसर्जित और सूखी बर्फ पर इसे फ्रीज । उपयोग करने तक क्रायोजेनिक ब्लॉक-८० डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है । - एक cryostat का उपयोग करते हुए मोटाई में 10 µm वाले अनुभागों में क्रायोजेनिक ब्लॉक काटें और उपयोग करने तक अनुभागों को-८० ° c पर रखें.
नोट: एक वर्गों में GFP अभिव्यक्ति की पुष्टि कर सकते हैं, बाहर पंजाबियों के साथ OCT यौगिक धोने के बाद ।
5. Immunostaining का Cryosections
- 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर स्लाइड शुष्क और पंजाब में 10 मिनट के लिए दो बार धो लो ।
- एक तरल अवरोधक कलम के साथ वर्गों सर्कल और एक अवरुद्ध समाधान में वर्गों की मशीन (10% ०.१% ट्राइटन-X100 युक्त पंजाब में सामांय गधा सीरम) 1 के लिए कमरे के तापमान पर एच ।
- ब्याज के अणुओं के खिलाफ प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें (जैसे, इस अध्ययन में GFP और चतुर्थ तोपोइसोमेरसे द्वितीय बीटा (Top2B)) अवरुद्ध समाधान में और 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
नोट: नाम और इस्तेमाल किया एंटीबॉडी की सांद्रता सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं । आदेश में GFP संकेतों को बढ़ाने के लिए, एक विरोधी GFP एंटीबॉडी वैकल्पिक रूप से अंय एंटीबॉडी के साथ एक साथ प्रयोग किया जा सकता है । - 10 मिनट के लिए ०.१% ट्राइटन-युक्त PBST 3x के साथ स्लाइड धो एक fluorophore-संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी युक्त अवरुद्ध समाधान DAPI में पतला के साथ कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए वर्गों की मशीन ।
- 10 मिनट के लिए पंजाब के 3x में स्लाइड धो स्लाइड माउंट और 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए इमेजिंग जब तक ।
नोट: प्रोटोकॉल यहां ठहराया जा सकता है ।
6. इमेजिंग और विश्लेषण
- छवि 20x आवर्धन पर एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कर वर्गों ।
- लक्ष्य प्रोटीन की अभिव्यक्ति खोने GFP सकारात्मक कोशिकाओं की संख्या की गणना । एक प्रतिनिधि छवि चित्रा बीमें दिखाया गया है ।
- GNPs में लक्ष्य जीन के पृथक पर आणविक phenotype की जाँच करें और12immuostaining द्वारा उनके जिन्न.
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Representative Results
vivo कार्यात्मक विश्लेषण में के लिए, यह कोशिकाओं में जो exogenous जीन (ओं) पेश किया गया है की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है । एक मार्कर की अभिव्यक्ति, जैसे गैर-proliferating कोशिकाओं में GFP का पालन किया जा सकता है समय की एक लंबी अवधि के लिए, संकेत क्रमिक रूप से proliferating कक्षों में खो जाता है । इस आशय का एक उदाहरण चित्रा 1में प्रदर्शित किया जाता है । LOF विश्लेषण में transfected कोशिकाओं के पदचिह्न खोने को दरकिनार, हम CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी के साथ electroporation आधारित जीन वितरण के संयोजन से एक उपंयास दृष्टिकोण विकसित की है ।
प्रतिनिधि परिणाम चित्रा 2में दिखाए जाते हैं. प्लाज्मिड constructs की कार्यक्षमता pU6-sgTop2b-Cbh-Cre और pCAG-EG-Top2b-FP17के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा परीक्षण किया जाता है, sgTop2b की कोशिकाओं में छुरा HEK293T (चित्रा 2a) व्यक्त SpCas9 लक्ष्य अनुक्रम, ले जाने । sgRNA-निर्देशित Cas9 endonuclease गतिविधि उत्प्रेरण DSB-मध्यस्थता समरूपता-EGFP अभिव्यक्ति कैसेट की मरम्मत का निर्देशन किया. इसलिए, sgRNA के समारोह सीधे GFP अभिव्यक्ति का पता लगाने के द्वारा विश्लेषण किया गया था । Mashiko एट अलके अनुसार, 30% से अधिक की एक अभिकर्मक क्षमता17प्रभावी रूप में एक sgRNA निर्धारित करता है ।
GNPs rhombic होंठ से उत्पंन (आर एल), एक भ्रूण के चरणों में चौथी निलय की छत की सीमा क्षेत्र e 16.5 तक 12.5 ई । इन कोशिकाओं बाहरी बाहरी दाना परत (oEGL) में जन्म के बाद बड़े पैमाने पर प्रसार से गुजरना और कोशिका चक्र20से बाहर निकलने के बाद भीतरी EGL (iEGL) में बदलाव करने के लिए जाना गया है । इस प्रकार, GNPs एक उचित उदाहरण के लिए हमारे आनुवंशिक लेबलिंग दृष्टिकोण के लाभों का परीक्षण कर रहे हैं ।
इस प्रोटोकॉल का पालन करके, GNPs के utero electroporation में GFP के साथ संपादित कोशिकाओं के अनुरेखण की अनुमति देता है । हमने pU6-sgRNA-Cbh-Cre प्लाज्मिड sgControl अनुमस्तिष्क- सीएजी-primordium- Rosa26-LSL-Cas9 चूहों भ्रूण चरण ई 13.5 में P2A व्यक्त किया । चूहों जन्मोत्तर दिन P7 पर बलिदान किया गया, और अनुमस्तिष्क ऊतक वर्गों के sagittal वर्गों immunohistochemistry द्वारा दाग थे । बाहरी और भीतरी EGL क्रमशः Ki67 अभिव्यक्ति (oEGL) और p27 अभिव्यक्ति (iEGL) द्वारा परिभाषित किए गए थे । प्रसार और परिपक्वता के दौर से गुजर के बावजूद, परिपक्व अनुमस्तिष्क granules ंयूरॉंस (CGNs) अभी भी मजबूत GFP अभिव्यक्ति (चित्रा बी) बनाए रखा ।
इस प्रोटोकॉल की उपयोगिता पर बल, हम इसके अलावा एक प्रतिनिधि उदाहरण के रूप में डीएनए Top2b लक्ष्यीकरण sgRNA इस्तेमाल किया । प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं के रूप में ऊपर वर्णित प्रदर्शन किया गया ( चित्रा बीदेखें) । Top2b के लिए sgRNAs के साथ transfected GFP-सकारात्मक कोशिकाओं के अधिकांश आंतरिक दाना परत (आईजीएल) में Top2b अभिव्यक्ति की हानि का प्रदर्शन किया, जबकि नियंत्रण sgRNAs की शुरूआत अपनी अभिव्यक्ति (चित्रा 2c) की स्पष्ट कमी में परिणाम नहीं था । इस परिणाम का एक ठहराव चित्रा 2dमें दिखाया गया है । इन आंकड़ों के विकास या ट्यूमर गठन के दौरान समय की एक लंबी अवधि के लिए संपादित कोशिकाओं अनुरेखण के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण मौजूद है ।
चित्र 1: proliferating और गैर-proliferating कक्षों में GFP व्यंजक का योजनाबद्ध प्रस्तुतिकरण. (क) जब एक exogenous जीन एंकोडिंग GFP (जैसे, pCAG-EGFP) गैर transfected कोशिकाओं में proliferating है, कोशिकाओं को एक लंबे समय (ऊपरी लेन) के लिए GFP व्यक्त कर सकते हैं । इस बीच, GFP अभिव्यक्ति exogenous GFP (मध्य लेन) के कमजोर पड़ने के कारण proliferating कोशिकाओं में गायब हो सकता है । इसके विपरीत, LoxP-स्टॉप-LoxP-GFP (LSL-GFP) transgene ले जाने वाले कक्ष GFP अभिकर्मक (लोअर लेन) के साथ Cre के बाद प्रसार के दौरान recombinase अभिव्यक्ति रख सकते हैं. (ख) एक sgRNA-सीएजी-अभिकर्मक-Rosa26-LSL-Cas9 माउस तनाव में Cre और P2A EGFP के बाद SpCas9-मध्यस्थता जीन मुंह बंद करने और GFP अभिव्यक्ति का सिद्धांत । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: इस प्रोटोकॉल से परिणाम के प्रतिनिधि छवियां । (क) HEK293T कोशिकाओं को छुरा व्यक्त SpCas9 pU6-sgTop2b-Cbh-Cre और pCAG-जैसे-Top2b-FP plasmids के साथ transfected थे. लाइव कोशिकाओं में GFP अभिव्यक्ति एक फ्लोरोसेंट सेल imager का उपयोग कर मॉनिटर किया गया था ( सामग्री की तालिकादेखें) ४८ अभिकर्मक के बाद एच । बाएँ और दाएँ पैनलों क्रमशः GFP अभिव्यक्ति पर आधारित एक प्रभावी और गैर-प्रभावी sgRNA अनुक्रम दिखाएँ । स्केल बार्स: १०० µm. (ख) GFP के Immunostaining, Ki67, और p27 पर एक P7 से cerebella- सीएजी-Rosa26- LSL-Cas9-P2A माउस के अधीन EGFP के अधीन ई 13.5 पर electroporation-pU6-sgRNA-Cbh Cre construction नियंत्रण प्लाज्मिड व्यक्त करता है. खंड DAPI (नीला) के साथ counterstained है । स्केल बार्स: ५० µm; 20x आवर्धन । नोट Ki67 द्वारा चिह्नित oEGL में GFP-expressिंग कक्ष । (ग) Immunostaining की GFP (हरी) और Top2b (रानी) पर P7 cerebella से एक Rosa26-सीएजी-LSL -Cas9-P2A-EGFP माउस कि ई 13.5 पर electroporated-pU6-sgRNA-Cbh Cre construction प्लाज्मिड के ख़िलाफ़ sgRNA (Top2b) और एक नियंत्रण अनुक्रम (sgControl) । तीर एक ही फ़ील्ड में GFP+ कक्षों में Top2b व्यंजक इंगित करते हैं. स्केल बार्स: 20 µm; 20x आवर्धन । (घ) sgControl और sgTop2b प्रयोगों में electroporated (GFP-positive) कोशिकाओं में Top2b का ठहराव. दो और तीन पिल्ले sgControl और sgTop2b के लिए जांच की, क्रमशः थे, और प्रत्येक मस्तिष्क से 25 कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया । त्रुटि पट्टियों मतलब (SEM) के ± मानक त्रुटि का प्रतिनिधित्व करते है और पी-मूल्यों के द्वारा गणना की गई ख़राब t-परीक्षण, *p = ०.०००२ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
| नाम | अनुक्रम | अनुप्रयोग | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA लक्ष्य अनुक्रम | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA लक्ष्य अनुक्रम | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA लक्ष्य अनुक्रम | |
| EGxxFP-Top2b-च | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | pCAG-EGxxFP में क्लोनिंग | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | pCAG-EGxxFP में क्लोनिंग | |
| hU6-च | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | sgRNA के लिए अनुक्रमण | |
तालिका 1: इस अध्ययन में उपयोग की जा रही ओलिगोस्पर्मिया का अनुक्रम ।
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Discussion
exo utero electroporation का प्रयोग, हम पहले सिरना की सूचना दी है-Atoh1 के एक प्रारंभिक चरण में vivo कार्यात्मक विश्लेषण में अनुमस्तिष्क granules सेल भेदभाव8के आधार पर । गर्भाशय की दीवार के बाहर भ्रूण के सिरना कमजोर पड़ने/क्षरण और जोखिम के कारण, electroporated granules कोशिकाओं के phenotypic विश्लेषण भ्रूण चरणों तक सीमित था । हालांकि, वर्तमान विधि जन्मोत्तर पशुओं के phenotype के विश्लेषण सक्षम होना चाहिए ।
हमारे पिछले अध्ययन का प्रदर्शन किया है कि Cas9- utero electroporation में सफलतापूर्वक medulloblastoma2प्रेरित के माध्यम से ट्यूमर शमन करनेवाला Ptch1 की मध्यस्थता पीटा । इसकी तुलना में, वर्तमान दृष्टिकोण दो प्रमुख लाभ दर्शाती है: 1) Cas9 के लिए प्लाज्मिड के साथ दिया नहीं है, कई जीन लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है एक ही प्लाज्मिड में कई sgRNA अभिव्यक्ति कैसेट ले जाने के बजाय; और 2) लक्ष्य कोशिकाओं और उनके जिन्न स्थायी रूप से GFP के साथ लेबल कर रहे हैं, लाइव कोशिकाओं के दृश्य को सक्षम करने और vivo मेंट्यूमर कोशिकाओं को बदलने के व्यवहार का विश्लेषण.
इस प्रोटोकॉल के सबसे महत्वपूर्ण कदम सही स्थान में प्लाज्मिड DNAs के उचित इंजेक्शन और मस्तिष्क में उपयुक्त स्थानों में बिजली की दालों की डिलीवरी कर रहे हैं । अनुमस्तिष्क न्यूरॉन्स एक जन्मतिथि-निर्भर तरीके से अनुमस्तिष्क neuroepithelium अनुक्रमिक से पैदा होते हैं. नहीं अनुमस्तिष्क primordium में कोशिकाओं के सभी प्रकार electroporation के माध्यम से लक्षित किया जा सकता है, क्योंकि केवल 12.5 ई पर एक विशिष्ट समय विंडो-14.5 तकनीकी रूप से संभव है । डीप अनुमस्तिष्क नाभिक न्यूरॉन्स और Purkinje कोशिकाओं ई 10.5-11.5 पर पैदा करने के लिए जाना जाता है, जब अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली पारदर्शी नहीं हैं, और भ्रूण डीएनए इंजेक्शन के लिए स्पष्ट रूप से दिखाई नहीं है. बाद में, एकध्रुवीय ब्रश कोशिकाओं ई 17.5 अपर आरएल (यूआरएल), जब चौथी निलय भी यूआरएल के आसपास के क्षेत्र में डीएनए की एक पर्याप्त राशि सुई संकीर्ण है से प्राप्त कर रहे हैं । इस प्रकार, हमारी विधि केवल 12.5 ई-14.5 पर लागू है, जो मुख्य रूप से मध्य और बाद में जंम progenitors, जैसे GNPs और निरोधात्मक न्यूरॉन्स के लक्ष्य । विधि का एक और दोष यह है कि एक पूर्ण नॉकआउट phenotype जब Cre/LoxP मध्यस्थता germline GEMMs की तुलना में संभव नहीं हो सकता है, केवल अनुमस्तिष्क कोशिकाओं के हजारों के बाद से प्रत्येक भ्रूण में electroporation द्वारा लक्षित किया जा सकता है ।
एक पहले अध्ययन में, लगभग ८०% GFP पॉजिटिव अनुमस्तिष्क दाना कोशिकाओं के लक्षित जीन12की अभिव्यक्ति खो दिया है । जबकि दाना कोशिकाओं की पहचान आणविक मार्करों और उनके वितरण की पुष्टि की थी, इस पहचान के दृष्टिकोण हमेशा लागू नहीं हो सकता है, के रूप में ब्याज की जीन मार्कर अभिव्यक्ति और ंयूरॉंस प्रवास में शामिल किया जा सकता है । एक सेल-विशिष्ट प्रमोटर का उपयोग कर Cre की सशर्त सक्रियण इस मामले में समस्या का समाधान होगा । अतः pU6-sgRNA-Cbh-Cre प्लाज्मिड में वर्तमान सर्वत्र Cbh प्रवर्तक को कोशिका-विशिष्ट प्रवर्तक के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है.
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
हम तकनीकी सहायता के लिए लौरा Sieber, अंना Neuerburg, Yassin हरिँ, और पेट्रा Schroeter की सराहना करते हैं । हम डीआरएस को भी धन्यवाद देते हैं । DKFZ में पशु प्रयोगों के लिए सहायक सहायता के लिए Reifenberg, के. डेल और पी Prückl; इमेजिंग कोर की सुविधाएं DKFZ और कार्ल जीस इमेजिंग केंद्र के DKFZ में फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए । यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था, 4472/1-1 KA (to डी.) ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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