Summary
Estudos convencionais de perda-de-função de genes usando animais nocaute foram frequentemente dispendioso e demorado. Baseado em Electroporation mutagênese mediada por CRISPR somática é uma ferramenta poderosa entender gene funciona em vivo. Aqui, nós relatamos um método para analisar os fenótipos de nocaute nas células em proliferação do cerebelo.
Abstract
Malformação do cérebro é frequentemente causada por mutações genéticas. Decifrar as mutações nos tecidos derivados de paciente identificou potenciais fatores causais das doenças. Para validar a contribuição de uma disfunção dos genes mutantes para o desenvolvimento da doença, a geração de modelos animais carregando as mutações é uma abordagem óbvia. Enquanto germline geneticamente modelos do rato (GEMMs) são populares ferramentas biológicas e apresentam resultados reprodutíveis, é restrito pelo tempo e custos. Entretanto, GEMMs não-germline frequentemente permitem explorar função do gene de uma forma mais viável. Desde o cérebro algumas doenças (por exemplo, tumores cerebrais) aparecem como resultado de somático mas não germline mutações, modelos de não-germline quimérico do rato, em que coexistem células normais e anormais, podem ser útil para análise de doenças relevantes. Neste estudo, nós relatamos um método para a indução de mutações somáticas CRISPR-mediada no cerebelo. Especificamente, utilizamos o condicionais bater-em camundongos, no qual Cas9 e GFP são cronicamente ativado pelo promotor CAG (CMV realçador/frango ß-actina) após Cre-mediada recombinação do genoma. O single-guia auto-concebidos RNAs (sgRNAs) e a sequência de recombinase Cre, ambos codificados em um plasmídeo único construto, foram entregues em células tronco/progenitoras cerebelar numa fase embrionária usando eletroporação no útero . Consequentemente, células transfectadas e suas células-filhas foram rotuladas com proteína verde fluorescente (GFP), facilitando ainda mais as análises fenotípicas. Portanto, este método é não só mostrando entrega baseada em electroporation gene em células embrionárias Cerebelares mas também propõe uma nova abordagem quantitativa para avaliar mediada por CRISPR fenótipos de perda-de-função.
Introduction
Doenças do cérebro são uma das mais terríveis doenças mortais. Muitas vezes resultam de mutações genéticas e desregulação subsequente. Para entender os mecanismos moleculares de doenças cerebrais, eterno esforços para decifrar os genomas dos pacientes humanos descobriram um número de genes causadores potenciais. Até agora, modelos animais germline geneticamente modificado têm sido utilizados para na vivo ganho-de-função (GOF) e perda de função (LOF) análises de tais genes candidatos. Devido ao acelerado desenvolvimento de estudos de validação funcional, um mais viável e flexível na vivo gene ensaio sistema para estudar a função dos genes é desejável.
A aplicação de um sistema de transferência de gene electroporation-baseado na vivo para o cérebro de rato em desenvolvimento é apropriada para esta finalidade. Na verdade, vários estudos utilizando no utero electroporation mostraram seu potencial para realizar análises funcionais no desenvolvimento cerebral1,2,3. Na verdade, várias regiões do cérebro do rato, tais como o córtex cerebral4retina5, diencéfalo6, rombencéfalo7, cerebelo8e medula espinhal9 têm sido alvo de entrega genética somática abordagens, até agora.
De fato, expressão do gene transitória por eletroporação na vivo no cérebro de rato embrionárias tem sido muito utilizado para análise GOF. Recentes tecnologias de integração de genômica transposon-baseado mais habilitado a longo prazo e/ou condicional a expressão de genes de interesse10,11, que é uma vantagem para dissecar a função dos genes de uma forma espacial e temporal durante desenvolvimento. Em contraste com a análise do GOF, análise LOF tem sido mais difícil. Enquanto transfection transiente de siRNAs e plasmideos shRNA de transporte realizou-se, a longo prazo efeitos de LOF dos genes não são garantidos devido à eventual degradação dos ácidos nucleicos exogenamente introduzidas, como plasmídeos e dsRNAs. No entanto, a tecnologia CRISPR/Cas fornece uma quebra-através de análises LOF. Genes que codificam proteínas fluorescentes (por exemplo, as boas práticas agrícolas) ou proteínas bioluminescentes (por exemplo, luciferase de vaga-lume) tem sido co transfected com CRISPR-Cas9 e sgRNAs para rotular as células expostas a mutações somáticas CRISPR-Cas9-mediada. No entanto, esta abordagem pode ter limitações em estudos funcionais em pilhas proliferating, desde genes marcadores exógenos são diluídos e degradados após proliferação a longo prazo. Enquanto as células transfectadas e suas células-filhas passam por mutações induzidas pelo CRISPR em seus genomas, suas pegadas podem se perder ao longo do tempo. Assim, abordagens genéticas de rotulagem seria adequadas para superar esse problema.
Recentemente desenvolvemos um método LOF CRISPR-baseado em células grânulo cerebelar que se submetem a proliferação de longo prazo durante sua diferenciação,12. Para rotular geneticamente as células transfectadas, temos construído um plasmídeo carregando um sgRNA juntamente com Cre e introduzido o plasmídeo a cerebella de Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP de ratos13 usando no utero electroporation. Ao contrário dos vetores de plasmídeo regular codificação EGFP, essa abordagem com êxito rotulado grânulo transfectado precursores do neurônio (PNB) e suas células-filhas. Este método fornece grande apoio na compreensão função in vivo de genes de interesse nas células em proliferação no desenvolvimento normal do cérebro e um fundo propensas a tumor.
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Protocol
Todos os experimentos com animais foram conduzidos de acordo com normas de bem-estar animal e tenham sido aprovados pelas autoridades responsáveis (Regierungspräsidium Karlsruhe, números de aprovação: G90/13 G176/13, 14/G32, G48/14 e G133/14).
1. gerar plasmídeos pU6-sgRNA-Cbh-Cre
- Desenha o sgRNA para o alvo de um gene de interesse de acordo com o protocolo anteriormente publicado14.
Nota: Neste experimento, dois sgRNAs são projetados para direcionar o gene Top2b de rato e um sgRNA de controle não específico (tabela 1). A nocaute genes usando a tecnologia CRISPR, sgRNAs precisa ser projetado para atingir ou a sequência da código da região 5' ou o domínio essencial funcional da proteína. Um ponto de partida conveniente é testar sequências sgRNA pre-projetados publicamente disponíveis, como o GeCKO v2 rato nocaute piscina biblioteca15 do laboratório Zhang. Alternativamente, sgRNAs pode ser projetado usando software público disponível, tais como o seguinte Web site: crispr.mit.edu. - Clone o sgRNAs no vetor pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
Nota: O vetor pU6-sgRNA-Cbh-Cre12 utilizado neste estudo é derivado do original de plasmídeo pX33016 , substituindo a sequência de código de SpCas9 com o Cre recombinase.- Dois DNA oligos sintetiza como segue. Sentido: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisentido: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Nota: A 20 N é mostrado acima stand para a sequência de sgRNA. - Digerir pU6-sgRNA-Cbh-Cre com BbsI por 30 min a 37 ° C, usando os seguintes reagentes, carregar a amostra digerida para um gel de agarose a 1% e purificá-los usando um kit de gel-extração. Uso 3 µ g plasmídeo; 3 µ l Bbseu; 1 µ l FastAP; 5 µ l 10 x buffer de digestão; Adicione ddH2O para trazer o volume total de 50 µ l.
- Fosforilar e recoze a cada par de oligos sgRNA usando os seguintes reagentes (volume total de 10 µ l): 1 µ l Customized sentido oligo (100 mM); 1 µ l personalizado antisentido oligo (100 mM); 1 µ l 10 x T4 ligadura Buffer; µ L 6.5 ddH2O; 0,5 Μ L T4 PNK. Incubar em um thermo-cycler por 30 min a 37 ° C e 5 min à 95 ° C e em seguida a rampa até 25 ° C a 5 ° C/min.
- Configurar a seguinte reação de ligadura e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente (volume total de 10 µ l): X µL Bbseu digerido do plasmídeo (50 ng); 1 µ l fosforilada e recozido, oligo duplex (diluição de 1: 200); 5 µ l 2 x buffer de ligadura; X µL ddH2O; Ligase rápida de 1 µ l.
- Adicione 2 µ l do produto ligadura em 50 µ l de células quimicamente competentes de DH5α Escherichia coli . Após 30 min de incubação no gelo, calor choque da amostra para 90 s a 42 ° C e incubar por 2 min no gelo. Adicione 100 µ l de meio LB e placa-lo em uma placa LB contendo 100 ampicilina µ g/mL.
Nota: A integração da sequência de sgRNA para o plasmídeo pU6-sgRNA-Cbh-Cre é realizada de acordo com as etapas de clonagem para a pX330 do plasmídeo14. - Inocular dois colônias, cada um em 2 mL de meio LB a 37 ° C por um período mínimo de 6 h e realizar um isolamento de DNA de mini-preparação usando um kit.
- Sanger sequenciar o DNA de prep mini usando o primer hU6-Forward e identificar colônias com a inserção correta de sgRNAs, alinhando com a sequência mostrada na etapa 1.2.1. A sequência da primeira demão é mostrada na tabela 1. Plasmídeos utilizados neste estudo foram nomeados pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre e pU6-sgControl-Cbh-Cre.
- Inocular colônias corretamente identificados e purificar o livre de endotoxinas plasmídeo para eletroporação no útero usando um kit, por exemplo, da Qiagen. Eluir o DNA com endotoxina livre TE-tampão diluído em ddH2O às 01:10 (reserva de 10% TE). A concentração de DNA do plasmídeo precisa ser superior a 2 mg/mL.
Nota: Não utilize um kit de maxi-prep regular para preparação de DNA. Loja do plasmídeo-soluções a 4 ° C para uso regular de curto prazo (até 4 semanas), ou alíquota um volume adequado de cerca de 25 µ l e manter a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.
- Dois DNA oligos sintetiza como segue. Sentido: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisentido: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. testar a eficiência do sgRNAs usando o sistema do plasmídeo EGxxFP
Nota: A eficiência do sgRNAs normalmente é testada pelo topógrafo ou T7E1 (T7 endonuclease eu) ensaios. Neste protocolo, é usada uma abordagem alternativa fácil e eficiente. A chave desta abordagem é usar o plasmídeo pCAG-EGxxFP, que contém fragmentos de EGFP sobrepostos, separados por uma sequência de DNA que contém o sgRNA segmentação local17. Sobre a expressão de pCAG-EGxxFP, juntamente com o sgRNA e Cas9 nas células transfectadas, a ruptura de mediada por Cas9 fita dupla (DSB) na sequência de destino é reparada por endógenos mecanismos dependentes de homologia, que reconstitui a expressão EGFP gaveta.
- Desenho de primers para amplificar a região genômica centralizada com o sgRNA como alvo sequências. O amplicon PCR é aproximadamente 500 bp. Neste experimento, aplicou-se um conjunto de DNA para clonar um fragmento amplificado por PCR para o plasmídeo pCAG-EGxxFP.
Nota: Como alternativa, sites de restrição apropriada podem ser adicionados à extremidade 5' dos primers PCR. Sites de restrição disponíveis no vetor pCAG-EGxxFP são BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI e EcoRV. - Amplifica o DNA genômico com primers projetados usando o formulário e PCR parâmetros abaixo. Carregar a amostra (19.7 µ l H2O; 0,3 µ l de 10 ng / µ l do mouse DNA genômico; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µ l 2 X mestre mistura PCR; volume total de 50 µ l) para um agarose 1% gel e gel-purificar os fragmentos PCR usando um kit de gel-extração. Use a seguinte reação condições: 95 ° C por 3 min; Então 35 x ciclos de 98 ° C por 20 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C durante 20 segundos e 72 ° C por 1 min; 4 ° C, por tempo indeterminado.
Nota: Neste experimento, uma região Top2b exon 1 foi amplificada; Encontre as sequências de cartilha na tabela 1. - Digerir o vetor de pCAG-EGxxFP com enzimas de restrição BamHI e EcoRI por 2 h a 37 ° C, em seguida carregar a amostra para um agarose 1% gel e gel-purificar a espinha dorsal de vetor usando um kit de gel-extração. Use os seguintes reagentes (volume total de 50 µ l): X µL plasmídeo (3 µ g); BamHI 2 µ l; 2 µ l EcoRI; 5 µ l 10 x Buffer; X µL ddH2O.
- Configurar o DNA montagem reação18 de acordo com as instruções do fabricante e transformar em DH5α competente Escherichia coli.
- Inocular duas colónias, cada em 2 mL de meio LB a 37 ° C por um período mínimo de 6 h, executar um isolamento de DNA de mini-preparação usando um kit, por exemplo, da Qiagen e identificar colônias com a inserção correta (doravante referida como pCAG-EG-Top2b-FP) usando Sanger sequenciando com o primer EGxxFP-Top2b-F.
- Transfect HEK293T células.
- Células de semente a HEK293T em uma placa de 24 24 h antes do transfection.
Nota: As células foram cultivadas em uma incubadora de célula de 37 ° C com 5% CO2, em DMEM com suplemento de glutamina contendo 10% FBS e 1% penicilina/estreptomicina. Certifique-se de que as células são 60% de confluencia no dia do transfection. Neste experimento, costumávamos self-made HEK293T células expressando estàvel SpCas9 para testar pU6-sgRNA-Cbh-Cre. No entanto, sua HEK293T células podem ser usadas se um vetor de expressão SpCas9 é fornecido. - Transfect as células HEK293T usando o reagente o polyethylenimine (PEI). Transfect as células com 120 ng/poço do plasmídeo pCAG-EG-Top2b-FP12 e 120 ng/poço de pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre ou pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre em uma placa de 24. Misture o DNAs plasmideo e o 1,8 µ l de reagente de PEI em 80 µ l de unsupplemented meio DMEM com glutamina suplemento e incube por 15 min à temperatura ambiente após a utilização do vortex.
- 6 h após o transfeccao, remover o meio e substitua por meio fresco.
- Monitore a presença de células vivas de GFP+ 48 h após a transfeccao usando um microscópio de fluorescência na ampliação de 20 x.
Nota: O número de células GFP+ indica a eficiência de direcionamento do sgRNA. Resultados da sgRNAs eficaz e não eficazes (sgTop2b-1 e sgTop2b-2, respectivamente) são mostrados na Figura 2A.
- Células de semente a HEK293T em uma placa de 24 24 h antes do transfection.
3. executar no Utero eletroporação
- 6 a 8 semanas os ratos se reproduzem e preparar as ferramentas para eletroporação no útero . Cruzar um macho homozigoto Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP ratos com ratos fêmeas CD-1. Tempo a gravidez dos ratos CD-1 desde o dia em que o plugue vaginal é detectado (E0.5). Os embriões são electroporated no dia E13.5.
- Puxe os capilares de vidro de borosilicato (diâmetro interno: 0.6-0.8 mm) com um puxador de micropipeta. Use as seguintes configurações: P = 500, calor = 560, Pull = 150, Vel = 75, tempo = 250. Rotule a ponta capilar com tinta preta, para melhor visualização durante a injeção. Aparar o atarraxamento capilar sob um estereomicroscópio usando uma régua e pinças de agulha em ponto e apare a ponta em um comprimento de cerca de 6 mm.
- Manter a unidade dos capilares para manter o experimento pode ser reproduzido. Crie uma borda chanfrada unilateral durante o corte. A ponta deveria ser mais nítida possível para fácil penetração da parede uterina e para evitar danos nos tecidos do embrião.
Nota: Como alternativa, use um micro moedor para ajustar um ângulo de 35°19. Os capilares podem ser armazenados à temperatura ambiente em um prato de Petri, sob condições isentos de agentes patogénicos de 10 cm. - Autoclave os instrumentos cirúrgicos.
- Misture os sgRNA-plasmídeos em partes iguais com Luc-pT2K-IRES a uma concentração final de pelo menos 1 µ g / µ l para cada cor e plasmídeo a plasmídeo-solução com verde rápido (concentração final de 0.05%). Prepare a solução-mãe 1% rápido verde com água destilada livre de endotoxinas e filtrar através de um filtro de 0,22 µm para remover partículas de corante da solução.
Nota: Transfection co de pT2K IRES-Luc é opcional, mas permite a identificação dos animais electroporated viável após o nascimento, utilizando imagens de bioluminescência. Por favor, consulte a etapa 3.5. Prepare uma quantidade suficiente de plasmídeo-mistura para o número total de ratos grávidas para ser operado. Use sobre 15-20 µ l misturar por rato (~ 12 embriões). Imediatamente com a cirurgia.
- Prepare os ratos para a cirurgia.
- ANESTHETIZE ratos CD-1 grávidas com isoflurano. Induzir a anestesia em uma caixa com 3-4% vol isoflurano (taxa de fluxo de oxigênio: 1,5 L/min) e mantê-lo com 2 vol-% durante a cirurgia através do cone de nariz.
Nota: A cirurgia completa não deve demorar mais do que 30 min. reduzir o número de injetado e electroporated embriões, se necessário. Use luvas esterilizadas para cirurgia. - Coloque o mouse sobre as costas de uma almofada de aquecimento e ajuste a anestesia.
- Injetar analgésico (Metamizol, 800 mg/kg peso de corpo, por via subcutânea (s.c.), depósito de 24 h).
Nota: Você pode usar outros analgésicos autorizados que Metamizol. - Aplica a pomada para evitar ressecamento do olho durante a cirurgia.
- Corrigir os membros com fita e esterilizar o abdômen com um desinfectante. Cobrir o mouse com gaze, deixando apenas a área cirúrgica exposta. Espalhe o etanol a 70% sobre gaze e área cirúrgica.
- Fazer uma incisão na pele de cerca de 2 cm de comprimento e alargar o fosso suavemente com tesoura cirúrgica reta. Localize o linea alba e fazer uma segunda incisão ligeiramente menor através do peritônio, utilizando tecido tesoura com ponta romba.
- Umedeça a cavidade abdominal aberta com 1 estéril pré-aquecido x PBS.
- Cuidadosamente, extrai os cornos uterinos da cavidade abdominal, usando pinça de anel. Puxe suavemente, agarrando a parede uterina unicamente na gap entre os sacos de gema dos dois embriões vizinhos. Evite qualquer pressão sobre o embrião enquanto puxa-lo através da incisão. Ampliar a incisão, se necessário e tome cuidado extra para posicionar os cornos uterinos no abdômen enquanto não comprimir o fluxo de sangue através da artéria uterina.
Nota: Em alguns casos, é aconselhável extrair um corno uterino de cada vez e substituí-lo antes de prosseguir com o segundo corno uterino.
- ANESTHETIZE ratos CD-1 grávidas com isoflurano. Induzir a anestesia em uma caixa com 3-4% vol isoflurano (taxa de fluxo de oxigênio: 1,5 L/min) e mantê-lo com 2 vol-% durante a cirurgia através do cone de nariz.
- Injeção e eletroporação de plasmídeo DNAs
- Aspire aproximadamente 15 µ l de plasmídeo-solução colorida com o capilar de vidro preparado. Evite quaisquer bolhas de ar durante este processo.
Nota: A solução do plasmídeo pode entupir a ponta facilmente se sua concentração for elevada. Teste capilar liberando alguns DNA antes da injeção. - Delicadamente segurar o embrião com pinça de anel e localizar a área do pescoço.
Nota: Se o embrião está em uma posição difícil injetar, ignorá-lo e ir para o embrião do próximo. Aumento de reposicionamento do embrião pode aumentar as chances de dano a eles. - Lentamente, perfurar com a ponta do capilar de vidro previamente preparado para o quarto ventrículo por penetrar o rombencéfalo dorsal e posteriormente injetar cerca de 1 µ l de mistura de plasmídeo. Confirme que o DNA tingido não é vazado do cérebro e é visível como um diamante em forma de estrutura.
Nota: Como opção, use 2.5-fold lupas para melhor visualização do quarto ventrículo e ao redor dos vasos sanguíneos. Entrega os impulsos elétricos imediatamente depois da injeção para evitar a difusão da plasmídeo-solução para os outros ventrículos. - Aplicar impulsos elétricos quadrados (5 pulsos, 32 mV, 50 ms-na, 950 ms-fora) com fórceps, como pinças de platina (ver Tabela de materiais). Coloque os eléctrodos lateralmente com o polo negativo, cobrindo a orelha e o polo positivo do primórdio cerebelar posicionados ao longo da parede uterina. Use placas de eletrodo 5 mm de diâmetro para eletroporação eficaz de embriões E13.5.
Nota: Aumente a taxa de sobrevivência dos filhotes manipulando a menos de 2/3rd do número total de embriões por barragem. Evite os embriões demasiado perto para o colo do útero. Se manipulado, eles podem causar complicações durante o parto e comprometer a ninhada inteira. Se os eletrodos são muito perto do coração do embrião, isto pode causar parada cardíaca.
- Aspire aproximadamente 15 µ l de plasmídeo-solução colorida com o capilar de vidro preparado. Evite quaisquer bolhas de ar durante este processo.
- Cuidados pós-electroporation e pós-operatório
- Coloque cuidadosamente os cornos uterinos volta na cavidade abdominal e preenchimento com pré aquecido estéril 1 x PBS. Deixe o slide de cornos uterinos em uma posição natural.
- Feche o peritônio e pele separadamente com uma sutura contínua simples.
Nota: Tome cuidado extra para não perfurar a parede uterina quando suturar o peritônio. - Encerramento da anestesia e coloque o animal de barriga para baixo numa jaula de nova.
- Monitore o animal durante a fase de vigília e novamente 24 h após a cirurgia. Coloque a gaiola sob uma lâmpada de aquecimento, se o tremor não melhora dentro de um tempo-frame de 15 min e o animal não inicia o aliciamento.
- Confirme o sucesso electroporation pela imagem latente do luciferase.
- Certifique-se que as barragens operadas cair embriões no tempo (na E19.5).
Nota: A data de nascimento pode ser adiada para o dia seguinte provavelmente por causa da operação. - Anestesiar os filhotes de electroporated (P5-P7) com 2,5% de isoflurano e injetar (intraperitoneal (i.p.)) com D-luciferina (3 mg/kg de peso corporal) 5 min antes da imagem latente.
- Detecta sinais de luciferase nos filhotes de electroporated usando o gerador de imagens de bioluminescência.
Nota: Um tempo de exposição de 1 min é suficiente para detectar o sinal de luciferase. Radiance (p/s/cm2/sr) é aproximadamente > 1 x 106.
- Certifique-se que as barragens operadas cair embriões no tempo (na E19.5).
4. prepare Cryosections de Cerebella a Electroporated
- Abater os filhotes de P7 electroporated e dissecar o cerebelo.
Nota: O sinal GFP pode ser observado usando um estereoscópio epifluorescente. - Corrigir o cerebella durante a noite em 5 mL por cérebro de 4% PFA em PBS a 4 ° C.
- Transferir o cerebella fixo durante a noite em 10 mL por cérebro de 30% de sacarose em PBS a 4 ° C.
Nota: O tecido deve atingir o fundo de um tubo de 15 mL após incubação na solução de sacarose. - Após absorver o restante da solução de sacarose com um pedaço de papel de filtro de celulose, mergulhe o cerebelo em uma temperatura de corte ideal (OCT) composta em um molde de plástico descartável e congelá-lo em gelo seco. O bloco criogênico pode ser armazenado a-80 ° C até o uso.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui. - Corte o bloco criogênico em seções com 10 µm de espessura, usando um criostato e manter as secções a-80 ° C até o uso.
Nota: Um pode confirmar a expressão de GFP nas seções, depois de lavar a OCT composto com PBS.
5. imunocoloração da Cryosections
- Seca as lâminas no room temperature por 30 min e lave duas vezes por 10 min em PBS.
- Circule as seções com uma caneta de bloqueador líquido e incubar as seções em uma solução de bloqueio (10% de soro normal burro em PBS contendo 0,1% Triton-X100) por 1h à temperatura ambiente.
- Acrescente os anticorpos primários contra as moléculas de interesse (por exemplo, as boas práticas agrícolas e topoisomerase II beta (Top2B) neste estudo) na solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4 ° C.
Nota: Os nomes e as concentrações de anticorpos utilizados estão listadas na Tabela de materiais. Para melhorar os sinais GFP, um anticorpo anti-GFP opcionalmente pode ser usado juntamente com os outros anticorpos. - Lave os slides com 0.1% contendo Triton PBST 3 X 10 min. Incubar as secções por 1h à temperatura ambiente com um anticorpo secundário conjugado fluoróforo diluído na solução de bloqueio contendo DAPI.
- Lavar as lâminas em PBS 3 X 10 min. Monte os slides e manter a 4 ° C até a imagem.
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
6. geração de imagens e análise
- As seções usando um microscópio confocal, ampliação de 20 x da imagem.
- Conte o número de células positivas GFP, perdendo a expressão da proteína alvo. Uma imagem representativa é mostrada na Figura 2B.
- Verifique se o fenótipo molecular após ablação do gene-alvo no PNB e suas progênies immuostaining12.
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Representative Results
Na vivo análise funcional, é fundamental para identificar as células em que foram introduzidos genes exógenos. Enquanto a expressão de um marcador, como o GFP na não-proliferação de células pode ser acompanhados por um longo período de tempo, o sinal se perde sequencialmente nas células em proliferação. Uma ilustração deste efeito é demonstrada na Figura 1. Para contornar a perder a pegada de células transfectadas em análises LOF, desenvolvemos uma nova abordagem combinando a entrega do gene electroporation-baseado com a tecnologia CRISPR/Cas9.
Resultados representativos são mostrados na Figura 2. Funcionalidade das construções de plasmídeo é testada por transfecção transiente de pU6-sgTop2b-Cbh-Cre e pCAG-EG-Top2b-FP17, carregando a sequência do alvo de sgTop2b, em HEK293T células expressando estàvel SpCas9 (Figura 2A). A atividade de endonuclease Cas9 sgRNA guiada induz mediada por ORL reparação homologia-dirigido da fita expressão EGFP. Portanto, a função do sgRNA diretamente foi analisada pela detecção da expressão de GFP. De acordo com Mashiko et al, uma eficiência de Transfeccao de mais de 30% determina um sgRNA como eficaz17.
PNB originam o lábio rômbico (RL), uma região na fronteira com o teto do quarto ventrículo em estágios embrionários E12.5 até E16.5. Estas células foram conhecidas para se submeter a proliferação maciça após o nascimento na camada exterior do grânulo externo (oEGL) e mudança para o interior EGL (iEGL) depois de sair do ciclo celular20. Assim, o PNB são um exemplo adequado para testar as vantagens da nossa abordagem genética de rotulagem.
Seguindo este protocolo, no utero electroporation PNB de permite rastreamento de células editadas com GFP. Introduzimos o plasmídeo pU6-sgRNA-Cbh-Cre expressando sgControl no Primórdio cerebelar de ratos Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP em fase embrionária, E13.5. Os ratos foram sacrificados no dia pós-natal P7, e secções sagitais de seções do tecido cerebelar foram coradas por imuno-histoquímica. EGL interior e exterior foram definidos pela expressão de Ki67 (oEGL) e p27 (iEGL), respectivamente. Apesar de sofrer proliferação e maturação, neurônios maduros grânulo cerebelar (CGNs) ainda manteve forte expressão de GFP (Figura 2B).
Enfatizando a utilidade do presente protocolo, além disso usamos a sgRNA DNA Top2b como um exemplo representativo de direcionamento. Procedimentos experimentais foram realizados conforme descrito anteriormente (ver Figura 2B). A maioria das células GFP-positivo transfectadas com sgRNAs para Top2b exibiu uma perda de expressão Top2b na camada interna do grânulo (IGL), enquanto a introdução de controle sgRNAs não resultou em redução clara de sua expressão (Figura 2). Uma quantificação deste resultado é mostrada na Figura 2D. Estes dados apresentam uma ferramenta valiosa para rastrear as células editadas por um longo período de tempo durante a formação do desenvolvimento ou tumor.
Figura 1: representação esquemática da expressão de GFP em células de proliferação e de não-proliferação. (A) quando um gene exógeno que codificação GFP (por exemplo, pCAG-EGFP) é transfectadas na não-proliferação de células, as células pode expressar GFP por um longo tempo (faixa superior). Entretanto, a expressão de GFP poderia desaparecer nas células em proliferação devido à diluição de exógenos GFP (faixa média). Em contraste, as células que carregam o transgene LoxP-Stop-LoxP-GFP (LSL-GFP) podem manter a expressão de GFP durante a proliferação depois do transfection com Cre recombinase (faixa inferior). Cepa de rato (B) o princípio de silenciamento de genes mediada por SpCas9 e expressão de GFP após a transfeccao Cre e sgRNA em um Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: imagens representativas dos resultados do presente protocolo. (A) HEK293T celulas que expressam estàvel SpCas9 foram transfectadas com plasmídeos pU6-sgTop2b-Cbh-Cre e pCAG-EG-Top2b-FP. Expressão de GFP em células vivas foi monitorada usando um gerador de imagens de células fluorescentes (ver Tabela de materiais) 48 h depois do transfection. Painéis esquerdos e direito mostram uma sequência de sgRNA eficaz e não eficazes com base na expressão de GFP, respectivamente. Barras de escala: 100 µm. (B) imunocoloração de GFP e Ki67 p27 sobre o P7 cerebella de um Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP rato submetido a eletroporação no E13.5 com construções pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmídeo expressando o controle sgRNA. A seção é counterstained com DAPI (azul). Barras de escala: 50 µm; ampliação de 20 x. Observação de células GFP-expressando a oEGL marcada por Ki67. (C) imunocoloração de GFP (verde) e Top2b (magenta) sobre o P7 cerebella de um rato Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP que foi electroporated no E13.5 com pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmídeo constrói expressando sgRNA contra Top2b (sgTop2b) e um sequência de controle (sgControl). As setas indicam Top2b expressão em células GFP+ no mesmo campo. Barras de escala: 20 µm; ampliação de 20 x. (D) quantificação de Top2b em células de electroporated (GFP-positivo) em experimentos de sgControl e sgTop2b. Dois e três filhotes foram investigados para sgControl e sgTop2b, respectivamente, e foram analisadas 25 células de cada cérebro. Barras de erro representam ± erro padrão da média (SEM) e p-valores foram calculados por unpaired t-teste, *p = 0,0002. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome | Sequência de | Aplicação | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sequência de destino sgRNA | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sequência de destino sgRNA | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sequência de destino sgRNA | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Clonagem em pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Clonagem em pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Sequenciamento de sgRNA | |
Tabela 1: Sequências de oligos sendo usados neste estudo.
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Discussion
Usando o exo utero electroporation, anteriormente informamos siRNA-baseado na vivo funcional análises de Atoh1 numa fase precoce do grânulo cerebelar celular diferenciação8. Devido à diluição de siRNA/degradação e exposição de embriões fora da parede uterina, análise fenotípica das células grânulo electroporated limitou-se a estágios embrionários. No entanto, o método atual habilitado para análise do fenótipo dos animais pós-natal.
Nosso estudo anterior demonstrou que nocaute Cas9-mediada do supressor do tumor Ptch1 via no utero medulloblastoma electroporation induzido com sucesso2. Em comparação, a abordagem atual apresenta duas vantagens principais: 1) Cas9 não tem que ser entregue com o plasmídeo, que permite ter vários genes carregando várias fitas de expressão sgRNA em um único plasmídeo; e 2) as células-alvo e suas progênies permanentemente são rotulados com as boas práticas agrícolas, permitindo a visualização das células vivas e análise do comportamento da transformação de tumor de células in vivo.
Os passos mais críticos do presente protocolo são a injeção adequada do plasmídeo DNAs no local correto e a entrega dos impulsos elétricos para os locais apropriados no cérebro. Cerebelares neurônios nascem do neuroepithelium cerebelar sequencialmente em uma maneira dependente da data de nascimento. Nem todos os tipos de células do primórdio cerebelar podem ser direcionados através de eletroporação, porque apenas uma janela de tempo específica E12.5-14,5 é tecnicamente viável. Núcleos profundos Cerebelares neurônios e células de Purkinje são sabidas que surgem no E10.5-11.5, quando as membranas extra embrionárias não são transparentes, e o embrião não é claramente visível para injeção de DNA. Mais tarde, escova unipolar células são derivadas de E17.5 superior RL (uRL), quando o quarto ventrículo é muito estreito para injetar uma quantidade suficiente de DNA nas imediações do uRL. Assim, nosso método é aplicável apenas às E12.5-14,5, que visa principalmente progenitores meados - e mais tarde-nascido, como o PNB e interneurônios inibitórios. Outra desvantagem do método é que um fenótipo de nocaute completo pode não ser viável quando comparado a germline Cre/LoxP-mediada GEMMs, uma vez que apenas milhares de células Cerebelares podem ser direcionados por eletroporação em cada embrião.
Em um estudo anterior, cerca de 80% do grânulo cerebelar GFP-positivo células perdido a expressão do gene alvo12. Enquanto a identidade das células grânulo foi confirmada por marcadores moleculares e sua distribuição, esta abordagem de identificação pode não ser sempre aplicável, como genes de interesse podem estar envolvidos na expressão do marcador e migração neuronal. Ativação condicional de Cre usando um promotor específico células resolveria o problema neste caso. Portanto, o atual promotor Cbh onipresente no plasmídeo pU6-sgRNA-Cbh-Cre pode ser substituído por um promotor de célula específico.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos a Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim e Petra Schroeter para assistência técnica. Agradecemos também os Drs K. Reifenberg, K. Dell e P. Prückl de assistência úteis para experiências com animais em DKFZ; o Imaging Core instalações da DKFZ e centro de imagiologia de Carl Zeiss no DKFZ para a imagem latente de microscopia confocal. Este trabalho foi apoiado pela Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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