Summary
Geleneksel işlev kaybı çalışmalar nakavt hayvanlar kullanarak genlerin kez pahalı ve zaman alıcı olmuştur. Somatik mutagenesis CRISPR-aracılı Elektroporasyon tabanlı gen içinde vivoişlevleri anlamak için güçlü bir araçtır. Burada, nakavt fenotipleri beyincik Proliferasyona hücrelerdeki analiz etmek için bir yöntem raporu.
Abstract
Beyin malformasyonu kez tarafından genetik mutasyonlar neden olur. Hasta elde edilen dokular mutasyonların deşifre olası etken faktörleri hastalıkları tespit etti. İşlev bozukluğu hastalığı geliştirme mutasyona uğramış genler katkısını doğrulamak için mutasyon taşıyan hayvan modellerin üretimi bir açık yaklaşım. Genetik olarak germline iken fare modelleri (GEMMs) popüler biyolojik araçlardır ve tekrarlanabilir sonuçlar sergi, zaman ve maliyeti ile sınırlıdır. Bu arada, Sigara germline GEMMs kez daha uygun bir şekilde keşfetmek gen işlevini etkinleştirin. Bazı beyin beri hastalıklar (Örn, beyin tümörleri) üzerinden somatik neden gibi görünüyor ama değil germline mutasyonlar, Sigara germline chimeric fare modelleri, hangi normal ve anormal hücreleri bir arada, hastalık ilgili analiz için yararlı olabilir. Bu çalışmada, beyincik bedensel mutasyonlar CRISPR-aracılı indüksiyon için bir yöntemi bildirin. Özellikle, hangi Cas9 ve GFP kronik aktif CAG (CMV artırıcı/tavuk β-aktin) düzenleyici tarafından Cresonra koşullu çakma fareler, kullanılan-aracılı rekombinasyon genom kopyası. Kendini tasarlanmış tek-Kılavuzu RNA'ların (sgRNAs) ve Cre recombinase sıra, hem bir tek plazmid yapı kodlanmış serebellar kök/progenitor hücre içine rahim içinde Elektroporasyon kullanarak bir embriyonik aşamada teslim edildi. Sonuç olarak, transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri böylece daha fazla fenotipik analizleri kolaylaştırmak yeşil flüoresan protein ile (GFP), etiketli. Bu nedenle, bu yöntem sadece Elektroporasyon tabanlı gen teslim embriyonik serebellar hücrelere gösterilen ama ayrıca CRISPR-aracılı işlev kaybı fenotipleri değerlendirmek için yeni bir kantitatif yaklaşım öneriyor.
Introduction
Beyin hastalıkları en korkunç ölümcül hastalıklardan biri vardır. Onlar genellikle genetik mutasyonlar ve sonraki bozukluk sonucu. Moleküler mekanizmalar beyin hastalıkları anlamak için şimdiye kadar süren çabaları insan hasta genleri deşifre için potansiyel sorumlu genlerin bir dizi keşfettim. Şimdiye kadar genetik olarak germline hayvan modelleri vivo içinde kazanç--fonksiyonu (GOF) ve işlev kaybı (LOF) analizleri gibi aday gen için kullanılan. Fonksiyonel doğrulama çalışmaları hızlandırılmış gelişimi nedeniyle, gen işlevi okuyan bir daha uygun ve esnek vivo içinde gen tahlil arzu edilen sistemdir.
Vivo Elektroporasyon tabanlı gen aktarım sistemi uygulamaya gelişmekte olan fare beyin bu amaç için uygundur. Aslında, rahim içinde Elektroporasyon kullanarak çeşitli çalışmalar gelişmekte olan beyin1,2,3fonksiyonel analizler yapmak için potansiyel göstermiştir. Aslında, fare beynin korteksinin4, retina5, diencephalon6, arka beyin7, beyincik8ve spinal kord9 gibi birden fazla bölge somatik gen teslim tarafından hedef almış yaklaşımlar, öylesine uzakta.
Nitekim, geçici gen ekspresyonu vivo içinde Elektroporasyon embriyonik fare beyin üzerinde tarafından uzun GOF analiz için kullanılmıştır. Son transposon dayalı genomik tümleştirme teknolojileri daha fazla gen işlevi sırasında kayma ve zamansal bir şekilde incelemek için avantajlı olan uzun vadeli ve/veya koşullu ifade faiz10,11, genlerin etkin geliştirme. GOF Analizi aksine, LOF analiz daha zor oldu. Çift ve shRNA taşıyan plazmidlerin geçici transfection gerçekleştirildi iken, genlerin LOF uzun vadeli etkileri plazmit ve dsRNAs gibi exogenously tanıttı nükleik asitleri nihai bozulması nedeniyle garanti edilmez. Ancak, LOF analizlerde aracılığıyla bir ara CRISPR/CA teknolojisi sağlar. Floresan proteinler (Örneğin, GFP) veya kollarındaki proteinler (Örneğin, ateş böceği luciferase) kodlama genler ile CRISPR-Cas9 ve sgRNAs CRISPR-Cas9-aracılı somatik mutasyon maruz hücreleri etiketlemek için ortak transfected. Eksojen marker gen seyreltilmiş ve uzun vadeli yayılması sonra bozulmuş beri bununla birlikte, bu yaklaşım sınırlamalar fonksiyonel çalışmalar Proliferasyona hücreleri üzerinde olabilir. Transfected hücreleri ve onların kızı hücreleri onların genleri CRISPR kaynaklı mutasyonların tabi iken, onların ayak izleri zamanla kayıp alabilirsiniz. Böylece, genetik etiketleme yaklaşımlar bu sorunu aşmak için uygun olacak.
Son zamanlarda onların farklılaşma12sırasında uzun vadeli yayılması geçmesi serebellar granül hücre CRISPR tabanlı LOF yönteminde geliştirdik. Transfected hücrelerin genetik olarak etiketlemek için bir sgRNA Cre ile birlikte taşıyan bir plazmid inşa ve plazmid rahim içinde Elektroporasyon kullanarak Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP fareler13 cerebella tanıttı. EGFP kodlama düzenli plazmid vektörel çizimler bu yaklaşım başarıyla nöron öncüleri (GNPs) transfected granül etiketli ve onların kızı hücreleri. Bu yöntem vivo içinde işlev ilgi normal beyin gelişimi ve tümör eğilimli bir arka plan Proliferasyona hücrelerinde genlerin anlamada büyük destek sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri hayvan refahı düzenlemelere göre yapılmıştır ve sorumlu yetkilileri tarafından onaylanmıştır (Regierungspräsidium Karlsruhe, onay numaraları: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 ve G133/14).
1. pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid oluşturmak
- Gen--ilgi çekici bir daha önce yayımlanmış Protokolü14göre hedefe sgRNA tasarım.
Not: Bu deneyde iki sgRNAs fare Top2b gen ve bir sigara hedefli kontrol sgRNA (Tablo 1) hedeflemek için tasarlanmıştır. CRISPR teknolojisini kullanarak nakavt gene(s) için sgRNAs 5' bölgesinin kodlama dizisi ya da protein temel işlev etki alanı hedef için tasarlanmış olması gerekir. Bir uygun başlangıç noktası GeCKO v2 fare nakavt havuzu Kütüphane15 Zhang laboratuvar gibi kamuya önceden tasarlanmış sgRNA dizileri test etmektir. Alternatif olarak, sgRNAs aşağıdaki Web sitesi gibi kamu mevcut yazılım kullanarak dizayn edilebilir: crispr.mit.edu. - SgRNAs pU6-sgRNA-Cbh-Cre vektör kopyalayın.
Not: Bu çalışmada kullanılan pU6-sgRNA-Cbh-Cre vektör12 SpCas9 kodlama dizisi ile Cre recombinase yanında eski yerine koymak orijinal pX330 plazmid16 türetilmiştir.- İki DNA oligos aşağıdaki gibi sentez. Anlamı: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisens: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Not: 20 N stand sgRNA sırası için yukarıda gösterdi. - PU6-sgRNA-Cbh-Cre BbsI ile aşağıdaki reaktifler kullanarak 37 ° C'de 30 dk için sindirmek, sindirilmiş örnek % 1'özel jel için yük ve bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak onları arındırmak. 3 µg plazmid kullanın; 3 µL Bbsben; 1 µL FastAP; Sindirim arabellek x 5 µL 10; Toplam hacim için 50 µL getirmek için GKD2O ekleyin.
- Fazdan ve her çifti aşağıdaki reaktifleri (10 µL toplam hacim) kullanarak sgRNA oligos tavlamak: 1 µL özelleştirilmiş anlamda oligo (100 mM); 1 µL özelleştirilmiş antianlamlı oligo (100 mM); T4 ligasyonu arabellek x 1 µL 10; 6.5 µL GKD2O; 0.5 ΜL T4 PNK. Bir termo-cycler 37 ° C'de 30 dk için kuluçkaya ve 95 ° C ve 25 ° C 5 ° C/dk aşağı rampa 5 dak.
- Aşağıdaki ligasyonu tepki kadar ayarlayın ve oda sıcaklığında (10 µL toplam hacim) 10 min için kuluçkaya: plazmid sindirilmiş X µL Bbs(50 ng); 1 µL fosforile ve tavlanmış, oligo Dubleks (1: 200 seyreltme); Tüp ligasyonu arabellek x 5 µL 2; x µl GKD2O; 1 µL hızlı ligaz.
- Tüp ligasyonu ürünün 2 µL kimyasal olarak yetkili DH5α Escherichia coli hücreleri 50 µL ekleyin. Kuluçka buz üzerinde 30 dk sonra ısı şok 90 için örnek s 42 ° C'de ve buz üzerinde 2 min için kuluçkaya. LB orta 100 µL ekleyin ve 100 µg/mL ampisilin içeren bir LB tabağa plakası.
Not: PU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid içine sgRNA sıra entegrasyonu pX330 plazmid14için klonlama adımları göre gerçekleştirilir. - Her 2 ml LB orta 37 ° c 6 h, en az iki kolonileri aşılamak ve bir mini hazırlık DNA izolasyon bir seti kullanarak gerçekleştirebilirsiniz.
- Sanger hU6 ileri astar kullanarak mini hazırlık DNA dizisi ve koloniler sgRNAs doğru yerleştirilmesi ile 1.2.1 adımda gösterilen sıra ile hizalayarak tanımlar. Astar sıra Tablo 1' de gösterilen. Bu çalışmada kullanılan plazmid olarak pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre ve pU6-sgControl-Cbh-Cre seçilmiştir.
- Doğru tespit kolonileri aşılamak ve rahim içinde çoğalmasıyla bir kit, Örneğin, QIAGEN üzerinden kullanarak için endotoksin-Alerjik plazmid DNA arındırmak. DNA endotoksin-Alerjik TE-GKD2içinde O 1:10 (% 10 TE arabellek) seyreltilmiş arabellek ile elute. Plazmid DNA konsantrasyon 2 mg/mL yüksek olması gerekir.
Not: normal bir maxi-hazırlık seti DNA hazırlık için kullanmayın. Plazmid-çözümleri için kısa süreli kullanım (4 hafta) veya aliquot 4 ° C'de yaklaşık 25 µL uygun bir hacmi depolamak ve uzun süreli depolama için-20 ° C'de tutun.
- İki DNA oligos aşağıdaki gibi sentez. Anlamı: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisens: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. EGxxFP plazmid sistemi kullanarak sgRNAs etkinliğini test
Not: SgRNAs verimliliğini normalde Surveyor veya T7E1 tarafından test edilmiştir (T7 endonükleaz ben) deneyleri. Bu protokol için kolay ve verimli alternatif bir yaklaşım kullanılır. Bu yaklaşımın anahtar sitesi17hedefleme sgRNA içeren bir DNA dizisi tarafından ayrılmış örtüşen EGFP parçaları içeren pCAG-EGxxFP plazmid kullanmaktır. PCAG-EGxxFP ile birlikte sgRNA ve Cas9 transfected hücrelerdeki ifadesi, hangi EGFP ifade reconstitutes Çift Kişilik strand Cas9-aracılı ara (DSB) hedef ile endojen Homoloji-bağımlı mekanizmaları tarafından onarıldı kaset.
- Astar sgRNA dizileri hedefleme merkezli genomik bölge yükseltmek için tasarım. PCR amplicon yaklaşık 500 olduğunu bp. Bu deneyde, bir DNA derleme PCR güçlendirilmiş bir parçası pCAG-EGxxFP plazmid clone uygulandı.
Not: Alternatif olarak, 5' sonu PCR astar için uygun kısıtlama siteleri eklenebilir. Kullanılabilir kısıtlama pCAG-EGxxFP vektör BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI ve EcoRV sitelerdir. - Genomik DNA PCR parametreleri aşağıdaki ve formu kullanarak tasarlanmış astar ile yükseltmek. Örnek yük (19,7 µL H2O; 0.3 10 µL ng/µL fare genomik DNA; 2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2.5 µL 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µL PCR ana mix X 2; 50 µL toplam hacim) % 1'özel üzerine jel ve jel bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak PCR parçaları arındırmak. Aşağıdaki reaksiyon koşulları: 95 ° C 3 dakikadır kullanın; o zaman 35 x devredir 98 ° c 20 s, 60 ° C 15 s, 72 ° C 20 s ve 72 ° C için 1 dk; 4 ° C, süresiz olarak.
Not: Bu deneyde, bir bölgede Top2b exon 1 güçlendirilmiş; Tablo 1' de astar dizileri bulamadı. - BamHI ve örnek % 1'özel üzerine yük EcoRI sonra 37 ° c 2 h enzimleri ile pCAG-EGxxFP vektör jel ve jel bir jel-ekstraksiyon kiti kullanarak vektör omurga arındırmak Digest. Aşağıdaki reaktifleri (50 µL toplam hacim) kullanın: X µL plazmid (3 µg); 2 µL BamHI; 2 µL EcoRI; 5 µL 10 x arabellek; x µl GKD2O.
- Üreticinin yönergelerine göre DNA derleme tepki18 ayarlayın ve DH5α yetkili E. colidönüşümü.
- İki kolonileri aşılamak, içinde her 2 mL LB orta 37 ° c 6 h, en az bir kit, Örneğin, QIAGEN, üzerinden kullanarak bir mini hazırlık DNA yalıtım yapmak ve doğru ekleme (bundan sonra pCAG-örneğin-Top2b-FP anılacaktır) ile kolonileri belirlemek Sanger kullanarak EGxxFP-Top2b-F astar ile sıralama.
- HEK293T hücre transfect.
- Tohum HEK293T hücrelere bir 24-şey plaka transfection önce 24 saat.
Not: Hücreleri 37 ° C hücre kuluçka makinesine ile % 5 CO2, DMEM içinde glutamine ek %10 FBS ve % 1'i içeren kültürlü penisilin/streptomisin. Hücreleri transfection gününde % 60 birleşmesi olduğundan emin olun. Bu deneyde, pU6-sgRNA-Cbh-Cre sınamak için stabil SpCas9 ifade kendi kendine yapılan HEK293T hücreleri kullanılır. Ancak, wildtype HEK293T hücreleri bir SpCas9 ifade vektör varsa kullanılabilir. - Polyethylenimine (PEI) reaktif kullanarak HEK293T hücre transfect. 120 ng/iyi pCAG-örneğin-Top2b-FP plazmid12 hücrelerle ve 120 ng/iyi pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre veya pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre bir 24-şey plaka transfect. Plazmid DNA'lar mix ve glutamin ile unsupplemented DMEM orta 80 µL PEI reaktif 1.8 µL ek ve oda sıcaklığında 15 dakika sonra vortexing kuluçkaya.
- 6 h transfection sonra orta kaldırın ve taze orta ile değiştirin.
- 20 x büyütme oranında bir floresan mikroskop kullanarak transfection sonra canlı GFP+ hücreleri 48 h varlığı izlemek.
Not: SgRNA hedefleme verimliliğini GFP+ hücre sayısını gösterir. Etkin ve etkili-sgRNAs sonuçlarını (sgTop2b-1 ve sgTop2b-2, sırasıyla) Şekil 2Agösterilir.
- Tohum HEK293T hücrelere bir 24-şey plaka transfection önce 24 saat.
3. rahim içinde Elektroporasyon gerçekleştirmek
- 6-8-hafta-yaşlı fareler doğurmak ve araçları rahim içinde adım için hazır olun. Erkek homozigoz Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP çapraz kadın CD-1 fareler ile fareler. (E0.5) CD-1 fareler vajinal fişi günden itibaren gebelik algılanan süresi. Embriyo electroporated gün E13.5 vardır.
- Borosilikat cam kılcal çekin (iç çapı: 0,6-0,8 mm) ile bir micropipette çektirmenin. Aşağıdaki ayarları kullanın: P = 500, ısı 560, çekme = 150, Vel = = 75, saat = 250. Kapiller ucu enjeksiyon sırasında daha iyi görselleştirme için siyah mürekkep ile etiketleyin. Kapiller konik bir cetvel kullanarak bir stereomicroscope altında döşeme ve iğne cımbız keskin ve yaklaşık 6 mm uzunluğunda ucunda trim.
- Deneme tekrarlanabilir tutmak için kılcal birlik korumak. Tek taraflı eğimli kenarı bölünmesi sırasında oluşturun. Ucunu kolay nüfuz rahim duvarı ve embriyo doku hasarı önlemek için mümkün olduğunca gibi keskin olmalıdır.
Not: Alternatif olarak, bir 35 ° açı19ayarlamak için bir mikro öğütücü kullanın. Kılcal 10 cm Petri kabına patojen-Alerjik koşullar altında oda sıcaklığında muhafaza edilebilir. - Otoklav cerrahi aletler.
- SgRNA-plazmid eşit parçaya pT2K-IRES-Luc için en az 1 µg/µL her plazmid ve renk için son bir konsantrasyon ile plazmid çözüm hızlı yeşil (son konsantrasyonu % 0.05) ile karıştırın. Distile su endotoksin-alerjik ve filtre ile hisse senedi çözüm %1 hızlı yeşil boya parçacıkları çözümden kaldırmak için 0,22 µm filtresi ile hazır olun.
Not: Co transfection pT2K IRES-Luc isteğe bağlıdır ancak bioluminescence Imaging'i kullanma doğumdan sonra uygun electroporated hayvanların tanımlanması için sağlar. Adım 3.5 bakınız. Plazmid-mix yeterli miktarda ameliyat olmak için hamile fareler toplam sayısı için hazırlayın. Hakkında kullanın fare 15-20 µL mix (~ 12 embriyo). Hemen ameliyat ile devam edin.
- Fareler ameliyat için hazırlayın.
- Hamile CD-1 fareler isoflurane ile anestezi. Anestezi kutusundaki metinle 3-4 vol % isoflurane teşvik (oksijen akış hızı: 1, 5 L/dak) ve burun konisi ile ameliyat sırasında 2 vol-% ile sürdürmek.
Not: Tam cerrahi uzun almamalıdır 30 dk. azaltmak sayısından enjekte ve electroporated embriyo, gerekirse. Steril eldiven ameliyat için kullanın. - Sırtında bir Isıtma yastık üzerinde fareyi getirin ve anestezi ayarlayın.
- Analjezik enjekte (Metamizol, 800 mg/kg vücut ağırlığı, subkutan (SC), 24 h depo).
Not: Diğer yetkili analjezikler Metamizol daha kullanabilir. - Ameliyat sırasında göz kuruluğu önlemek için göz merhem uygulamak.
- Bacaklarda bant ile düzeltmek ve karın bir dezenfektan ile sterilize. Fare sadece cerrahi alan maruz bırakarak gazlı bez ile kapak. % 70 etanol cerrahi alan ve gazlı bez yayıldı.
- Uzunluğu yaklaşık 2 cm cilt kesi yapmak ve boşluğu yavaşça skalpel makasla genişletmek. Bulun linea alba ve doku kullanarak periton ile biraz daha küçük bir ikinci giriş makas künt ucu ile yapmak.
- Açılan karın boşluğu önceden ısıtılmış steril 1 ile nemlendirin PBS x.
- Dikkatli bir şekilde rahim boynuzları halka forseps kullanarak Karın boşluğundan ayıklayın. İki komşu embriyo sarısı sacs arasındaki boşluğu sadece rahim duvarı tarafından kapma yavaşça çekin. Embriyo üzerinde herhangi bir baskı belgili tanımlık kesme kablolarıylaberaber kaçının. Belgili tanımlık kesme gerekirse büyütmek ve uterin arter yoluyla kan akışını sıkıştırmak değil iken karın üzerine rahim boynuzları konumlandırmak için ekstra dikkat.
Not: bazı durumlarda, bu bir rahim boynuz teker teker ayıklamak ve ikinci rahim boynuz işlemine devam etmeden önce değiştirmek için tavsiye edilir.
- Hamile CD-1 fareler isoflurane ile anestezi. Anestezi kutusundaki metinle 3-4 vol % isoflurane teşvik (oksijen akış hızı: 1, 5 L/dak) ve burun konisi ile ameliyat sırasında 2 vol-% ile sürdürmek.
- Enjeksiyon ve plazmid DNA'lar Elektroporasyon
- Yaklaşık 15 µL renkli plazmid-çözüm hazır cam kapiller ile Aspire edin. Bu işlem sırasında herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
Not: Eğer onun konsantrasyonu yüksek plazmid çözüm ucu kolayca yapışmasına neden olabilir. Kılcal bazı DNA enjeksiyon önce serbest bırakarak sınayın. - Yavaşça embriyo halka forseps ile tutun ve boyun bölgesi bulun.
Not: embriyo enjekte etmek zor durumda ise, o atlayın ve sonraki embriyo için gidin. Artan embriyo yeniden konumlandırma onlara zarar şansını artırabilir. - Yavaş yavaş dorsal arka beyin delici tarafından önceden hazırlanmış cam kapiller ucu ile dördüncü ventrikül işlemek ve daha sonra yaklaşık 1 µL plazmid karışımı enjekte. Boyalı DNA beyinden sızdırılmış değil ve bir elmas şeklindeki yapısı görülebilir emin olun.
Not: isteğe bağlı olarak, 2.5-fold Büyüteç gözlük dördüncü ventrikül daha iyi görselleştirme için kullanın ve çevreleyen kan damarları. Sonra hemen enjeksiyon difüzyon plazmid çözümünün diğer ventrikül önlemek için elektrik darbeleri teslim. - Elektrik kare bakliyat geçerlidir (5 Bakliyat, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) forseps benzeri platin cımbız (bkz: Malzemeler tablo) ile. Elektrotlar yanal kulak ve serebellar primordium rahim duvarı konumlandırılmış pozitif Kutbu kapsayan negatif kutup ile yer. 5 mm çapında elektrot plakaları E13.5 embriyo etkili Elektroporasyon için kullanın.
Not: embriyo dam başına toplam sayısının 2/3'den azrd manipüle ederek kurtulma ve yavrularını artırın. Embriyo çok yakın rahim için kaçının. Manipüle, Doğum sırasında komplikasyonlara neden ve tüm çöp tehlikeye olabilir. Elektrotlar çok Eğer embriyo'nın kalbine yakın bu kalp krizine neden olabilir.
- Yaklaşık 15 µL renkli plazmid-çözüm hazır cam kapiller ile Aspire edin. Bu işlem sırasında herhangi bir hava kabarcıkları kaçının.
- Post-Elektroporasyon ve ameliyat sonrası bakım
- Dikkatli bir şekilde rahim boynuzları karın boşluğuna yerleştirin ve dolgu ile önceden steril 1 ısındı PBS x. Doğal bir pozisyon içine rahim boynuzları slayt izin.
- Ayrıca basit sürekli dikiş ile cilt Karın zarını kapatın.
Not: rahim duvarı delip Karın zarını dikiş zaman değil ekstra dikkat. - Anestezi kapatma ve hayvanın karın aşağı yeni bir kafesin içine yerleştirin.
- Hayvan uyanık faz ve 24 h sırasında tekrar ameliyattan sonra izlemek. Isıtma lambası altında belgili tanımlık kafes, titreyen içinde bir 15 dk zaman dilimi düzelmezse ve hayvan tımar başlamıyor koyun.
- Başarılı Elektroporasyon luciferase görüntüleme tarafından onaylayın.
- İşletilen barajlar anda (E19.5) embriyo bırakın emin olun.
Not: Doğum tarihi için ertesi gün muhtemelen işlemi nedeniyle gecikebilir. - Electroporated yavruları (P5-P7) % 2.5 isoflurane ile anestezi ve (mayi (IP)) D-biyoluminesans (3 mg/kg vücut ağırlığı) ile 5 dk önce görüntüleme enjekte.
- Luciferase sinyalleri bioluminescence Imager kullanarak electroporated pups içinde algılamak.
Not: 1 dk pozlama süresi luciferase sinyal tespit etmek yeterli olur. Parlaklık (p/s/cm2/sr) olduğunu yaklaşık > 1 x 106.
- İşletilen barajlar anda (E19.5) embriyo bırakın emin olun.
4. Electroporated Cerebella Cryosections hazırlamak
- Electroporated P7 pups ötenazi ve beyincik incelemek.
Not: Bir epifluorescent stereoscope kullanarak GFP sinyal görülebilmektedir. - Cerebella gecede beyin % 4'lük başına 5 mL fix PFA PBS 4 ° C'de içinde
- Sabit cerebella geceleme 4 ° C'de % 30 sükroz PBS içinde beyin başına 10 mL transfer
Not: Doku kuluçka sükroz çözümde sonra bir 15 mL tüp alt ulaştırılması gerekmektedir. - Bir parça selüloz filtre kağıdı ile kalan sükroz çözüm iliklerine kadar sonra bir en uygun kesme sıcaklık (OCT) bir tek kullanımlık plastik kalıp içine bileşik beyincik bırakın ve kuru buza dondur. Kriyojenik blok kadar kullanmak-80 ° C'de muhafaza edilebilir.
Not: Protokol burada duraklatılmış. - Bir cryostat kullanarak kalınlığı 10 µm bölümlerle kriyojenik blok oyulmuş ve bölümleri-80 ° C'de kullanımda kadar devam.
Not: Bir OKT PBS ile bileşik yıkama sonra GFP ifade, bölümlerde onaylayabilirsiniz.
5. Cryosections Immunostaining
- Slaytlar için 30 dk room temperature ve yıkama PBS 10 min için iki kez kuru.
- Bölümleri sıvı engelleyici kalemle daire ve engelleme bir çözüm bölümlerde kuluçkaya (% 10 normal eşek serum içinde % 0,1 içeren PBS Triton-X100) Oda sıcaklığında 1 h için.
- Birincil antikorlar karşı molekülleri (Örneğin, GFP ve topoizomeraz II beta (Top2B) Bu çalışmada) ilgi engelleme çözüm ekleyin ve bir gecede 4 ° C'de kuluçkaya
Not: Tablo malzemelerkullanılan antikor konsantrasyonları ve adları listelenir. GFP sinyalleri geliştirmek için bir anti-GFP antikor isteğe bağlı olarak diğer antikorlar ile birlikte kullanılabilir. - 10 dk. Incubate için %0,1 PBST 3 X Triton içeren slaytlarla oda sıcaklığında 1 h için bölümleri bir fluorophore Birleşik ikincil antikor DAPI içeren engelleme çözümde seyreltilmiş yıkayın.
- PBS 3 X 10 dk. Mount için slaytları slaytlar yıkama ve 4 ° C'de görüntüleme kadar tutun.
Not: Protokol burada duraklatılmış.
6. görüntüleme ve çözümleme
- 20 x büyütme oranında confocal mikroskop kullanma bölümlerine görüntü.
- GFP pozitif hücrelerinin ifade hedef protein kaybetme saymak. Temsili resim Şekil 2Biçinde gösterilir.
- Üzerine ablasyon GNPs ve onların ettiklerinizden hedef genlerin moleküler fenotip immuostaining12ile kontrol edin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vivo fonksiyonel analiz için eksojen gene(s) içine girmiştik hücrelerini tanımlamak için önemlidir. GFP sigara Proliferasyona hücrelerdeki uzun süre takip gibi bir işaretleyici ifade, sinyal sırayla Proliferasyona hücrelerde kayboluyor. Bu efekt bir çizimi Şekil 1' de gösterilmiştir. Ayak izi LOF analizlerde transfected hücrelerinin kaybetme aşmak için biz Elektroporasyon tabanlı gen teslim CRISPR/Cas9 teknoloji ile birleştirerek yeni bir yaklaşım geliştirdik.
Temsilcisi sonuçları Şekil 2' de gösterilmiştir. Plazmid yapıları işlevselliğini pU6-sgTop2b-Cbh-Cre geçici transfection tarafından test edilmiş ve pCAG-örneğin-Top2b-FP17sgTop2b hedef dizisi, HEK293T taşıyan, hücreleri stabil SpCas9 ifade (Şekil 2A). SgRNA-güdümlü Cas9 endonükleaz etkinlik DSB-aracılı Homoloji yönetmen tamiri EGFP ifade kaset neden olmaktadır. Bu nedenle, sgRNA fonksiyonu doğrudan GFP ifade tespiti tarafından analiz edildi. Mashiko ve ark.göre fazla % 30 transfection verimliliğini bir sgRNA etkili17olarak belirler.
GNPs rhombic dudak (RL), dördüncü ventrikül çatısı embriyonik aşamada E12.5 E16.5 kadar çevreleyen, bir bölge kaynaklı. Bu hücreler hücre döngüsü20çıktıktan sonra dış dış granül katman (oEGL) ve iç EGL (iEGL) için shift doğumdan sonra büyük yayılması geçmesi bilinmektedir. Böylece, GNPs bizim genetik etiketleme yaklaşımın avantajları test etmek için uygun bir örnek vardır.
Bu iletişim kuralı takip ederek, GNPs, rahim içinde Elektroporasyon GFP ile düzenlenmiş hücre izleme sağlar. Biz sgControl Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP fareler serebellar primordium embriyonik evre at E13.5 ifade pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid tanıttı. Fareler P7 postnatal gününde kurban edildi ve serebellar doku bölümlerin sagittal bölümleri tarafından immünhistokimya lekeli. Dış ve iç EGL tanımlanan Ki67 ifade (oEGL) ve p27 ifade (iEGL), anılan sıraya göre. Nükleer silahların yayılmasına karşı ve olgunlaşma geçiren rağmen olgun serebellar granül nöronlar (CGNs) hala güçlü GFP ifade (Şekil 2B) korunur.
Belgili tanımlık yarar bu protokol vurgulayarak, biz Ayrıca DNA Top2b bir temsilcisi örnek olarak hedefleme sgRNA kullanılır. Deneysel prosedürler (bakınız Şekil 2B) açıklandığı gibi yapıldı. SgRNAs ile Top2b için transfected GFP pozitif hücrelerin çoğu iç granül katman (IGL), Top2b ifade kaybına sgRNAs ifadesini (Şekil 2C) net azalma sonuçlanmamıştır denetim getirilmesi sırasında sergiledi. Bu sonuç bir miktar Şekil 2Bolarak gösterilir. Bu verileri geliştirme veya tümör oluşumu sırasında uzun bir süre için düzenlenen hücreleri izleme için değerli bir araç sunar.
Şekil 1: GFP ifade Proliferasyona ve sigara Proliferasyona hücrelerdeki şematik gösterimi. (Ne zaman bir eksojen geni Proliferasyona olmayan hücrelerde hücre kodlama GFP (Örneğin, pCAG-EGFP) transfected GFP uzun bir süre (üst lane) ifade olabilirA). Bu arada, GFP ifade eksojen GFP (orta lane) seyreltme nedeniyle Proliferasyona hücrelerdeki yok olabilir. Buna ek olarak, LoxP-Stop-LoxP-GFP (LSL GFP) transgene taşıyan hücrelerin proliferasyonu Cre recombinase (alt lane) ile transfection sonra sırasında GFP ifade tutabilirsiniz. (B) SpCas9-aracılı gen susturmak ve GFP ifade Cre ve sgRNA transfection bir Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP içinde sonra fare zorlanma. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: Bu protokol sonuçlarından temsilcisi görüntülerini. (A)HEK293T stabil SpCas9 ifade hücreleri pU6-sgTop2b-Cbh-Cre ve pCAG-örneğin-Top2b-FP plazmidleri ile transfected. GFP ifade canlı hücrelerdeki izlenen bir floresan hücre Imager kullanarak ( Tablo malzemelerigörmek) 48 h transfection sonra. Sol ve sağ kapı aynası GFP ifade, sırasıyla temel bir etkin ve etkili-sgRNA sıra göster. Ölçek çubukları: 100 µm. (B) Immunostaining GFP, Ki67 ve P7 cerebella gelen Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP bir fare üzerinde p27 tabi çoğalmasıyla, E13.5 için pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid yapıları kontrol sgRNA ifade. Bölüm DAPI (mavi) ile counterstained. Ölçek çubukları: 50 µm; 20 x büyütme. GFP ifade hücrelerde Ki67 tarafından işaretlenmiş oEGL unutmayın. (C) GFP Immunostaining (yeşil) ve Top2b (macenta) E13.5, electroporated pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid ile yapıldı Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP fareden P7 cerebella yapıları Top2b karşı ifade sgRNA (sgTop2b) ve bir denetim sırası (sgControl). Oklar Top2b ifade aynı alandaki GFP+ hücrelerdeki gösterir. Ölçek çubukları: 20 µm; 20 x büyütme. (D) miktar Top2b electroporated (pozitif GFP) hücrelerinde sgControl, sgTop2b deneyleri yer. İki ve üç yavru sgControl ve sgTop2b, anılan sıraya göre incelenmiş ve 25 her beyin hücrelerinden analiz edildi. Hata çubukları temsil ± standart hatası ortalama (SEM) ve p-değerleri unpaired ttarafından hesaplanan-test, *p 0.0002 =. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Adı | Sıra | Uygulama | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA hedef sıra | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA hedef sıra | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA hedef sıra | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | PCAG-EGxxFP klonlama | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | PCAG-EGxxFP klonlama | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | SgRNA için sıralama | |
Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan oligos dizisi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Exo utero Elektroporasyon kullanarak, daha önce Atoh1 in vivo siRNA tabanlı fonksiyonel analizleri serebellar granül erken bir aşamada farklılaşma8hücre bildirdin. SiRNA seyreltme/bozulma ve embriyoların rahim duvarı dışında maruz kalma nedeniyle, fenotipik analiz electroporated granül hücre embriyonik aşamada sınırlıydı. Ancak, geçerli yöntem postnatal hayvanların fenotip analizini etkin.
Bizim önceki çalışma tümör baskılayıcı Ptch1 rahim içinde başarıyla indüklenen Elektroporasyon medulloblastoma2üzerinden, o Cas9-aracılı nakavt gösterdi. Buna karşılık, iki büyük avantajı güncel yaklaşımlar sergiler: 1) Cas9 sahip plazmid ile teslim edilmek üzere birden çok gen tek bir plazmid içinde birden çok sgRNA ifade kaset yerine; taşıyarak hedefleme için izin ve 2) hedef hücreleri ve onların ettiklerinizden görselleştirme canlı hücre etkinleştirme GFP ile kalıcı olarak etiketlenir ve tümör dönüştürme davranış analizi hücreleri içinde vivo.
Bu protokol en kritik adım plazmid DNA'lar içine doğru konuma uygun enjeksiyon ve elektrik darbeleri teslim uygun yerlere beyin vardır. Serebellar nöronlar serebellar neuroepithelium sırayla bir Doğum tarihi bağlı şekilde doğarlar. Yalnızca belirli bir zaman penceresi E12.5-14.5, teknik açıdan olduğundan her türü, serebellar primordium hücrelerde Elektroporasyon ile yönlendirilebilir. Derin serebellar çekirdeği neurons ve Purkinje hücreleri E10.5-11.5, ekstra embriyonik membranlar şeffaf değildir ve embriyo DNA enjeksiyon için açıkça görünür olmadığı ortaya olduğu biliniyor. Daha sonra tek kutuplu fırça hücreleri E17.5 üst RL (uRL) elde edilen, dördüncü ventrikül olduğunda DNA uRL çevresinde yeterli miktarda enjekte etmek için çok dar. Böylece, bizim Yöntem yalnızca E12.5-14.5, esas olarak GNPs ve inhibitör interneurons gibi orta - ve daha sonra-tarihi ataları hedefleri itibariyle geçerlidir. Başka bir yöntem tam nakavt fenotip serebellar hücreleri tek binlerce her embriyo Elektroporasyon tarafından hedeflenebilir bu yana Cre/LoxP-aracılı germline GEMMs, karşılaştırıldığında mümkün olmayabilir dezavantajıdır.
Bir önceki çalışmada, GFP pozitif serebellar granül yaklaşık % 80'i hedeflenen gen12kayıp ifade hücreleri. Granül hücre kimliğini moleküler işaretleyiciler ve dağılımını tarafından doğrulandı iken, genler ilgi işaretçi ifade ve nöronal göç olmuş olabilir gibi bu kimlik yaklaşım her zaman uygulanabilir, olabilir. Koşullu bir hücre özgü organizatörü kullanarak Cre aktivasyonu bu durumda sorunu çözmek. Bu nedenle, mevcut her yerde Cbh organizatörü pU6-sgRNA-Cbh-Cre plazmid içinde bir hücre özgü organizatörü ile değiştirilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Laura Sieber, Anna Neuerburg, yasin Harim ve Petra Schroeter teknik yardım için teşekkür ederiz. Biz Ayrıca Drs. K. Reifenberg, K. Dell ve P. Prückl DKFZ, hayvan deneyleri için yararlı yardım için teşekkür ederiz; Imaging Core tesislerinde DKFZ ve Carl Zeiss görüntüleme Merkezi DKFZ confocal mikroskobu görüntüleme için. Bu eser Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (dk) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
