Summary
Обычные потери функции исследования генов с помощью маскирования животных часто были дорогостоящим и трудоемким. Электропорация основанный ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутагенеза является мощным инструментом, чтобы понять, что ген функционирует в естественных условиях. Здесь мы приводим метод для анализа нокаут Фенотипы пролиферирующих клеток мозжечка.
Abstract
Пороки развития головного мозга часто является причиной генетических мутаций. Расшифровка мутации в тканях пациента производный выявила потенциальные причинных факторов заболеваний. Чтобы проверить вклад дисфункции мутировавших генов для развития болезни, поколения животных моделей, перевозящих мутации — один очевидный подход. Хотя микрофлорой генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) являются популярных биологических средств и воспроизводимые результаты, он ограничен по времени и расходов. Между тем не микрофлорой GEMMs часто позволяют изучить функции гена более осуществимым образом. Поскольку некоторые мозга заболевания (например, опухоли головного мозга), как представляется, в результате соматических но не герминальных мутаций, не микрофлорой химерных мыши модели, в которой сосуществуют нормальных и ненормальных клеток, может быть полезным для болезни значимого анализа. В этом исследовании мы приводим метод для индукции ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутаций в мозжечке. В частности, мы использовали условное стук в мышей, в которых Cas9 GFP хронически активизируются и промоутер CAG (ЦМВ усилитель/курица ß миозина) после Cre-опосредованной рекомбинации генома. Самостоятельно разработанные сингл руководство РНК (sgRNAs) и Cre рекомбиназа последовательности, оба закодированы в одной плазмидные конструкции, были доставлены в мозжечковой стволовых/прогениторных клеток на эмбриональном этапе с помощью электропорации в утробе матери . Следовательно Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), способствуя тем самым далее фенотипические анализы были помечены transfected клеток и их дочь клетки. Следовательно этот метод не только показаны доставки на основе электропорации гена в эмбриональных клеток мозжечка, но предлагает также Роман количественный подход к оценке ТРИФОСФАТЫ опосредованной фенотипов потери функции.
Introduction
Заболевания головного мозга являются одним из самых страшных смертельной болезни. Они часто являются результатом генетических мутаций и последующей регуляции. Чтобы понять молекулярные механизмы заболеваний головного мозга, когда-либо прочного усилия расшифровать геном человека пациентов обнаружили ряд возможных причинных генов. До настоящего времени микрофлорой генетически модифицированные Животные модели были использованы в естественных условиях получить из функции (Гоф) и потери функции (LOF) анализ генов такого кандидата. Из-за ускоренного развития функциональной проверки исследований желательно более осуществимым и гибкие в vivo гена пробирного систему для изучения функции гена.
Применение системы передачи на основе электропорации гена в естественных условиях на развивающийся мозг мыши подходит для этой цели. В самом деле несколько исследований, с использованием в утробе матери электропорации показали свой потенциал для проведения функционального анализа в развивающегося мозга1,2,3. На самом деле несколько регионов мозга мыши, например коре4, сетчатки5, таламус6, задний мозг7, мозжечок8и спинного9 были мишенью соматическая генная доставки подходы, пока.
Действительно выражение переходных гена путем электропорации в естественных условиях на мозги эмбриона мыши уже давно используется для GOF анализа. Последние технологии на основе transposon геномной интеграции далее включены долгосрочные и/или условное выражение генов интерес10,11, который выгодно чтобы вскрыть функции гена на основе пространственных и временных во время развития. В отличие от GOF анализ анализ LOF была более сложной. Хотя была выполнена переходных трансфекции малые интерферирующие РНК и перевозящих индуцируемый плазмид, долгосрочные последствия LOF генов не гарантируется из-за возможной деградации экзогенно введено нуклеиновых кислот, таких как плазмидов и двуцепочечных РНК. Однако ТРИФОСФАТЫ/Cas технология обеспечивает прорыв в LOF анализы. Гены, кодирующие флуоресцентных белков (например, GFP) или биолюминесцентных белков (например, Светлячок Люцифераза) были совместно transfected ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и sgRNAs для обозначения клетки подвергаются ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной соматических мутаций. Тем не менее этот подход может иметь ограничения в функциональных исследований пролиферирующих клеток, так как разбавленный и деградированных после долгосрочного распространения экзогенных маркерных генов. В то время как transfected клеток и их дочь клетки претерпевают ТРИФОСФАТЫ индуцированной мутации в их геном, их следы могут заблудиться со временем. Таким образом генетических меток подходов будет подходящим для преодоления этой проблемы.
Мы недавно разработали метод основанный ТРИФОСФАТЫ LOF в клетках мозжечковой гранул, которые проходят долгосрочного распространения во время их дифференциации12. Генетически маркировать transfected клеток, мы построен плазмида, перевозящих sgRNA вместе с КРР и введены плазмида cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мышей13 с помощью электропорации в утробе матери . В отличие от обычных плазмида векторов кодирования EGFP, этот подход успешно помечены грануле transfected нейрон прекурсоров (ВНП) и их дочь клетки. Этот метод обеспечивает большую поддержку в понимании в естественных условиях функции генов интерес в пролиферирующих клеток в развитие нормального мозга и опухоли подверженных фон.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все эксперименты на животных были проведены согласно правилам защиты животных и были одобрены ответственными органами (Regierungspräsidium Карлсруэ, утверждение чисел: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 и G133/14).
1. создать плазмиды pU6-sgRNA-Cbh-Cre
- Дизайн sgRNA целевой гена интереса согласно ранее опубликованного протокола №14.
Примечание: В этом эксперименте, два sgRNAs предназначены для целевой мыши ген Top2b и не являющихся объектом контроля sgRNA (Таблица 1). В плей-офф gene(s) с помощью технологии ТРИФОСФАТЫ sgRNAs необходимо разработать целевой кодирующая последовательность 5' региона либо основных функциональных домен белка. Одной удобной отправной точкой является для тестирования публично доступных готовых sgRNA последовательностей, как в GeCKO v2 мыши нокаут бассейн библиотеки15 из лаборатории Чжан. Кроме того, sgRNAs могут разрабатываться с использованием общественных программного обеспечения таких как следующий веб-узел: crispr.mit.edu. - Клон sgRNAs в pU6-sgRNA-Cbh-Cre вектор.
Примечание: PU6-sgRNA-Cbh-Cre вектор12 , используемые в данном исследовании является производным от оригинальной плазмида pX33016 , заменив кодирующая последовательность SpCas9 рекомбиназа Cre .- Синтезировать два ДНК oligos следующим образом. Смысл: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Примечание: 20 N в показано выше стенд для sgRNA последовательности. - Дайджест pU6-sgRNA-Cbh-Cre с BbsI на 30 минут при 37 ° C, с использованием следующих реагентов, загрузить переваривается образец гель агарозы 1% и очистить их с помощью геля добыча комплект. Использование 3 мкг плазмиды; 3 мкл Bbsя; 1 мкл FastAP; 5 мкл 10 x буфер пищеварения; Добавьте ddH2O довести объем до 50 мкл.
- Фосфорилировать и отжига каждой пары sgRNA oligos с использованием следующих реагентов (общий объем 10 мкл): 1 мкл подгонянные смысл oligo (100 мм); 1 мкл подгонять антисмысловых oligo (100 мм); 1 мкл 10 x буфер лигирование T4; 6,5 мкл ddH2O; 0.5 МКЛ T4 ПНК. Инкубировать в термо циклователь на 30 минут при 37 ° C и 5 мин при 95 ° C, а затем рампы до 25 C ° на 5 ° C/мин.
- Настройте следующие реакции перешнуровки и проинкубируйте втечение 10 мин при комнатной температуре (общий объем 10 мкл): X µL Bbsя переваривается плазмида (50 нг); 1 мкл фосфорилированных и отжигом, oligo дуплекс (разбавления 1: 200); 5 мкл 2 x лигирование буфер; X µL ddH2O; 1 мкл быстрый лигаза.
- 2 мкл лигирование продукта, в 50 мкл химически компетентных клеток DH5α кишечная палочка . После 30 минут инкубации на льду, тепловой шок образца для 90 s при 42 ° C и инкубировать в течение 2 минут на льду. 100 мкл LB среднего и пластины на пластину LB, содержащий ампициллина 100 мкг/мл.
Примечание: Интеграция sgRNA последовательности в pU6-sgRNA-Cbh-Cre плазмиду производится по клонирования шаги для плазмида pX33014. - Прививок две колонии, каждый по 2 мл среды фунтов при 37 ° C как минимум 6 часов и выполнять мини-prep ДНК изоляции с помощью комплекта.
- Сэнгер последовательности ДНК мини-prep, используя праймер hU6-вперед и определить колоний с правильной вставки sgRNAs, совместив с последовательностью, показанный в шаге 1.2.1. Грунтовка последовательность показано в таблице 1. Плазмиды, используемые в данном исследовании были названы pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-КРР и pU6-sgControl-Cbh-Cre.
- Прививать правильно определил колоний и очистить бесплатно эндотоксина плазмидной ДНК для электропорации в утробе матери с помощью комплекта, например, от Qiagen. Элюировать ДНК с бесплатно эндотоксина TE-буфера разводят в ddH2O в 1:10 (10% TE буфера). Концентрации ДНК плазмиды должен быть выше, чем 2 мг/мл.
Примечание: Не используйте регулярные комплект макси prep для подготовки ДНК. Хранить плазмида решения на 4 ° C для регулярного использования краткосрочных (до 4 недель), или Алиготе соответствующий объем около 25 мкл и держать при-20 ° C для длительного хранения.
- Синтезировать два ДНК oligos следующим образом. Смысл: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisense: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. Проверьте работоспособность с помощью системы плазмида EGxxFP sgRNAs
Примечание: Эффективность sgRNAs обычно проверяется сюрвейера или T7E1 (T7 эндонуклеазы I) анализов. В этом протоколе используется простой и эффективный альтернативный подход. Ключом такой подход заключается в использовании плазмида pCAG-EGxxFP, который содержит перекрывающиеся фрагменты EGFP, разделенных последовательность ДНК, содержащие sgRNA, ориентация сайта17. Выражение pCAG-EGxxFP вместе с sgRNA и Cas9 в transfected клеток Cas9-опосредованной двойной нити перерыв (DSB) в последовательности целевых объектов ремонта эндогенного гомологии зависимых механизмов, который восстанавливает EGFP выражение кассета.
- Дизайн грунтовки усилить геномной региона по центру с sgRNA, ориентация последовательности. Ампликон ПЦР составляет примерно 500 bp. В этом эксперименте Ассамблея ДНК был применен для клонирования PCR-усиливается фрагмент в плазмиду pCAG-EGxxFP.
Примечание: в качестве альтернативы, соответствующее ограничение сайты могут добавляться к 5' концу праймеры PCR. Имеющиеся ограничения сайтов в векторе pCAG-EGxxFP, BamHI, NheI, PstI, Сали, EcoRI и EcoRV. - Усилить геномной ДНК с дизайном грунты, используя форму и параметры ПЦР ниже. Загрузить образец (19.7 мкл H2O; 0,3 мкл 10 нг/мкл геномной ДНК мыши; 2,5 мкм мкл 10 EGxxFP-Top2b-F; 2,5 мкм мкл 10 EGxxFP-Top2b-R, 25 мкл 2 X мастер смесь ПЦР; 50 мкл общий объем) на агарозы 1% гель и гель Очистить ПЦР фрагментов с помощью геля добыча комплект. Используйте следующие реакции условий: 95 ° C 3 мин; затем 35 x циклов 98 ° C за 20 сек, 60 ° C 15 s, 72 ° C для 20 s и 72 ° C в течение 1 мин; 4 ° C, на неопределенный срок.
Примечание: В этом эксперименте, был усилен один регион в Top2b экзона 1; Поиск последовательностей праймера в таблице 1. - Дайджест pCAG-EGxxFP вектор с энзимами ограничения BamHI и EcoRI за 2 ч при 37 ° C, затем загрузить образец на агарозы 1% гель и гель очищение вектора позвоночника, используя набор гель добыча. Использование следующих реагентов (общий объем 50 мкл): плазмида X µL (3 мкг); 2 мкл BamHI; 2 мкл EcoRI; 5 мкл 10 x буфер; X µL ddH2O.
- Настройка реакции ДНК Ассамблеи18 согласно инструкциям производителя и превратить в DH5α сведущее Escherichia coli.
- Прививать две колонии, каждый в 2 мл среды фунтов при 37 ° C не менее 6 ч, выполнять мини-prep ДНК изоляции с помощью комплекта, например, от Qiagen и определить колоний с правильной вставки (в дальнейшем именуемый pCAG-EG-Top2b-FP) с использованием Сэнгер Виртуализация с EGxxFP-Top2b-F грунт.
- Transfect HEK293T клеток.
- Семя HEK293T клетки в 24-ну плиту 24 h перед transfection.
Примечание: Клетки были культивировали в инкубаторе клеток 37 ° C с 5% CO2, в среде DMEM с глютамин добавки, содержащие 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. Убедитесь, что клетки являются 60% притока в день transfection. В этом эксперименте мы использовали самодельные клетки HEK293T, стабильно выражая SpCas9 для тестирования pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Однако wildtype HEK293T клетки может использоваться при условии вектора выражения SpCas9. - Transfect HEK293T клетки, с помощью polyethylenimine (PEI) реагента. Transfect клетки с 120 нг/колодец pCAG-EG-Top2b-FP плазмида12 и 120 нг/колодец pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre или pU6-sgTop2b-2-Cbh-КРР в пластине 24-хорошо. Смешать плазмида ДНК и 1.8 мкл Реагента PEI в 80 мкл unsupplemented DMEM среды с глютамином дополнить и Инкубируйте 15 мин при комнатной температуре после vortexing.
- 6 ч после трансфекции, удалите среды и замените свежей среды.
- Контролировать наличие живых клеток GFP+ 48 ч после трансфекции с помощью микроскопа флуоресценции при 20-кратном.
Примечание: Количество ячеек GFP+ указывает на определение эффективности sgRNA. Результаты эффективных и неэффективных sgRNAs (sgTop2b-1 и sgTop2b-2, соответственно) показано на рисунке 2А.
- Семя HEK293T клетки в 24-ну плиту 24 h перед transfection.
3. выполнить в утробе матери Электропорация
- Разводят 6-8-week-old мышей и подготовить инструменты для электропорации в утробе матери . Крест мужской гомозиготных Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мышей с самок мышей CD-1. Время беременности CD-1 мышей от дня Вагинальные вилка обнаружения (E0.5). Эмбрионов, electroporated в день E13.5.
- Тянуть боросиликатного стекла капилляров (внутренний диаметр: 0,6-0,8 мм) с микропипеткой съемник. Используйте следующие параметры: P = 500, тепло = 560, тянуть = 150, Vel = 75, время = 250. Ярлык кончик капилляра с черными чернилами для лучшей визуализации во время инъекции. Трим капиллярного конусности под стереомикроскопом, с помощью линейки и острые иглы пинцета и обрежьте кончик длиной около 6 мм.
- Сохранять единство капилляров держать эксперимент воспроизводимость. Создание одностороннего скошенный край во время обрезки. Наконечник должен быть столь резким, как можно легко проникновения в стенке матки и во избежание повреждения тканей эмбриона.
Примечание: в качестве альтернативы используйте микро точильщика для регулировки угла 35°19. Капилляров может храниться при комнатной температуре в 10 см Петри возбудителя свободных условиях. - Автоклав хирургических инструментов.
- Смесь sgRNA плазмид в равных частях с pT2K-IRES-Люк до конечной концентрации по крайней мере 1 мкг/мкл для каждого плазмиды и цвет плазмида решение с быстрым Грин (конечной концентрации 0,05%). Подготовьте раствор 1% быстро зеленый с эндотоксинов бесплатная дистиллированная вода и фильтр через 0,22 мкм фильтр для удаления частиц красителя из решения.
Примечание: Сопредседатель transfection pT2K IRES-Люк необязательно, но позволяет выявить жизнеспособные electroporated животных после рождения с помощью томографии биолюминесценции. Пожалуйста, смотрите шаг 3.5. Подготовьте достаточное количество плазмида микс для общего числа беременных мышей, чтобы эксплуатироваться. Использовать около 15-20 мкл смесь на мышь (~ 12 эмбрионов). Немедленно приступайте к операции.
- Подготовьте мышей для хирургии.
- Анестезировать беременных мышей CD-1 с изофлюрановая. Побудить анестезии в коробку с 3-4 изофлюрановая vol-% (скорость потока кислорода: 1.5 Л/мин) и поддерживать его с 2 vol-% во время операции через носовой конус.
Примечание: Полная хирургия не следует принимать дольше, чем 30 мин уменьшить количество вводят и electroporated эмбрионы, при необходимости. Используйте стерильные перчатки для хирургии. - Поместите курсор мыши на его обратно на грелку и отрегулировать анестезии.
- Придать обезболивающее (Метамизол, 800 мг/кг массы, тела подкожно (с.к.), 24 h депо).
Примечание: Вы можете использовать другие уполномоченные анальгетиков чем Метамизол. - Примените Глазную мазь предотвратить сухость глаз во время операции.
- Fix конечностей клейкой лентой и стерилизовать живота с дезинфицирующим средством. Покрытие мыши с марлей, оставляя только хирургические области подвергаются. Распространилась на 70% спирте хирургические области и марлей.
- Сделать разрез кожи около 2 см в длину и аккуратно разрыв с прямо хирургические ножницы. Найдите linea alba и сделать немного меньше второй надрез через брюшину, используя ткань ножницами с тупым кончиком.
- Смачивать открытые брюшной полости с подогретым стерильные 1 x PBS.
- Тщательно извлечь рога матки из брюшной полости с помощью щипцов кольцо. Слегка потяните, захватывая стенке матки исключительно на разрыв между желтком мешки двух соседних эмбрионов. Во избежание какого-либо давления на эмбрион потянув его через разрез. Увеличить разрез, в случае необходимости и проявлять особую осторожность, чтобы расположить маточные рожки на животе пока не сжатия потока крови через маточные артерии.
Примечание: В некоторых случаях рекомендуется извлечь один рога матки в то время, и заменить его перед второй рога матки.
- Анестезировать беременных мышей CD-1 с изофлюрановая. Побудить анестезии в коробку с 3-4 изофлюрановая vol-% (скорость потока кислорода: 1.5 Л/мин) и поддерживать его с 2 vol-% во время операции через носовой конус.
- Инъекции и электропорации плазмидной ДНК
- Аспирационная примерно 15 мкл цветных плазмида-решения с подготовленной стеклянный капилляр. Избегайте любых пузырьков воздуха в ходе этого процесса.
Примечание: Плазмида решение может засорить кончик легко если его концентрация является высоким. Протестируйте капилляра, выпустив некоторые ДНК прямо перед инъекцией. - Аккуратно провести эмбриона с щипцами кольцо и найдите область шеи.
Примечание: Если эмбрион находится в состоянии трудно внедрить, пропустить его и перейти на следующий эмбриона. Повышение статуса эмбриона может увеличить шансы ущерба для них. - Медленно Пирс с кончика ранее подготовленные стеклянный капилляр в четвертый желудочек, проникая через задний спинной мозг и затем впрыскивают около 1 мкл плазмида микс. Убедитесь, что окрашенная ДНК не просочилась из мозга и виден как алмаз формы структура.
Примечание: При необходимости, использовать 2,5 увеличительные стекла для лучшей визуализации четвертого желудочка и окружающих кровеносных сосудов. Доставить электрических импульсов сразу же после инъекции для предотвращения диффузии плазмида-решения для других желудочков. - Применять электрические прямоугольных импульсов (5 импульсов, 32 МВ, 50 мс на 950 ms-off) с щипцами как Платиновый пинцетом (см. Таблицу материалы). Боков место электроды с отрицательным полюсом, охватывающих уха и положительный полюс в мозжечковой зачаток наведении на стенке матки. Используйте 5 мм в диаметре электродные пластины для эффективного электропорации E13.5 эмбрионов.
Примечание: Увеличение выживаемости потомства, манипулируяrd менее чем 2/3 от общего количества эмбрионов за плотины. Избегайте эмбрионов слишком близко к шейке матки. Если манипулировать, они могут вызвать осложнения во время родов и поставить под угрозу весь помет. Если электроды находятся слишком близко к сердце эмбриона, это может привести к остановке сердца.
- Аспирационная примерно 15 мкл цветных плазмида-решения с подготовленной стеклянный капилляр. Избегайте любых пузырьков воздуха в ходе этого процесса.
- Пост электропорация и послеоперационный уход
- Осторожно поместите маточные рожки обратно в брюшной полости и заполнить с предварительно разогретую стерильные 1 x PBS. Пусть маточные рожки слайд в естественном положении.
- Закрытие брюшины и кожи отдельно с простой непрерывный шов.
Примечание: Проявлять особую осторожность, чтобы не проткнуть стенку матки, когда ушивание брюшины. - Свертывание анестезии и поместите животное живот вниз в новой клетке.
- Мониторинг животных во время бодрствования фазы и снова 24 ч после операции. Место клетки под лампой Отопление, если дрожь не улучшится в течение 15 мин-сроки и животное не начать ухаживания.
- Подтвердите успешное электропорации Люцифераза изображений.
- Убедитесь, что эксплуатация плотин падение эмбрионов на время (на E19.5).
Примечание: Дата рождения может быть отложено на следующий день вероятно из-за операции. - Анестезировать electroporated щенков (P5-P7) с 2,5% изофлюрановая и вводить (внутрибрюшинного (и.п.)) с D-Люциферин (3 мг/кг массы тела) 5 мин до изображений.
- Обнаружить Люцифераза сигналов в electroporated щенков, с помощью томографа биолюминесценции.
Примечание: Время экспозиции 1 мин является достаточной для обнаружения сигнала Люцифераза. Сияние (/sr p/s/см2) составляет приблизительно > 1 x 10-6.
- Убедитесь, что эксплуатация плотин падение эмбрионов на время (на E19.5).
4. подготовить Cryosections от Electroporated Cerebella
- Усыпить P7 щенков electroporated и вскрыть из мозжечка.
Примечание: Сигнал GFP можно наблюдать с помощью epifluorescent стереоскоп. - Исправить cerebella на ночь в 5 мл на мозг 4% ПФА в PBS на 4 ° C.
- Передача фиксированного cerebella ночь в 10 мл на мозг 30% сахарозы в ФБР при 4 ° C.
Примечание: Ткани должен достичь нижней части 15 мл после инкубации в растворе сахарозы. - После впитывая оставшийся раствор сахарозы с куском бумаги фильтр целлюлозы, погружать мозжечка оптимального раскроя температуры (OCT) в одноразовых пластиковых плесень и заморозить его на сухой лед. Криогенный блок может храниться при температуре-80 ° C до использования.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь. - Нарезать секции с 10 мкм криогенный блок толщины с помощью криостат и сохранить разделы на-80 ° C до использования.
Примечание: Один можно подтвердить экспрессия гена GFP в разделах, после промыть OCT соединение с PBS.
5. иммуноокрашивания Cryosections
- Сухие слайды на технические для 30 мин и мыть дважды за 10 мин в PBS.
- Круг разделы с помощью жидкого блокатор пера и инкубировать в подразделах блокирования решения (10% нормальной осла сыворотки в PBS, содержащие 0,1% тритон-X100) за 1 ч при комнатной температуре.
- Добавление первичного антитела против молекул интерес (например, GFP и топоизомеразы II beta (Top2B) в этом исследовании) в решении блокировки и инкубировать на ночь при 4 ° C.
Примечание: Имена и концентрации антитела, которые используются, перечислены в Таблице материалов. В целях усиления сигналов GFP, антитела анти GFP может использоваться при необходимости вместе с других антител. - Промойте слайды с 0.1% тритон содержащих PBST 3 X 10 мин инкубировать в разделах 1 ч при комнатной температуре конъюгированных Флюорофор вторичное антитело разводят в блокировки раствор, содержащий DAPI.
- Вымойте слайды в PBS 3 X 10 мин горе слайды и хранить при 4 ° C до изображений.
Примечание: Протокол может быть приостановлена здесь.
6. обработка изображений и анализ
- Изображение на разделы, используя конфокального микроскопа при 20-кратном.
- Подсчитать количество положительных клеток GFP потери выражения целевого белка. Представитель изображение будет показано на рисунке 2B.
- Проверьте молекулярных фенотип после аблации целевых генов в ВНП и их потомков, immuostaining12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В естественных условиях функционального анализа крайне важно для определения ячеек, в которые были введены экзогенных gene(s). Хотя выражение маркера такие как GFP-пролиферирующих клеток может быть создана для длительного периода времени, сигнал последовательно теряется в пролиферирующих клеток. Иллюстрацией этого эффекта показана на рисунке 1. Чтобы обойти потерять след transfected клеток в LOF анализов, мы разработали новый подход путем объединения на основе электропорации гена доставки с технологией ТРИФОСФАТЫ/Cas9.
Представитель результаты показаны на рисунке 2. Функциональность плазмидные конструкции проверяется посредством переходных transfection pU6-sgTop2b-Cbh-КРР и pCAG-EG-Top2b-FP17, перевозящих последовательности целевого объекта sgTop2b, в HEK293T клетки, стабильно выражая SpCas9 (рис. 2A). Активности эндонуклеазы Cas9 sgRNA руководствуясь индуцирует DSB-опосредованной гомологии направленных ремонт EGFP выражение кассеты. Следовательно функция sgRNA непосредственно был проанализирован обнаружения экспрессия гена GFP. Согласно Mashiko et al.эффективность трансфекции более чем 30% определяет sgRNA как эффективный17.
ВНП происходят из ромбических губ (RL), регион граничит с крыши четвертого желудочка на эмбриональных стадиях E12.5 до E16.5. Эти клетки, как известно, проходят массовое распространение после рождения в слой внешний внешний блок (oEGL) и переход к внутренней EGL (ИЭУП) после выхода из цикла клетки20. Таким образом ВНП являются примером соответствующей для тестирования преимущества нашего генетического подхода маркировки.
Следуя этого протокола, в утробе матери электропорации ВНП позволяет отслеживать отредактированных ячеек с GFP. Мы ввели плазмида pU6-sgRNA-Cbh-Cre, выражая sgControl в мозжечковой зачаток Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мышей эмбриональной стадии E13.5. Мышей были принесены в жертву в день послеродового P7, и сагиттальной разделы разделов мозжечковой ткани окрашивали иммуногистохимия. Внешняя и внутренняя EGL были определены Ki67 (oEGL) и p27 выражений (ИЭУП), соответственно. Несмотря на претерпевает распространения и созревания, Зрелые мозжечковой гранул нейронов (КСГН) до сих пор сохранил сильные экспрессия гена GFP (рис. 2B).
Подчеркивая полезность этого протокола, мы Кроме того используется sgRNA, ориентация Top2b ДНК в качестве репрезентативного примера. Экспериментальные процедуры выполнялись как описано выше (см. рис. 2B). Большинство GFP-положительных клеток transfected с sgRNAs для Top2b выставлены потеря выражения Top2b в слое внутренний блок (IGL), то время как введение контроля, которую sgRNAs не привело к ясное уменьшение ее выражения (рис. 2 c). Количественную оценку этого результата показана на рисунке 2D. Эти данные представляют собой ценный инструмент для отслеживания отредактированных ячеек для длительного периода времени во время разработки или опухолевые образования.
Рисунок 1: Схематическое представление экспрессия гена GFP в пролиферирующих и не пролиферирующих клеток. (A) при экзогенных генов, кодирования GFP (например, pCAG-EGFP) является transfected в-пролиферирующих клеток, которые могут выразить GFP долгое время (Верхняя полоса). Тем временем может исчезнуть экспрессия гена GFP в пролиферирующих клеток за счет разбавления экзогенных GFP (средней полосы). В противоположность этому клетки, которые несут трансген LoxP-стоп-LoxP-GFP (LSL-GFP) может держать экспрессия гена GFP в ходе распространения после трансфекции с КРР рекомбиназа (Нижняя полоса). (B) принцип SpCas9-опосредованной генов и экспрессия гена GFP после трансфекции КРР и sgRNA в Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мыши штамма. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: представитель изображения результатов из этого протокола. (A) HEK293T были transfected клеток, стабильно выражая SpCas9 с pU6-sgTop2b-Cbh-КРР и pCAG-EG-Top2b-FP плазмид. Экспрессия гена GFP в живых клеток контролируется с помощью томографа люминесцентные клеток (см. Таблицу материалы) 48 ч после transfection. Левой и правой панели показывают эффективное и неэффективное sgRNA последовательности на основе экспрессия гена GFP, соответственно. Масштаб бары: 100 µm. (B) иммуноокрашивания GFP, Ki67 и p27 на P7 cerebella от Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мыши подвергается электропорации в E13.5 с pU6-sgRNA-Cbh-Cre плазмидные конструкции выражая управления sgRNA. Раздел counterstained с DAPI (синий). Масштаб бары: 50 мкм; 20 x увеличение. Обратите внимание, GFP-выражая клетки в oEGL отмечен Ki67. (C) иммуноокрашивания GFP (зеленый) и Top2b (пурпурный) на P7 cerebella от Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мыши, который был electroporated в E13.5 с pU6-sgRNA-Cbh-Cre плазмидные конструкции выражая sgRNA против Top2b (sgTop2b) и Управляющая последовательность (sgControl). Стрелки указывают Top2b выражение в клетках GFP+ в той же области. Масштаб бары: 20 мкм; 20 x увеличение. (D) количественная оценка Top2b в electroporated (GFP-положительных) клетки в sgControl и sgTop2b экспериментов. Двух и трех детенышей были расследованы для sgControl и sgTop2b, соответственно, и были проанализированы 25 клетки от каждого мозга. Планки погрешностей представляют ± Среднеквадратичная ошибка среднего (SEM) и p-значения рассчитывались путем непарных t-теста, *p = 0.0002. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Имя | Последовательность | Применение | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA последовательности целевых объектов | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA последовательности целевых объектов | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA последовательности целевых объектов | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Клонирование в pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Клонирование в pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Последовательность для sgRNA | |
Таблица 1: Последовательности oligos, используемые в данном исследовании.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
С помощью электропорации exo внутриутробно , мы уже ранее сообщали, что на основе малых интерферирующих РНК в vivo функциональный анализ Atoh1 на ранней стадии мозжечковой гранулы ячейки дифференцировки8. Из-за малых интерферирующих РНК разрежения/деградации и воздействия эмбрионов за пределами стенке матки фенотипического анализа клеток гранул electroporated был ограничен эмбриональных стадий. Однако текущий метод включен анализ фенотипа послеродовой животных.
Наши предыдущие исследования показали что Cas9-опосредованной нокаут супрессора опухолевого роста Ptch1 через в утробе матери электропорации успешно индуцированной медуллобластома2. В сравнении, нынешний подход экспонатов два основных преимущества: 1) Cas9 не должны быть доставлены с плазмида, позволяя для нескольких генов таргетинг перевозящих несколько кассет sgRNA выражение в одном плазмида вместо; и 2) клеток-мишеней и их потомков постоянно помечены GFP, позволяя визуализации живых клеток и анализ поведения преобразования опухолевых клеток в естественных условиях.
Наиболее важные шаги настоящего Протокола являются надлежащего инъекции плазмидной ДНК в нужное место и поставка электрических импульсов в соответствующие места в головном мозге. Нейроны мозжечка рождаются из мозжечковой neuroepithelium последовательно в зависимости от рождения. Не все типы клеток в мозжечковой зачаток могут быть направлены через электропорация, потому что только определенное время окно на E12.5-14,5 технически осуществимо. Было известно, что глубоко мозжечковой ядер нейронов и клеток Пуркинье возникают у E10.5-11.5, когда экстра зародышевых оболочек не являются прозрачными, и эмбрион не видна для инъекций ДНК. Позже однополярного кисти клетки являются производными от E17.5 Верхняя RL (uRL), когда четвертого желудочка является слишком узким придать достаточное количество ДНК в непосредственной близости от URL-адреса. Таким образом наш метод применим только в E12.5-14,5, которая главным образом ориентирована на середине - и позднее родился восходящей, как ВНП и тормозящий интернейронов. Еще одним недостатком метода является, что фенотип полный нокаут не может быть осуществимо, по сравнению с КРР/LoxP опосредованной микрофлорой GEMMs, поскольку только тысячи мозжечковой клеток могут быть направлены на электропорации в каждом эмбриона.
В более раннем исследовании примерно 80% мозжечковой гранул GFP-положительных клеток потеряли выражение целевых генов12. В то время как личность блок клеток был подтвержден молекулярных маркеров и их распределения, этот подход идентификации не всегда может быть применимо, как гены интереса могут участвовать в маркер выражения и миграции нейронов. В этом случае условные активации Cre используя клетки конкретной промоутера решит эту проблему. Таким образом можно заменить текущий повсеместно Cbh промоутер в pU6-sgRNA-Cbh-Cre плазмида клетки конкретной промоутера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Мы ценим Лаура Sieber, Анна Нойербург, Ясин Harim и Петра Шретер для оказания технической помощи. Мы также благодарим Drs. K. Райфенберг, K. Dell и P. Prückl за полезную помощь для экспериментов на животных в DKFZ; Imaging основной зал DKFZ и Carl Zeiss изображений центра в DKFZ для воображения confocal микроскопии. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft, ка 4472/1-1 (д.к.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
