Summary
Estudios convencionales de pérdida de función de genes knockout animales han sido a menudo costoso y desperdiciador de tiempo. Basada en la electroporación CRISPR-mediada mutagénesis somática es una poderosa herramienta para entender gen funciona en vivo. Aquí, Divulgamos un método para analizar los fenotipos de nocaut en la proliferación de las células del cerebelo.
Abstract
Malformación cerebral es causada a menudo por mutaciones genéticas. Descifrar las mutaciones en los tejidos derivados del paciente ha identificado posibles factores causales de las enfermedades. Para validar el aporte de una disfunción de los genes mutados para desarrollo de la enfermedad, la generación de modelos animales que las mutaciones es un enfoque obvio. Germinales genéticamente modificados modelos de ratón (GEMMs) son populares herramientas biológicas y exhiben resultados reproducibles, es restringido por el tiempo y los costos. Mientras tanto, no del germline GEMMs a menudo permiten explorar funciones de los genes de una manera más factible. Desde un cerebro enfermedades (p. ej., tumores cerebrales) parecen resultar de somático pero no las mutaciones del germline, modelos de ratón quimérico no germinales, en el que coexisten células normales y anormales, pueden ser útiles para el análisis de enfermedades relevantes. En este estudio, Divulgamos un método para la inducción de mutaciones somáticas CRISPR-mediada en el cerebelo. Concretamente, utilizamos el condicionales knock-en ratones, en el que Cas9 y GFP son crónicamente activados por el promotor de CAG (CMV potenciador de pollo ß-actina) después de Cre-mediada por recombinación del genoma. El solo diseño-guía RNAs (sgRNAs) y la secuencia de recombinase de Cre, ambas codificadas en una único plásmido construcción, fueron entregados en las células progenitoras cerebelosa en un estado embrionario con electroporación en el útero . Por lo tanto, células transfected y su hija fueron etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP), facilitando así mayores análisis fenotípicos. Por lo tanto, este método no sólo mostrando entrega basada en la electroporación del gene en células embrionarias cerebelosas sino que también propone un nuevo enfoque cuantitativo para evaluar fenotipos de pérdida de función CRISPR-mediada.
Introduction
Enfermedades cerebrales son una de las más terribles enfermedades mortales. A menudo resultan de mutaciones genéticas y dysregulation posterior. Para entender los mecanismos moleculares de las enfermedades del cerebro, eterno intento descifrar los genomas de pacientes humanos ha descubierto un número de genes causativos posibles. Hasta ahora, se han utilizado modelos animales genéticamente modificado de germline en vivo ganar-de-función (GOF) y análisis de la pérdida de funciones (LOF) de tales genes candidatos. Debido al acelerado desarrollo de los estudios de validación funcional, es deseable un más flexible y factible en vivo gene sistema de ensayo para estudiar la función genética.
La aplicación de un sistema de transferencia en vivo basada en la electroporación gene en el cerebro de ratón en desarrollo es conveniente para este propósito. De hecho, varios estudios mediante electroporación en el útero han demostrado su potencial para llevar a cabo análisis funcionales en el cerebro en desarrollo1,2,3. En realidad, han sido objeto de varias regiones del cerebro del ratón, tales como la corteza cerebral4retina5, diencéfalo6, cerebelo7, cerebelo8y médula espinal9 por genes somáticos enfoques, hasta la fecha.
De hecho, expresión génica transitoria por electroporación en vivo en cerebros de ratón embrionario ha sido utilizada para el análisis de fibra optica. Recientes tecnologías de integración genómica basada en transposones más permitido a largo plazo o condicional expresión de genes de interés10,11, que es ventajoso para disecar la funciones de los genes de una manera espacial y temporal durante desarrollo. En contraste con el análisis de fibra optica, análisis LOF ha sido más difícil. Si bien se realizaron transitorios de la transfección de plásmidos portadores de shRNA y siRNAs, efectos a largo plazo de LOF de los genes no están garantizadas debido a la eventual degradación de ácidos nucleicos exógeno introducidos, tales como plásmidos y dsRNAs. Sin embargo, la tecnología CRISPR/Cas proporciona una brecha en el análisis LOF. Genes que codifican proteínas fluorescentes (p. ej., GFP) o proteínas bioluminiscentes (p. ej., luciferasa de la luciérnaga) han sido co transfected con Cas9 CRISPR y sgRNAs a las células expuestas a CRISPR-Cas9-mediada por mutaciones somáticas de la etiqueta. Sin embargo, este enfoque podría tener limitaciones en los estudios funcionales en células proliferantes, puesto que genes marcadores exógenos son diluidos y degradados después de la proliferación a largo plazo. Mientras que las células transfected y sus células hijas sufren mutaciones inducidas por CRISPR en sus genomas, sus huellas pueden perderse con el tiempo. Así, enfoques Etiquetadoras genéticos sería convenientes resolver este problema.
Recientemente se desarrolló un método LOF CRISPR basado en células de gránulo cerebeloso que experimentan proliferación a largo plazo durante su diferenciación12. Para la etiqueta genéticamente las células transfected, construyó un plásmido lleva un sgRNA junto con Cre e introduce el plásmido en el cerebelo de ratones de Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP13 mediante electroporación en el útero . A diferencia de los vectores del plasmid regular codificación EGFP, este enfoque etiquetados con éxito transfected gránulos precursores de neuronas (SPNG) y sus células hijas. Este método proporciona gran ayuda en la comprensión en vivo la función de los genes de interés en células proliferantes en el desarrollo normal del cerebro y un tumor propensos a fondo.
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Protocol
Todos los experimentos con animales se realizaron según las normas de bienestar animal y han sido aprobados por las autoridades responsables (Karlsruhe competente, número de aprobación: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 y G133/14).
1. generar plásmidos pU6-sgRNA-Cbh-Cre
- Diseño de lo sgRNA a un gen de interés según el protocolo anteriormente publicado14.
Nota: En este experimento, dos sgRNAs están diseñados para atacar el gen Top2b de ratón y un sgRNA de orientada a no control (tabla 1). Al knockout de genes usando la tecnología CRISPR, sgRNAs deba ser diseñado para orientar la secuencia de codificación de la región 5' o el esencial dominio funcional de la proteína. Un punto de partida conveniente es probar secuencias sgRNA prediseñado disponible públicamente, como el GeCKO v2 Ratón knockout piscina biblioteca15 del laboratorio de Zhang. Alternativamente, sgRNAs puede ser diseñado utilizando software público disponible como el siguiente sitio web: crispr.mit.edu. - Clon del sgRNAs en el vector de pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
Nota: El vector pU6-sgRNA-Cbh-Cre12 utilizado en este estudio se deriva de la original pX330 plásmido16 reemplazando la secuencia de codificación de SpCas9 con el recombinase de Cre .- Sintetizan como sigue dos oligos de ADN. Sentido: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisentido: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Nota: El 20 N de muestra sobre el soporte para la secuencia sgRNA. - PU6-sgRNA-Cbh-Cre con BbsI durante 30 min a 37 ° C utilizando los siguientes reactivos de digerir la muestra digerida a un gel de agarosa al 1% de la carga y purificarlos con el equipo de extracción de gel. Uso 3 μg plásmido; 3 μl Bbs. 1 μl FastAP; 5 μl 10 x buffer de digestión; Añadir ddH2O para llevar el volumen total de 50 μl.
- Fosforilan y templar cada par de oligos sgRNA utilizando los siguientes reactivos (volumen total de 10 μl): 1 μl modificado para requisitos particulares sentido oligo (100 mM); 1 μL para requisitos particulares oligo antisentido (100 mM); 1 μl de 10 x Buffer de la ligadura de T4; DdH de 6,5 μl2O; 0,5 ΜL T4 PNK. Incubar en un thermo cycler durante 30 min a 37 ° C y 5 min a 95 ° C y luego rampa hasta 25 ° C a 5 ° C por minuto.
- Configurar la reacción de la ligadura siguiente e incubar 10 min a temperatura ambiente (volumen total de 10 μl): X µL Bbsdigiere plásmido (50 ng); 1 μl fosforilados y recocido, oligo duplex (dilución 1: 200); 5 μl de 2 x buffer de la ligadura; X µL ddH2O; Ligasa rápida de 1 μl.
- Añadir 2 μl del producto de la ligadura en 50 μl de células químicamente competentes DH5α Escherichia coli . Después de 30 min de incubación en hielo, calor de choque la muestra de 90 s a 42 ° C e incubar por 2 min en hielo. Añada 100 μl de medio LB y placa sobre una placa de LB con ampicilina 100 de μg/mL.
Nota: La integración de la secuencia sgRNA en el plásmido de pU6-sgRNA-Cbh-Cre se realiza siguiendo los pasos de la clonación para el plásmido pX330 del14. - Inocular dos colonias, cada uno en 2 mL de medio LB a 37 ° C durante un mínimo de 6 h y realizar un aislamiento de ADN de mini-prep con el equipo.
- Sanger la secuencia de la DNA mini-prep utilizando la cartilla hU6-Forward y colonias se identifican con la correcta insercion de sgRNAs alineando con la secuencia mostrada en el paso 1.2.1. La secuencia de la cartilla se muestra en la tabla 1. Plásmidos utilizados en este estudio fueron nombrados pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre y pU6-sgControl-Cbh-Cre.
- Inocular las colonias correctamente identificados y purificar el endotoxina libre ADN plásmido para en el útero electroporación con el equipo, por ejemplo, de Qiagen. Eluir el ADN con endotoxina libre TE-Buffer diluido en ddH2O en 1:10 (10% buffer de TE). La concentración de ADN del plásmido debe ser superior a 2 mg/mL.
Nota: No utilice un kit de preparación para el maxi regular para la preparación de ADN. Plásmido-soluciones a 4 º C para uso a corto plazo regular (hasta 4 semanas), o parte alícuota un volumen adecuado de cerca de 25 μl y mantenerse a-20 ° C para almacenamiento a largo plazo.
- Sintetizan como sigue dos oligos de ADN. Sentido: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisentido: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. probar la eficiencia de la sgRNAs usando el sistema de plásmido EGxxFP
Nota: La eficacia de la sgRNAs normalmente es probada por topógrafo o T7E1 (endonucleasa T7 I) ensayos. En este protocolo, se utiliza una alternativa fácil y eficiente. La clave de este enfoque es usar el plásmido pCAG-EGxxFP que contiene fragmentos EGFP superpuestos separados por una secuencia de ADN que contienen lo sgRNA a sitio17. Sobre la expresión del pCAG-EGxxFP junto con los sgRNA Cas9 en las células transfected, se repara la rotura mediaron Cas9 doble cadena (DSB) en la secuencia de destino por mecanismos endógenos homología, que reconstituye la expresión de EGFP cassette.
- Diseño de cebadores para amplificar la región genomic centrada con el sgRNA dirigidas a secuencias. El amplicon PCR es aproximadamente de 500 bp. En este experimento, se aplicó un conjunto de ADN para clonar un fragmento de la polimerización en cadena-amplificada en el plásmido EGxxFP pCAG.
Nota: Alternativamente, sitios de restricción apropiado se pueden añadir en el extremo 5' de los cebadores PCR. Sitios de restricción disponibles en el vector EGxxFP pCAG son EcoRV, NheI, PstI, SalI, EcoRI y BamHI. - Amplificar el ADN genómico con cebadores diseñados con la forma y los parámetros de la polimerización en cadena a continuación. Carga de la muestra (19,7 μl de H2O; 0,3 μl de 10 ng/μl de ADN genómico de ratón; 2.5 μl 10 μm EGxxFP-Top2b-F; 2.5 μl 10 μm EGxxFP-Top2b-R; 25 μl 2 X master mix PCR, volumen total de 50 μL) en una agarosa 1% gel y gel-purificar los fragmentos PCR usando un kit de extracción de gel. Utilice la siguiente reacción condiciones: 95 ° C por 3 min; entonces 35 x los ciclos de 98 ° C por 20 s, 60 ° C durante 15 s, 72 ° C por 20 s y 72 ° C por 1 min; 4 ° C, por tiempo indefinido.
Nota: En este experimento, se amplificó una región en Top2b exón 1; encontrar las secuencias de la cartilla en la tabla 1. - Resumen de lo pCAG-EGxxFP vector con enzimas de restricción BamHI y EcoRI por 2 h a 37 ° C, luego carga la muestra en una agarosa al 1% gel y gel-purificar el eje vector usando un kit de extracción de gel. Usar los reactivos siguientes (volumen total de 50 μL): plásmido X µL (3 μg); 2 μl BamHI; 2 μl EcoRI; 5 μl 10 x Buffer; X µL ddH2O.
- Establecer la Asamblea de ADN reacción18 según las instrucciones del fabricante y transformar en competentes DH5α e. coli.
- Inocular dos colonias, cada uno en 2 mL de medio LB a 37 ° C durante un mínimo de 6 h, realizar un aislamiento de ADN de mini-prep con el equipo, por ejemplo, de Qiagen e identificar las colonias con la inserción correcta (en lo sucesivo como pCAG-por ejemplo-Top2b-FP) usando Sanger secuenciación con el primer EGxxFP-Top2b-F.
- Transfectar las células HEK293T.
- Células de semilla la HEK293T en una placa de 24 pocillos 24 h antes de transfección.
Nota: Las células fueron cultivadas en una incubadora de la célula de 37 ° C con 5% CO2, en DMEM con suplemento de glutamina que contiene 10% FBS y 1% penicilina/estreptomicina. Asegúrese de que las células son 60% confluente en el día de la transfección. En este experimento, utilizamos uno células HEK293T expresando estable SpCas9 probar pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Sin embargo, pueden utilizarse células HEK293T de tipo salvaje es siempre un vector de expresión de SpCas9. - Transfectar las células HEK293T usando el reactivo de polietilenimina (PEI). Transfectar las células con 120 ng/pozo de plásmido pCAG EG-Top2b-FP-12 y 120 ng/pozo de pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre o pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre en una placa de 24 pozos. Mezclar el plásmido DNAs y el 1.8 μl del reactivo de PEI en 80 μl de medio DMEM sin suplemento glutamina suplemento e incubar por 15 min a temperatura ambiente después de Vortex.
- 6 h después de la transfección, quitarlo del medio y reemplazar con medio fresco.
- Vigilar la presencia de células vivas de GFP+ 48 h después de transfección con un microscopio de fluorescencia con 20 aumentos.
Nota: El número de células GFP+ indica la eficiencia targeting de lo sgRNA. Resultados de sgRNAs eficaces y no eficaces (sgTop2b-1 y sgTop2b-2, respectivamente) se muestran en la figura 2A.
- Células de semilla la HEK293T en una placa de 24 pocillos 24 h antes de transfección.
3. realizar en el útero de electroporación
- Criar de 6 a 8 semanas de edad ratones y preparar las herramientas para la electroporación en el útero . Cruce macho homocigótico Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP ratones con ratones CD-1 femenino. Vez que el embarazo de los ratones CD-1 desde el día en que el enchufe vaginal es detectado (E0.5). Los embriones son electroporated en día E13.5.
- Tire de Capillares de vidrio de borosilicato (diámetro interior: 0.6-0.8 mm) con un extractor de la micropipeta. Utilice la siguiente configuración: P = 500, calor = 560, tire = 150, Vel = 75, tiempo = 250. Etiqueta de la punta del capilar con tinta negra para mejor visualización durante la inyección. Recortar el taper capilar bajo un estereomicroscopio utilizando una regla y afiladas agujas pinzas y recortar la punta en una longitud de unos 6 mm.
- Mantener la unidad de los capilares para mantener el experimento reproducible. Crear un borde biselado unilateral durante el ajuste. La punta debe estar tan afilada como sea posible para la fácil penetración de la pared uterina y evitar daño a los tejidos del embrión.
Nota: Como alternativa, use una amoladora micro para ajustar un ángulo de 35°19. Los capilares pueden almacenarse a temperatura ambiente en un plato de Petri en condiciones libres de patógenos de 10 cm. - Autoclave de los instrumentos quirúrgicos.
- Mezclar la sgRNA plásmidos en partes iguales con pT2K-IRES-Luc a una concentración final de al menos 1 μg/μl de cada plásmido y color la solución de plásmido con verde rápido (concentración final de 0.05%). Prepare solución 1% verde rápido con agua destilada libre de endotoxinas y el filtro a través de un filtro de 0,22 μm para eliminar las partículas de tinte de la solución.
Nota: La transfección de pT2K IRES-Luc es opcional, pero permite la identificación de animales de electroporated viables después del nacimiento, usando proyección de imagen de bioluminiscencia. Por favor consulte el paso 3.5. Prepare una cantidad suficiente de mezcla de plásmido por el número total de ratones embarazadas para ser operado. Utilizar sobre 15-20 μl de la mezcla por ratón (~ 12 embriones). Proceder de inmediato con la cirugía.
- Preparar ratones para la cirugía.
- Anestesiar embarazadas ratones CD-1 con isoflurano. Inducir la anestesia en una caja con 3-4 vol % isoflurano (flujo de oxígeno: 1,5 L/min) y mantener con 2 vol.% durante la cirugía mediante cono de nariz.
Nota: La cirugía completa no debe tardar más de 30 minutos reducir la cantidad de inyección y electroporated de embriones, si es necesario. Utilizar guantes estériles para cirugía. - Coloque el ratón sobre su espalda en una almohada y ajustar la anestesia.
- Inyectar analgésico (Metamizol, 800 mg/kg peso corporal, por vía subcutánea (s.c.), depósito de 24 h).
Nota: Puede utilizar otros analgésicos autorizados de Metamizol. - Aplique el ungüento de ojo para evitar la sequedad de ojo durante la cirugía.
- Fijar extremidades con cinta y esterilizar el abdomen con un desinfectante. Cubre el ratón con una gasa, dejando solamente el área quirúrgico expuesto. Etanol al 70% se separó sobre Gasa y área quirúrgica.
- Hacer una incisión en la piel de unos 2 cm de longitud y ensanchar la brecha suavemente con tijeras quirúrgicas rectas. Localizar la linea alba y hacer una segunda incisión ligeramente más pequeña a través del peritoneo utilizando tijeras con punta Roma.
- Humedecer la cavidad abdominal abierta con precalentado estéril 1 x PBS.
- Extraiga con cuidado los cuernos uterinos de la cavidad abdominal con unas pinzas de anillo. Tire suavemente por el acaparamiento de la pared uterina únicamente en el boquete entre los sacos de yema de huevo de dos embriones vecinos. Evitar cualquier presión sobre el embrión mientras se tira a través de la incisión. Ampliar la incisión si es necesario y tenga especial cuidado en la posición de los cuernos uterinos en el abdomen mientras no comprimir el flujo sanguíneo a través de la arteria uterina.
Nota: En algunos casos, se recomienda extraer un cuerno uterino en un momento y reemplácelo antes de continuar con el segundo cuerno uterino.
- Anestesiar embarazadas ratones CD-1 con isoflurano. Inducir la anestesia en una caja con 3-4 vol % isoflurano (flujo de oxígeno: 1,5 L/min) y mantener con 2 vol.% durante la cirugía mediante cono de nariz.
- Inyección y electroporación de plásmido DNAs
- Aspirar aproximadamente 15 μl de solución de plásmido coloreada con el vidrio preparado capilar. Evitar posibles burbujas de aire durante el proceso.
Nota: La solución de plásmido puede obstruir la punta fácilmente si su concentración es alta. Prueba del tubo capilar soltando algunas ADN justo antes de la inyección. - Suavemente Sujete el embrión con pinzas de anillo y localizar el área del cuello.
Nota: Si el embrión está en una posición difícil inyectar, saltarlo e ir para el próximo embrión. Mayor reposicionamiento del embrión puede aumentar las posibilidades de daño a ellos. - Perforar lentamente con la punta del capilar de vidrio previamente preparado en el cuarto ventrículo penetrando a través del cerebelo dorsal y posteriormente inyectar 1 μl de la mezcla de plásmido. Confirmar que el ADN teñido no es filtrado en el cerebro y es visible como un diamante en forma de estructura.
Nota: Como alternativa, utilizar 2,5 lupas para mejor visualización del cuarto ventrículo y que rodean los vasos sanguíneos. Entregar pulsos eléctricos inmediatamente después de la inyección para evitar la difusión de la solución de plásmido en los otros ventrículos. - Aplicar impulsos eléctricos cuadrados (5 pulsos, 32 mV, 50 ms en 950 ms-off) con pinzas-como pinzas de platino (véase Tabla de materiales). Coloque los electrodos lateralmente con el polo negativo que cubre la oreja y el polo positivo que se coloca en el primordio cerebeloso sobre la pared uterina. Utilizar placas de electrodo de 5 mm de diámetro para la electroporación eficaz de E13.5 embriones.
Nota: Aumentar la tasa de supervivencia de crías mediante la manipulación de menos de 2/3rd del número total de embriones por presa. Evitar demasiado cerca los embriones en el cuello uterino. Si manipula, puede causar complicaciones durante el parto y poner en peligro la camada entera. Si los electrodos están demasiado cerca del corazón del embrión, esto puede causar un paro cardíaco.
- Aspirar aproximadamente 15 μl de solución de plásmido coloreada con el vidrio preparado capilar. Evitar posibles burbujas de aire durante el proceso.
- Cuidado post cirugía y post-electroporación
- Coloque cuidadosamente los cuernos uterinos en la cavidad abdominal y se llenan previamente calentado estéril 1 x PBS. Deje que los cuernos uterinos se deslice en una posición natural.
- Cerrar el peritoneo y la piel por separado con una sutura continua simple.
Nota: Tenga cuidado extra para no perforar a través de la pared uterina al suturar el peritoneo. - Cierre la anestesia y el animal del vientre abajo dentro una jaula nueva.
- Vigilar el animal durante la fase de despertar y otra vez 24 horas después de la cirugía. Coloque la jaula bajo una lámpara de calefacción, si el temblor no mejora en un 15 min-marco de tiempo y el animal no se inicia la preparación.
- Confirman éxito electroporación por proyección de imagen de luciferasa.
- Asegúrese de que las presas operadas colocar embriones en tiempo (en E19.5).
Nota: La fecha de nacimiento se puede retrasar hasta el día siguiente probablemente debido a la operación. - Anestesiar los cachorros electroporated (P5-P7) con 2,5% de isoflurano e inyectar (intraperitoneal (i.p.)) con D-Luciferin (3 mg/kg de peso corporal) 5 minutos antes de la proyección de imagen.
- Detectar señales de luciferasa en los cachorros de electroporated usando el reproductor de imágenes de bioluminiscencia.
Nota: Un tiempo de exposición de 1 minuto es suficiente para detectar la señal de la luciferasa. Resplandor (p/s/cm2/sr) es aproximadamente > 1 x 106.
- Asegúrese de que las presas operadas colocar embriones en tiempo (en E19.5).
4. preparar Cryosections desde el cerebelo Electroporated
- Eutanasia a los cachorros de electroporated P7 y diseccionar a cerebelo.
Nota: La señal GFP puede observarse utilizando un estereoscopio epifluorescente. - Fijar el cerebelo durante la noche en 5 mL por cerebro 4% PFA en PBS a 4 ° C.
- Transferir el cerebelo fija durante la noche en 10 mL por cerebro de sacarosa al 30% en PBS a 4 ° C.
Nota: El tejido debe llegar a la parte inferior de un tubo de 15 mL después de la incubación en la solución de sacarosa. - Al absorber la solución de sacarosa restante con un trozo de papel de filtro de celulosa, sumerja el cerebelo en una temperatura óptima de corte (OCT) compuesto en un molde desechable de plástico y congele en hielo seco. El bloque criogénico puede almacenarse a-80 ° C hasta su uso.
Nota: El protocolo se puede detener aquí. - Cortar el bloque criogénico en secciones con 10 μm de espesor con un criostato y no las secciones a-80 ° C hasta su uso.
Nota: Uno puede confirmar la expresión de GFP en las secciones, después de lavar el OCT compuesto con PBS.
5. el Immunostaining de los Cryosections
- Seque el portaobjetos colocados por 30 min y lavar dos veces por 10 minutos en PBS.
- Las secciones del círculo con un lápiz líquido bloqueador e incubar las secciones en una solución de bloqueo (10% de suero normal de burro en PBS con un 0.1% Triton-X100) por 1 h a temperatura ambiente.
- Añadir anticuerpos primarios contra las moléculas de interés (e.g., GFP y topoisomerasa II beta (Top2B) en este estudio) en la solución de bloqueo e incubar durante la noche a 4 ° C.
Nota: Los nombres y las concentraciones de anticuerpos utilizados aparecen en la Tabla de materiales. Con el fin de mejorar las señales de la GFP, un anticuerpo anti-GFP puede utilizarse opcionalmente junto con los otros anticuerpos. - Lave los portaobjetos con 0,1% Triton-que contienen SAFT 3 X 10 min incubar las secciones por 1 h a temperatura ambiente con un anticuerpo secundario conjugado con fluoróforo diluido en la solución de bloqueo con DAPI.
- Lavar los portaobjetos en PBS 3 X 10 min Monte las diapositivas y mantener a 4 ° C hasta la proyección de imagen.
Nota: El protocolo se puede detener aquí.
6. la proyección de imagen y análisis
- Imágenes de las secciones usando un microscopio confocal con 20 aumentos.
- Contar el número de células positivas de GFP perdiendo la expresión de la proteína diana. En la figura 2Bse muestra una imagen representativa.
- Compruebe el fenotipo molecular sobre la ablación de los genes diana en el PNB y sus progenies de immuostaining12.
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Representative Results
Para en vivo análisis funcional, es crítico para identificar las células en las que se han introducido genes exógenos. Mientras que la expresión de un marcador, tal como GFP en células no proliferantes puede ser objeto de seguimiento durante un largo periodo de tiempo, la señal secuencialmente se pierde en las células proliferantes. Una ilustración de este efecto se demuestra en la figura 1. Para evitar perder la huella de células transfected en análisis LOF, hemos desarrollado un nuevo enfoque mediante la combinación de genes basada en la electroporación con la tecnología CRISPR/Cas9.
Resultados representativos se muestran en la figura 2. Funcionalidad de las construcciones de plásmido es probado por los transitorios de la transfección de pU6-sgTop2b-Cbh-Cre y pCAG-por ejemplo-Top2b-FP17, llevando la secuencia de destino sgTop2b, en HEK293T células expresando estable SpCas9 (figura 2A). La actividad de endonucleasa Cas9 sgRNA-dirigida induce mediada por OSD dirigida por homología reparación del casete de expresión de EGFP. Por lo tanto, la función de lo sgRNA se analizó directamente por la detección de expresión de GFP. Según Mashiko et al., una eficacia de transfección de más del 30% determina un sgRNA como eficaz17.
PNB se origina en el labio rómbico (RL), una región fronteriza con el techo del cuarto ventrículo en etapas embrionarias E12.5 hasta E16.5. Estas células se han sabido para experimentar la proliferación masiva después del nacimiento en la capa externa del gránulo externos (oEGL) y cambio hacia el interior EGL (iEGL) después de salir del ciclo celular20. Así, el PNB es un ejemplo apropiado para probar las ventajas de nuestro enfoque etiquetado genética.
Siguiendo este protocolo, en el útero la electroporación de PNB permite rastreo de células editadas con GFP. Hemos introducido el plásmido pU6-sgRNA-Cbh-Cre que sgControl en el primordio cerebeloso de ratones Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP en fase embrionaria E13.5. Ratones fueron sacrificados en el día postnatal P7, y sagitales secciones de secciones de tejido cerebeloso fueron manchadas por immunohistochemistry. EGL externa e interna fueron definidas por la expresión de Ki67 (oEGL) y la expresión de p27 (iEGL), respectivamente. A pesar de someterse a una proliferación y maduración, las neuronas maduras gránulo cerebeloso (CGNs) todavía conservan fuerte expresión de GFP (figura 2B).
Haciendo hincapié en la utilidad de este protocolo, además utilizamos lo sgRNA targeting Top2b ADN como un ejemplo representativo. Procedimientos experimentales se realizaron como se describe anteriormente (ver figura 2B). La mayoría de las células GFP-positivas transfectadas con sgRNAs para Top2b exhibió una pérdida de expresión Top2b en la capa interna del gránulo (IGL), mientras que la introducción de control sgRNAs no produjo una reducción clara de su expresión (figura 2). Una cuantificación de este resultado se muestra en la Figura 2D. Estos datos presentan una valiosa herramienta para rastrear las células editadas durante un largo periodo de tiempo durante el desarrollo o tumor formación.
Figura 1: representación esquemática de la expresión de GFP en células proliferantes y no proliferación. (A) cuando un gen exógeno que codificación GFP (p. ej., EGFP pCAG) es transfected en las células no proliferantes, las células puede expresar GFP durante mucho tiempo (carril superior). Mientras tanto, podría desaparecer expresión de GFP en células proliferantes debido a la dilución de exógeno GFP (carril central). En contraste, las células que portan el transgen LoxP-parada-LoxP-GFP (GFP LSL) pueden mantener la expresión de GFP en proliferación después de transfección con recombinase de Cre (carril inferior). Cepa de ratón (B) el principio de silenciamiento génico mediado SpCas9 y expresión de GFP después de Cre y sgRNA transfección en un Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imágenes representativas de los resultados de este protocolo de. (A) HEK293T células expresando estable SpCas9 fueron transfectadas con plásmidos pU6-sgTop2b-Cbh-Cre y pCAG-por ejemplo-Top2b-FP. Expresión de GFP en células vivas fue monitoreado mediante un sensor fluorescente de la célula (véase Tabla de materiales) 48 h después de transfección. Paneles izquierdos y derecho muestran una secuencia sgRNA eficaz y no eficaz basada en la expresión de GFP, respectivamente. Barras de escala: 100 μm. (B) Immunostaining de GFP, Ki67 y p27 en el cerebelo de P7 de un ratón Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP sometidos a electroporación en E13.5 con plásmido pU6-sgRNA-Cbh-Cre construcciones expresando control sgRNA. La sección es contratinción con DAPI (azul). Barras de escala: 50 μm; 20 aumentos. Tenga en cuenta las células GFP-expresando en oEGL marcada por Ki67. (C) Immunostaining de GFP (green) y Top2b (magenta) en el cerebelo de P7 de un ratón Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP que fue electroporated en E13.5 con plásmido pU6-sgRNA-Cbh-Cre construye sgRNA expresando contra Top2b (sgTop2b) y un secuencia de control (sgControl). Las flechas indican Top2b expresión en células GFP+ en el mismo campo. Barras de escala: 20 μm; 20 aumentos. (D) cuantificación de Top2b en células electroporated (GFP-positivas) en experimentos de sgControl y sgTop2b. Cachorros de dos y tres fueron investigados para sgControl y sgTop2b, respectivamente, y se analizaron 25 celdas de cada cerebro. Barras de error representan ± error estándar de la media (SEM) y p-los valores se calcularon por impar t-prueba, *p = 0.0002. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Nombre | Secuencia de | Aplicación | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | secuencia de destino sgRNA | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | secuencia de destino sgRNA | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | secuencia de destino sgRNA | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Clonación en pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Clonación en pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Secuencia para sgRNA | |
Tabla 1: Secuencias de oligos se utiliza en este estudio.
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Discussion
Mediante electroporación de exo el útero , previamente hemos informado siRNA basado en vivo análisis funcionales de Atoh1 en una etapa temprana del gránulo cerebeloso de la célula diferenciación8. Debido a la disolución o degradación del siRNA y la exposición de embriones fuera de la pared uterina, análisis fenotípico de las células del gránulo de electroporated se limitaba a estadios embrionarios. Sin embargo, el método actual permitieron el análisis del fenotipo de animales postnatales.
Nuestro estudio anterior demostró mediaron Cas9 nocaut de tumor supresor Ptch1 via en el útero el meduloblastoma de electroporación inducida con éxito2. En comparación, el enfoque actual presenta dos ventajas importantes: 1) Cas9 no debe entregarse con el plásmido, permitiendo múltiples gene targeting por llevar casetes de expresión sgRNA múltiples en un único plásmido. y 2) las células diana y sus progenies están permanentemente marcados con GFP, lo que permite la visualización de las células vivas y análisis del comportamiento de la transformación tumoral de las células in vivo.
Los pasos más críticos de este protocolo son la inyección correcta del plásmido DNAs en la ubicación correcta y el envío de impulsos eléctricos en los lugares apropiados en el cerebro. Neuronas cerebelosas nacen el neuroepitelio cerebelosa secuencialmente en una forma dependiente de la fecha de nacimiento. No todos los tipos de células en el primordio cerebeloso pueden orientarse mediante electroporación, porque sólo una ventana de tiempo específica en E12.5 14.5 es técnicamente factible. Las neuronas de los núcleos cerebelosos profundos y las células de Purkinje se sabe que ocurren en E10.5-11.5, cuando las membranas extra embrionarias no son transparentes, y el embrión no es visible para la inyección de ADN. Más tarde, las células unipolares del cepillo se derivan E17.5 RL superior (uRL), cuando el cuarto ventrículo es demasiado estrecho para inyectar una cantidad suficiente de ADN en las cercanías de la uRL. Así, nuestro método es sólo aplicable en E12.5-14.5, que apunta principalmente a mediados - y posteriores-nacido de progenitores, SPNG como interneuronas inhibitorias. Otro inconveniente del método es que un fenotipo completo octavos de final puede no ser factible en comparación con germline Cre/LoxP-mediada GEMMs, puesto que sólo miles de células cerebelosas pueden orientarse por electroporación en cada embrión.
En un estudio anterior, aproximadamente el 80% del gránulo cerebeloso GFP-positivas las células pierden expresión del gen objetivo12. Mientras que la identidad de las células del gránulo fue confirmada por marcadores moleculares y su distribución, este método de identificación puede no ser siempre aplicable, como genes de interés podrían estar implicados en la expresión del marcador y la migración neuronal. Activación condicional de Cre usando un promotor específico de célula resolvería el problema en este caso. Por lo tanto, el actual promotor de Cbh omnipresente en el plásmido de pU6-sgRNA-Cbh-Cre puede reemplazarse con un promotor específico de célula.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim y Petra Schroeter para asistencia técnica. También agradecemos a los Drs. K. Reifenberg, Prückl P. y K. Dell ayuda útil para los experimentos con animales en el DKFZ; la imagen núcleo instalaciones del DKFZ y el centro de la proyección de imagen de Carl Zeiss en el DKFZ proyección de imagen de microscopía confocal. Este trabajo fue financiado por la Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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