Summary
Studi convenzionali di perdita di funzione di geni mediante animali knockout sono stati spesso lunghe e costose. Basato su elettroporazione mutagenesi somatica CRISPR-mediata è un potente strumento per capire il gene funziona in vivo. Qui, segnaliamo un metodo per analizzare i fenotipi di knockout in cellule di proliferazione del cervelletto.
Abstract
Malformazione del cervello è spesso causato da mutazioni genetiche. Decifrare le mutazioni in tessuti derivati dal paziente ha identificato potenziali fattori causali delle malattie. Per convalidare il contributo di una disfunzione dei geni mutati per lo sviluppo della malattia, la generazione di modelli animali che trasportano le mutazioni è un approccio più ovvio. Mentre germline geneticamente modelli murini (GEMM) sono popolari strumenti biologici e mostrano risultati riproducibili, è limitato dal tempo e costi. Nel frattempo, non di germline GEMM consentono spesso esplorare funzione del gene in un modo più fattibile. Poiché alcuni cervello malattie (ad es., tumori cerebrali) sembrano derivare da somatico ma non le mutazioni di germline, modelli di topi chimerici non germinale, in cui convivono le cellule normali e anormali, potrebbero essere utile per analisi rilevanti per la malattia. In questo studio, segnaliamo un metodo per l'induzione di mutazioni somatiche CRISPR-mediata nel cervelletto. In particolare, abbiamo utilizzato il condizionali topi knock-in, in cui Cas9 e GFP sono cronicamente attivati dal promotore CAG (CMV enhancer/pollo ß-actina) dopo Cre-mediata ricombinazione del genoma. La singolo-guida auto-progettata RNAs (sgRNAs) e la sequenza di Cre ricombinasi, sia codificato in un plasmide singolo costrutto, sono stati consegnati in cellule staminali/progenitrici cerebellari in una fase embrionale usando l'elettroporazione nell'utero . Di conseguenza, cellule trasfettate e loro cellule della figlia sono stati etichettati con la proteina fluorescente verde (GFP), facilitando così ulteriori analisi fenotipiche. Quindi, questo metodo è non solo risultati basati su elettroporazione genico in cellule embrionali cerebellare ma anche proponendo un nuovo approccio quantitativo per valutare CRISPR-mediata di fenotipi di perdita-de-funzione.
Introduction
Malattie del cervello sono una delle più terribili malattie mortali. Risultano spesso dalle mutazioni genetiche e disregolazione successive. Per comprendere i meccanismi molecolari delle malattie del cervello, perenne sforzi per decifrare il genoma dei pazienti umani hanno scoperto una serie di geni causativi potenziali. Finora, sono stati utilizzati modelli animali geneticamente costruiti di germline per in vivo guadagno di funzione (GOF) e perdita di funzione (LOF) analisi di tali geni candidati. Dovuto lo sviluppo accelerato di studi di validazione funzionale, è auspicabile un più fattibile e flessibile in vivo gene sistema di analisi per lo studio della funzione genica.
L'applicazione di un sistema di trasferimento del gene basati su elettroporazione in vivo per lo sviluppo del cervello del mouse è adatto allo scopo. Infatti, parecchi studi usando l'elettroporazione in utero hanno indicato il loro potenziale per condurre analisi funzionali nel cervello in via di sviluppo1,2,3. In realtà, diverse regioni del cervello del mouse, come la corteccia cerebrale4, retina5, diencefalo6, hindbrain7, cervelletto8e del midollo spinale9 stati presi di mira dalla consegna genica somatica approcci, finora.
Infatti, l'espressione genica transitoria mediante elettroporazione in vivo su cervelli embrionali del mouse lungo è stato usato per analisi GOF. Recenti tecnologie di integrazione genomica basata su trasposone ulteriormente abilitata a lungo termine e/o condizionale espressione dei geni di interesse10,11, che è vantaggioso per sezionare la funzione del gene in modo spaziale e temporale durante sviluppo. In contrasto con analisi GOF, analisi LOF sono stato più impegnativo. Mentre è stata eseguita la trasfezione transiente di siRNA e che trasportano shRNA plasmidi, effetti a lungo termine di LOF di geni non sono garantiti a causa di eventuale degradazione degli acidi nucleici esogenicamente introdotti, quali plasmidi e dsRNA. Tuttavia, la tecnologia CRISPR/Cas fornisce un'innovazione nelle analisi di LOF. Geni codificanti proteine fluorescenti (ad es., GFP) o bioluminescente proteine (ad es., luciferasi firefly) sono stato co-trasfettati con CRISPR-Cas9 e sgRNAs di etichettare le cellule esposte a mutazioni somatiche CRISPR-Cas9-mediata. Tuttavia, questo approccio potrebbe avere limitazioni negli studi funzionali su cellule proliferanti, poiché i geni marcatori esogeni sono diluiti e degradati dopo proliferazione a lungo termine. Mentre le cellule trasfettate e loro cellule figlie subiscono CRISPR-indotto mutazioni nel loro genoma, le loro impronte potrebbero perdersi nel tempo. Così, approcci genetici etichettatura sarebbe adatti per superare questo problema.
Recentemente abbiamo sviluppato un metodo basato su CRISPR LOF in cellule cerebellari del granello che subiscono a lungo termine proliferazione durante la loro differenziazione12. Per etichettare geneticamente le cellule transfettate, abbiamo costruito un plasmide che trasportano un sgRNA insieme a Cre e introdusse il plasmide cervelletti di Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP topi13 usando l'elettroporazione nell'utero . A differenza di vettori del plasmide regolare codifica EGFP, questo approccio correttamente etichettato trasfettato granello precursori del neurone (PNL) e loro cellule della figlia. Questo metodo fornisce grande sostegno nella comprensione in vivo funzione dei geni di interesse in cellule proliferanti nello sviluppo normale del cervello e uno sfondo tumore-incline.
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Protocol
Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati condotti secondo norme sul benessere degli animali e sono stati approvati dalle autorità competenti (Regierungspräsidium Karlsruhe, i numeri di omologazione: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14 e 14/G133).
1. generare plasmidi pU6-sgRNA-Cbh-Cre
- Progettare il sgRNA per indirizzare un gene di interesse secondo il protocollo precedentemente pubblicati14.
Nota: In questo esperimento, due sgRNAs sono progettati per indirizzare il gene Top2b del mouse e un controllo non mirati sgRNA (tabella 1). Di geni knockout utilizzando la tecnologia CRISPR, sgRNAs bisogno di essere progettato per essere destinati la sequenza codificante della regione 5' o il dominio funzionale essenziale della proteina. Un comodo punto di partenza è di testare pubblicamente disponibile pre-progettati sgRNA sequenze, come il GeCKO v2 topo knockout piscina biblioteca15 dal laboratorio Zhang. In alternativa, sgRNAs può essere progettato utilizzando software pubbliche disponibili come ad esempio il seguente sito Web: crispr.mit.edu. - Clonare il sgRNAs nel vettore pU6-sgRNA-Cbh-Cre.
Nota: pU6-sgRNA-Cbh-Cre vettoriale12 utilizzato in questo studio è derivata dall'originale pX330 plasmide16 sostituendo la sequenza codificante di SpCas9 con la ricombinasi Cre .- Sintetizzare due DNA oligos come segue. Senso: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisenso: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
Nota: 20 N di riportati sopra stand per la sequenza di sgRNA. - Digerire pU6-sgRNA-Cbh-Cre con BbsI per 30 min a 37 ° C, utilizzando i seguenti reagenti, caricare il campione digerito da un gel di agarosio all'1% e purificarle utilizzando un kit di estrazione del gel. Uso 3 µ g plasmide; 3 µ l BbsI; 1 µ l FastAP; 5 µ l 10 x buffer di digestione; aggiungere ddH2O per portare il volume totale di 50 µ l.
- Fosforilare e tempri ogni coppia di sgRNA oligos usando i seguenti reagenti (10 µ l di volume totale): 1 µ l su misura senso oligo (100 mM); 1 µ l su misura oligo antisenso (100 mM); 1 µ l 10 x T4 legatura Buffer; µ L 6,5 ddH2O; 0,5 Μ L T4 PNK. Incubare in un termo-cycler per 30 min a 37 ° C e 5 min a 95 ° C e poi la rampa fino a 25 ° C a 5 ° C/min.
- Impostare la seguente reazione di legatura e incubare per 10 minuti a temperatura ambiente (10 µ l di volume totale): X µL Bbsho digerito plasmide (50 ng); 1 µ l fosforilato e ricotto, oligo duplex (diluizione 1: 200); 5 µ l 2 x buffer di legatura; X µL ddH2O; Ligasi rapido di 1 µ l.
- Aggiungere 2 µ l di prodotto legatura in 50 µ l di cellule DH5α Escherichia coli chimicamente competenti. Dopo 30 min di incubazione in ghiaccio, calore shock il campione per 90 s a 42 ° C ed incubare per 2 min sul ghiaccio. Aggiungere 100 µ l di terreno LB e piatto si su un piatto LB contenente ampicillina di 100 µ g/mL.
Nota: L'integrazione della sequenza sgRNA nel plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre è effettuata secondo la procedura di clonazione per il plasmide pX33014. - Inoculare due colonie, ciascuno in 2 mL di terreno LB a 37 ° C per un minimo di 6 h ed eseguire un isolamento di DNA mini-prep utilizzando un kit.
- Sanger sequenza DNA mini-prep utilizzando il primer hU6-Forward e identificare le colonie con il corretto inserimento di sgRNAs allineando con la sequenza indicata al punto 1.2.1. Sequenza del primer è mostrata nella tabella 1. Plasmidi utilizzati in questo studio sono stati denominati pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre e pU6-sgControl-Cbh-Cre.
- Inoculare le colonie correttamente identificato e purificare il plasmide privo di endotossina DNA per elettroporazione nell'utero utilizzando un kit, ad esempio, da Qiagen. Eluire il DNA con TE-amplificatore senza endotossina diluito in ddH2O alle 01:10 (10% buffer di TE). La concentrazione di DNA del plasmide deve essere superiore a 2 mg/mL.
Nota: Non utilizzare un normale maxi-prep kit per la preparazione di DNA. Plasmide-soluzioni a 4 ° C per uso regolare a breve termine (fino a 4 settimane), o aliquota magazzini un volume adeguato di circa 25 µ l e conservare a-20 ° C per la conservazione a lungo termine.
- Sintetizzare due DNA oligos come segue. Senso: 5' - CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN - 3'; Antisenso: 3' - CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA - 5'.
2. testare l'efficienza di sgRNAs utilizzando il sistema di plasmide EGxxFP
Nota: L'efficienza del sgRNAs normalmente è controllata da geometra o T7E1 (T7 endonucleasi io) saggi. In questo protocollo, viene utilizzato un approccio alternativo facile ed efficiente. La chiave di questo approccio consiste nell'utilizzare il plasmide pCAG-EGxxFP che contiene frammenti EGFP sovrapposti separati da una sequenza di DNA contenente il sgRNA targeting per sito17. Al momento l'espressione di pCAG-EGxxFP insieme alla sgRNA e Cas9 in cellule transfected, la rottura di Cas9-mediata doppio filamento (DSB) nella sequenza di destinazione viene riparata da meccanismi endogeni di omologia-dipendente, che ricostituisce l'espressione di EGFP cassetta.
- Disegnare primers per amplificare la regione genomica centrata con il sgRNA sequenze di targeting. L'amplicone PCR è di circa 500 bp. In questo esperimento, un assemblaggio di DNA è stato applicato per clonare un frammento di PCR-amplificato nel plasmide pCAG-EGxxFP.
Nota: In alternativa, siti di restrizione appropriato possono essere aggiunto all'estremità 5' degli iniettori PCR. Siti di restrizione disponibile nel vettore pCAG-EGxxFP sono BamHI, NheI, PstI, SalI, EcoRI ed EcoRV. - Amplificare il DNA genomico con primer progettato utilizzando il formato e i parametri PCR qui sotto. Caricare l'esempio (19,7 µ l H2O; 0,3 µ l di 10 ng / µ l del mouse DNA genomico; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-F; 2,5 µ l 10 µM EGxxFP-Top2b-R; 25 µ l 2 X mix master PCR; 50 µ l di volume totale) su un 1% di agarosio gel e gel-purificare i frammenti PCR utilizzando un kit di estrazione del gel. Utilizzare il seguente reazione condizioni: 95 ° C per 3 min; quindi 35 x cicli di 98 ° C per 20 s, 60 ° C per 15 s, 72 ° C per 20 s e 72 ° C per 1 min; 4 ° C, a tempo indeterminato.
Nota: In questo esperimento, una regione in essone Top2b 1 è stata amplificata; trovare le sequenze dell'iniettore nella tabella 1. - Digest è il vettore di pCAG-EGxxFP con enzimi di restrizione BamHI ed EcoRI per 2 h a 37 ° C, quindi caricare l'esempio su un 1% di agarosio gel e gel-purificare la spina dorsale di vettore utilizzando un kit di estrazione del gel. Utilizzare i seguenti reagenti (volume totale di 50 µ l): X µL plasmide (3 µ g); BamHI 2 µ l; EcoRI 2 µ l; 5 µ l 10 x Buffer; X µL ddH2O.
- Impostare il DNA Assemblea reazione18 secondo le istruzioni del fabbricante e trasformate in DH5α competente e. coli.
- Inoculare due colonie, ogni in 2 mL di LB medium a 37 ° C per un minimo di 6 h, eseguire un isolamento di DNA mini-prep utilizzando un kit, ad esempio, da Qiagen e identificare le colonie con il corretto inserimento (in appresso pCAG-EG-Top2b-FP) utilizzando Sanger sequenziamento con il primer di EGxxFP-Top2b-F.
- Transfect HEK293T cellule.
- Celle di seme il HEK293T in una piastra a 24 pozzetti 24 h prima di transfezione.
Nota: Le cellule sono state coltivate in un incubatore a 37 ° C delle cellule con 5% CO2, in DMEM con integratore di glutammina contenente 10% FBS e 1% penicillina/streptomicina. Assicurarsi che le celle siano 60% confluenti il giorno della transfezione. In questo esperimento, abbiamo usato il self-made HEK293T cellule che esprimono stabilmente SpCas9 per testare pU6-sgRNA-Cbh-Cre. Tuttavia, wildtype HEK293T cellule possono essere utilizzate se non viene fornito un vettore di espressione SpCas9. - Transfect le cellule HEK293T utilizzando il reagente polyethylenimine (PEI). Transfect le cellule con 120 ng/pozzetto di plasmide pCAG-EG-Top2b-FP12 e 120 ng/pozzetto di pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre o pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre in una piastra a 24 pozzetti. Mescolare il plasmide DNAs e il 1,8 µ l di reagente di PEI in 80 µ l di DMEM senza aggiunte con glutamina supplemento e incubare per 15 min a temperatura ambiente dopo nel Vortex.
- 6 ore dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo e sostituirli con medium fresco.
- Monitorare la presenza di cellule GFP+ vive 48 ore dopo la trasfezione usando un microscopio a fluorescenza a 20 ingrandimenti.
Nota: Il numero di cellule GFP+ indica l'efficienza targeting della sgRNA. Risultati di sgRNAs efficace e non efficace (sgTop2b-1 e sgTop2b-2, rispettivamente) sono mostrati nella Figura 2A.
- Celle di seme il HEK293T in una piastra a 24 pozzetti 24 h prima di transfezione.
3. eseguire nell'Utero elettroporazione
- 6 a 8-settimana-vecchi topi di razza e predisporre gli strumenti nell'utero elettroporazione. Croce uomo omozigotica Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP topi con i topi femminili CD-1. Ora la gravidanza dei topi CD-1 dal giorno che il plug vaginale è rilevato (0.5). Gli embrioni sono individulamente al giorno E13.5.
- Tirare tubi capillari in vetro borosilicato (diametro interno: 0,6-0,8 mm) con un estrattore micropipetta. Utilizzare le seguenti impostazioni: P = 500, calore = 560, Pull = 150, Vel = 75, tempo = 250. Etichettare la punta capillare con inchiostro nero per una migliore visualizzazione durante l'iniezione. Taglia il cono capillare sotto un microscopio stereoscopico utilizzando un righello e tagliente dell'ago pinzette e taglia la punta ad una lunghezza di circa 6 mm.
- Mantenere l'unità dei capillari per mantenere l'esperimento riproducibile. Creare un bordo smussato su un solo lato durante l'operazione di taglio. La punta deve essere tagliente come possibile per una facile penetrazione della parete uterina e per evitare danni ai tessuti dell'embrione.
Nota: In alternativa, utilizzare una smerigliatrice per regolare un angolo di 35°19. I capillari possono essere conservati a temperatura ambiente in un 10cm di Petri in condizioni esenti da patogeni. - Autoclave gli strumenti chirurgici.
- Mescolare i plasmidi sgRNA in parti uguali con pT2K-IRES-Luc a una concentrazione finale di almeno 1 µ g / µ l per ogni plasmide e colore il plasmide-soluzione con veloce verde (concentrazione finale di 0.05%). Preparare soluzione 1% veloce verde con acqua distillata priva di endotossina e filtro attraverso un filtro da 0,22 µm per rimuovere le particelle di colorante dalla soluzione.
Nota: Co-transfezione di pT2K IRES-Luc è facoltativa, ma consente per l'identificazione degli animali individulamente praticabile dopo la nascita facendo uso di imaging di bioluminescenza. Vedi prego punto 3.5. Preparare una quantità sufficiente di plasmide-mix per il numero totale di topi incinto per essere operati. Utilizzare circa 15-20 µ l mescolare per topo (~ 12 embrioni). Procedere immediatamente con l'intervento chirurgico.
- Preparare topi per la chirurgia.
- Anestetizzare i topi CD-1 incinto con isoflurano. Indurre l'anestesia in una scatola con 3-4% vol isoflurano (portata di ossigeno: 1,5 L/min) e mantenerla con 2 vol-% durante chirurgia via cono di naso.
Nota: L'ambulatorio completo non dovrebbe richiedere più di 30 min. ridurre il numero di iniettato e individulamente embrioni, se necessario. Utilizzare guanti sterili per la chirurgia. - Posizionare il mouse sulla relativa parte posteriore su una piastra elettrica e regolare l'anestesia.
- Iniettare analgesico (Metamizol, 800 mg/kg di peso corporeo, per via sottocutanea (s.c.), deposito di 24 h).
Nota: È possibile utilizzare altri analgesici autorizzati di Metamizol. - Applicare unguento oculare per evitare secchezza dell'occhio durante l'intervento chirurgico.
- Difficoltà membra con nastro e sterilizzare l'addome con un disinfettante. Coprire il mouse con una garza, lasciando solo l'area chirurgica esposto. Sviluppa etanolo al 70% su garza e area chirurgica.
- Fare un'incisione della pelle di circa 2 cm di lunghezza e ampliare il divario delicatamente con le forbici chirurgiche dritto. Individuare la linea alba e fare una seconda incisione leggermente più piccola attraverso il peritoneo usando il tessuto forbici con la punta smussata.
- Inumidire la cavità addominale aperta con pre-riscaldato sterile 1 x PBS.
- Estrarre delicatamente i corni uterini dalla cavità addominale utilizzando pinze anello. Tirare delicatamente afferrando la parete uterina esclusivamente presso il divario tra sac di tuorlo di due embrioni vicini. Evitare qualsiasi pressione sull'embrione mentre tirandola attraverso l'incisione. Ingrandire l'incisione se necessario e prendere la cura supplementare per posizionare i corni uterini sull'addome comprimendo non flusso di sangue attraverso l'arteria uterina.
Nota: In alcuni casi, si consiglia di estrarre un corno uterino alla volta e sostituirlo prima di procedere con il secondo corno uterino.
- Anestetizzare i topi CD-1 incinto con isoflurano. Indurre l'anestesia in una scatola con 3-4% vol isoflurano (portata di ossigeno: 1,5 L/min) e mantenerla con 2 vol-% durante chirurgia via cono di naso.
- Iniezione ed elettroporazione del plasmide DNAs
- Aspirare circa 15 µ l di plasmide-soluzione colorata con il capillare di vetro preparato. Evitare eventuali bolle d'aria durante questo processo.
Nota: La soluzione di plasmide possa ostruire la punta facilmente se la sua concentrazione è alta. Testare il capillare rilasciando alcuni DNA proprio prima dell'iniezione. - Delicatamente, tenere l'embrione con una pinza anello e individuare la zona del collo.
Nota: Se l'embrione è in una posizione difficile da iniettare, saltarla e passare per l'embrione successivo. Riposizionamento aumentata dell'embrione può aumentare la probabilità di danno a loro. - Pierce con la punta del vetro precedentemente preparato capillare nel quarto ventricolo penetrando attraverso la dorsale hindbrain e successivamente iniettare lentamente circa 1 µ l del plasmide-mix. Confermare che il DNA tinto non è trapelato dal cervello e che è visibile come un diamante a forma di struttura.
Nota: In alternativa, utilizzare 2,5 volte lenti di ingrandimento per una migliore visualizzazione del quarto ventricolo e che circondano i vasi sanguigni. Fornire impulsi elettrici immediatamente dopo l'iniezione per prevenire la diffusione della plasmide-soluzione ai altri ventricoli. - Applicare elettrici impulsi quadrati (5 impulsi, 32 mV, 50 ms-su, 950 ms-off) con forcipe-come pinzette platino (Vedi Tabella materiali). Posizionare gli elettrodi lateralmente con il polo negativo che copre l'orecchio e il polo positivo posizionato presso il primordio cerebellare sulla parete uterina. Utilizzare elettrodi di 5 mm di diametro per elettroporazione efficace degli embrioni E13.5.
Nota: Aumentare il tasso di sopravvivenza dei cuccioli manipolando meno di 2/3rd del numero totale di embrioni per diga. Evitare gli embrioni troppo vicino alla cervice. Se manipolato, potrebbero causare complicazioni durante il travaglio e compromettere l'intera cucciolata. Se gli elettrodi sono troppo vicino al cuore dell'embrione, questo può causare arresto cardiaco.
- Aspirare circa 15 µ l di plasmide-soluzione colorata con il capillare di vetro preparato. Evitare eventuali bolle d'aria durante questo processo.
- Cura post-chirurgia e post-elettroporazione
- Posizionare con attenzione i corni uterini indietro nella cavità addominale e riempimento con pre-riscaldati sterile 1 x PBS. Far scorrere il corni uterini in una posizione naturale.
- Chiudere il peritoneo e pelle separatamente con una semplice sutura continua.
Nota: Prestare particolare attenzione a non perforare la parete uterina durante la sutura del peritoneo. - Spegnere l'anestesia e posto l'animale a pancia in giù in una nuova gabbia.
- Monitorare l'animale durante la fase di risveglio e ancora 24 h dopo l'intervento chirurgico. Posizionare la gabbia sotto una lampada di riscaldamento, se il tremore non migliora entro un tempo 15 min e l'animale non inizia a governare.
- Confermare l'elettroporazione successo da formazione immagine luciferasi.
- Assicurarsi che le dighe funzionate cadere gli embrioni in tempo (a e 19.5).
Nota: La data di nascita può essere differita al giorno successivo probabilmente a causa dell'operazione. - Anestetizzare i cuccioli individulamente (P5-P7) con 2,5% isoflurane e iniettare (intraperitoneale (i.p.)) con D-luciferina (3 mg/kg di peso corporeo) 5 min prima di formazione immagine.
- Rilevare i segnali di luciferasi in cuccioli individulamente utilizzando il dispositivo di imaging di bioluminescenza.
Nota: Un tempo di esposizione di 1 min è sufficiente per rilevare il segnale della luciferasi. Radiance (p/s/cm2/sr) è circa > 1 x 106.
- Assicurarsi che le dighe funzionate cadere gli embrioni in tempo (a e 19.5).
4. preparare Cryosections dai cervelletti individulamente
- I cuccioli di P7 individulamente di eutanasia e sezionare il cervelletto.
Nota: Il segnale GFP può essere osservato utilizzando un stereoscopio epifluorescente. - Difficoltà durante la notte i cervelletti in 5 mL al cervello del 4% PFA in PBS a 4 ° C.
- Trasferire i cervelletti fissi pernottamento in 10 mL al cervello di saccarosio al 30% in PBS a 4 ° C.
Nota: Il tessuto dovrebbe raggiungere il fondo di una provetta 15 mL dopo incubazione della soluzione di saccarosio. - Dopo l'immersione della soluzione di saccarosio rimanenti con un pezzo di carta da filtro cellulosa, immergere il cervelletto in una temperatura ottimale di taglio (OCT), composto in uno stampo di plastica usa e getta e congelare il ghiaccio secco. Il blocco criogenico possa essere memorizzato a-80 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui. - Tagliare il blocco criogenico in sezioni con 10 µm di spessore utilizzando un criostato e mantenere le sezioni a-80 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Si può confermare l'espressione della GFP nelle sezioni, dopo il lavaggio fuori l'OCT composto con PBS.
5. Immunostaining della Cryosections
- Asciugare i vetrini a temperatura per 30 min e lavare due volte per 10 min in PBS.
- Le sezioni del cerchio con una penna di liquido bloccante e incubare le sezioni in una soluzione bloccante (10% di siero normale asino in PBS contenente 0,1% Triton-X100) per 1 h a temperatura ambiente.
- Aggiungere gli anticorpi primari contro le molecole di interesse (ad es., GFP e topoisomerasi II beta (Top2B) in questo studio) nella soluzione di blocco e incubare per una notte a 4 ° C.
Nota: I nomi e le concentrazioni di anticorpi utilizzati sono elencate nella Tabella materiali. Al fine di migliorare i segnali GFP, un anticorpo anti-GFP può essere utilizzato facoltativamente insieme con gli altri anticorpi. - Lavare i vetrini con 0,1% Triton-contenente PBST 3 X per 10 min. Incubare le sezioni per 1 h a temperatura ambiente con un anticorpo secondario coniugato fluoroforo diluito in soluzione bloccante contenente DAPI.
- Lavare i vetrini in PBS 3x per 10 min. Mount le diapositive e conservare a 4 ° C fino a formazione immagine.
Nota: Il protocollo può essere messo in pausa qui.
6. imaging e analisi
- Le sezioni utilizzando un microscopio confocale a 20 ingrandimenti dell'immagine.
- Contare il numero di cellule positive GFP, perdendo l'espressione della proteina dell'obiettivo. Un'immagine rappresentativa è mostrata nella Figura 2B.
- Verifica il fenotipo molecolare all'ablazione dei geni bersaglio in PNL e loro progenie di immuostaining12.
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Representative Results
Per l'analisi funzionale in vivo , è fondamentale per identificare le celle in cui sono stati introdotti geni esogeni. Mentre l'espressione di un marcatore, come GFP in cellule non proliferanti possono essere continuati per un lungo periodo di tempo, il segnale si perde in sequenza nelle cellule proliferanti. Un'illustrazione di questo effetto è dimostrata nella Figura 1. Per ovviare a perdere l'impronta delle cellule transfected nelle analisi di LOF, abbiamo sviluppato un nuovo approccio combinando consegna elettroporazione-basato del gene con la tecnologia CRISPR/Cas9.
Risultati rappresentativi sono mostrati nella Figura 2. Funzionalità dei costrutti di plasmide è verificata mediante trasfezione transitoria di pU6-sgTop2b-Cbh-Cre e pCAG-EG-Top2b-FP17, portando alla sequenza di destinazione di sgTop2b, in HEK293T cellule che esprimono stabilmente SpCas9 (Figura 2A). L'attività endonucleasica Cas9 sgRNA-guida induce DSB-mediata di riparazione di omologia-regia della cassetta di espressione di EGFP. Quindi, la funzione del sgRNA direttamente è stata analizzata tramite rilevazione di espressione di GFP. Secondo Mashiko et al., un'efficienza di trasfezione di più del 30% determina un sgRNA come efficace17.
PNL provengono dal labbro rombico (RL), una regione confinante con il tetto del quarto ventricolo alle fasi embrionali 12.5 fino al E16.5. Queste cellule sono state conosciute per subire la proliferazione voluminosa dopo la nascita nello strato esterno esterno granello (oEGL) e spostamento verso l'interno EGL (iEGL) dopo l'uscita del ciclo cellulare20. Quindi, PNL sono un esempio appropriato per testare i vantaggi del nostro approccio genetico d'etichettatura.
Seguendo questo protocollo, nell'utero elettroporazione del PNL permette l'analisi delle celle modificate con GFP. Abbiamo introdotto il plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre esprimendo sgControl nel primordio cerebellare di topi Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP in fase embrionale E13.5. Topi sono stati sacrificati a giorno postnatale P7, e sezioni sagittali delle sezioni del tessuto cerebellare erano macchiate da immunohistochemistry. EGL interni ed esterni sono stati definiti dall'espressione di Ki67 (oEGL) e l'espressione di p27 (iEGL), rispettivamente. Nonostante in fase di proliferazione e la maturazione, i neuroni cerebellari del granello maturo (CGNs) conservava ancora la forte espressione di GFP (Figura 2B).
Sottolineando l'utilità del presente protocollo, abbiamo inoltre usato il sgRNA DNA Top2b come un esempio rappresentativo di targeting. Procedure sperimentali sono state effettuate come descritto in precedenza (Vedi Figura 2B). La maggior parte delle cellule GFP-positive trasfettate con sgRNAs per Top2b esposto una perdita di espressione di Top2b nello strato interno del granello (IGL), mentre l'introduzione del controllo sgRNAs non ha provocato la netta riduzione della sua espressione (Figura 2). Una quantificazione di questo risultato è mostrata in Figura 2D. Questi dati presentano un prezioso strumento per l'analisi celle modificate per un lungo periodo di tempo durante la formazione del tumore o di sviluppo.
Figura 1: rappresentazione schematica dell'espressione di GFP in cellule proliferanti e non proliferanti. (A) quando un gene esogeno codifica GFP (ad es., pCAG-EGFP) è trasfettato in cellule non proliferanti, le cellule può esprimere GFP per lungo tempo (corsia superiore). Nel frattempo, espressione di GFP potrebbe sparire in cellule proliferanti per diluizione di esogeno GFP (corsia centrale). Al contrario, le cellule che trasportano il transgene LoxP-Stop-LoxP-GFP (LSL-GFP) possono mantenere l'espressione della GFP durante la proliferazione dopo trasfezione con Cre ricombinasi (corsia inferiore). (B) il principio di silenziamento genico mediato da SpCas9 e di espressione di GFP dopo trasfezione Cre e sgRNA in un Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP razza del topo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: immagini rappresentative di risultati da questo protocollo. HEK293T (A) le cellule che esprimono SpCas9 transfected con plasmidi pU6-sgTop2b-Cbh-Cre e pCAG-EG-Top2b-FP. Espressione di GFP in cellule vive, che è stata monitorata utilizzando un imager di cellule fluorescenti (Vedi Tabella materiali) 48 ore dopo la trasfezione. Pannelli di sinistra e destro mostrano una sequenza di sgRNA efficace e non efficace basata sull'espressione di GFP, rispettivamente. Scala bar: 100 µm. (B) Immunostaining di GFP, Ki67 e p27 sui cervelletti P7 da un mouse Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP sottoposto ad elettroporazione presso E13.5 con costrutti pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide sgRNA di controllo. La sezione è controcolorata con DAPI (blu). Scala bar: 50 µm; 20 ingrandimenti. Nota le cellule che esprimono GFP in oEGL segnato da Ki67. (C) Immunostaining di GFP (green) e Top2b (magenta) sui cervelletti P7 da un mouse Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP che era individulamente alle E13.5 con pU6-sgRNA-Cbh-Cre plasmide costrutti esprime sgRNA contro Top2b (sgTop2b) e un sequenza di controllo (sgControl). Le frecce indicano Top2b espressione in cellule GFP+ nello stesso campo. Scala bar: 20 µm; 20 ingrandimenti. (D) quantificazione di Top2b in cellule elettroporate (GFP-positivo) in esperimenti di sgControl e sgTop2b. Due e tre cuccioli sono stati studiati per sgControl e sgTop2b, rispettivamente, e sono state analizzate 25 celle da ogni cervello. Barre di errore rappresentano ± errore standard della media (SEM) e p-valori sono stati calcolati da spaiato t-prova, *p = 0,0002. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome | Sequenza | Applicazione | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sequenza di destinazione sgRNA | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sequenza di destinazione sgRNA | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sequenza di destinazione sgRNA | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | Clonazione in pCAG-EGxxFP | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | Clonazione in pCAG-EGxxFP | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | Sequenziamento per sgRNA | |
Tabella 1: Sequenze di oligos utilizzato in questo studio.
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Discussion
Usando l'elettroporazione exo utero , precedentemente abbiamo segnalato basati su siRNA in vivo analisi funzionali di Atoh1 in una fase iniziale di granuli cerebellari cellulari differenziazione8. A causa di siRNA diluizione/degradazione e l'esposizione di embrioni di fuori della parete uterina, l'analisi fenotipica delle cellule del granello individulamente era limitata a fasi embrionali. Tuttavia, il metodo corrente attivata analisi del fenotipo di animali postnatali.
Il nostro studio precedente ha dimostrato che knockout Cas9-mediata del tumore soppressore Ptch1 via nell'utero elettroporazione con successo ha indotto il medulloblastoma2. In confronto, l'approccio attuale presenta due vantaggi principali: 1) Cas9 non devono essere consegnati con il plasmide, consentendo più gene-targeting mediante la realizzazione di cassette di espressione sgRNA multipli in un singolo plasmide invece; e 2) le cellule bersaglio e la loro progenie sono definitivamente etichettati con GFP, consentendo la visualizzazione delle cellule vive e analisi del comportamento della trasformazione tumorale di cellule in vivo.
Le fasi più critiche del presente protocollo sono l'iniezione corretta del plasmide DNAs nella posizione corretta e la consegna degli impulsi elettrici nelle posizioni appropriate nel cervello. Neuroni cerebellari sono nati dal neuroepithelium cerebellare in sequenza in un modo dipendente dalla data di nascita. Non tutti i tipi di cellule nel primordio cerebellare possono essere mirati tramite elettroporazione, perché solo una finestra di tempo specifico a 12.5-14.5 è tecnicamente fattibile. Nuclei cerebellari neuroni e cellule di Purkinje sono state conosciute per sorgere al e 10.5-11.5, quando le membrane extra-embrionali non sono trasparenti, e l'embrione non è chiaramente visibile per l'iniezione di DNA. Più tardi, spazzola unipolare cellule sono derivate da E17.5 superiore RL (uRL), quando il quarto ventricolo è troppo stretta per iniettare una quantità sufficiente di DNA nelle vicinanze l'uRL. Così, il nostro metodo è applicabile solo a 12.5-14.5, che si rivolge principalmente ai progenitori metà - e successive-Nato, come la PNL e interneuroni inibitori. Un altro svantaggio del metodo è che un fenotipo knockout completo potrebbe non essere fattibile rispetto a Cre/LoxP-mediata germline GEMM, poiché solo migliaia di cellule cerebellari possa essere mirate per elettroporazione in ciascun embrione.
In uno studio precedente, circa l'80% dei granuli cerebellari GFP-positive cellule perse espressione del gene bersaglio12. Mentre l'identità delle cellule del granello è stata confermata da marcatori molecolari e loro distribuzione, questo approccio di identificazione potrebbe non essere sempre applicabile, come geni di interesse potrebbero essere coinvolta nella migrazione neuronale e dell'espressione dei marker. Attivazione condizionale di Cre utilizzando un promotore di cellula-specifico risolverebbe il problema in questo caso. Pertanto, l'attuale promotore Cbh onnipresente nel plasmide pU6-sgRNA-Cbh-Cre può essere sostituito con un promotore di cellula-specifico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Apprezziamo Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim e Petra Schroeter per assistenza tecnica. Ringraziamo anche la d. ssa K. Reifenberg, K. Dell e P. Prückl per gli interventi utili per gli esperimenti sugli animali presso DKFZ; l'Imaging Core il DKFZ e il centro di formazione immagine di Carl Zeiss in servizi il DKFZ per formazione immagine di microscopia confocale. Questo lavoro è stato supportato dal Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (a D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A. 3rd, Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
