Summary
녹아웃 동물을 사용 하 여 유전자의 손실의 기능 연구를 기존의 자주 비용과 시간이 많이 소요 되었습니다. CRISPR 중재 체세포 mutagenesis Electroporation 기반 유전자에 vivo기능을 이해 하는 강력한 도구입니다. 여기, 우리는 소 뇌의 세포 증식에 녹아웃 고기를 분석 하는 방법을 보고 합니다.
Abstract
뇌 기형은 유전자 변이 의해 발생 합니다. 환자 유래 조직에 돌연변이 해독 하는 것은 질병의 잠재적인 원인이 되는 요인을 확인 했다. 질병 발전에 돌연변이 유전자의 기능 장애의 기여의 유효성을 검사 하는 돌연변이 운반 하는 동물 모델의 생성 한 명백한 접근 이다. 생식 유전자 조작 마우스 모델 (GEMMs)는 인기 생물 학적 도구 및 재현성 결과 전시, 시간 및 비용에 의해 제한 된다. 한편, 비 생식 GEMMs 종종 더 실현 가능한 방식으로 탐험 유전자 함수를 사용합니다. 이후 일부 뇌 질환 (예, 뇌종양) 체세포에서 발생할 나타나지만 하지 생식 돌연변이, 비 생식 공상 마우스 모델, 정상 및 비정상 세포가 공존, 질병 관련 분석에 대 한 도움이 될 수 있습니다. 이 연구에서 우리는 소 뇌에 체세포 돌연변이 CRISPR 중재의 유도 하는 방법을 보고합니다. 특히, 우리는 조건부 노크에 마우스는 Cas9 그리고 GFP 는 만성 활성화 CAG (CMV 증강/치킨 ß-말라) 발기인 Cre후 활용-중재 하는 게놈의 재결합. 자체 디자인된 단일-가이드 RNAs (sgRNAs)와 모두 단일 플라스 미드 구문에서 인코딩된 Cre recombinase 시퀀스, electroporation utero에서 를 사용 하 여 배아 단계에서 소 뇌 줄기/시 조 세포로 전달 되었다. 따라서, transfected 세포와 딸 세포 그들의 phenotypic 분석 더 촉진 녹색 형광 단백질 (GFP)으로 표시 했다. 따라서,이 방법은 뿐만 아니라 보여주는 electroporation 기반 유전자 배아 소 뇌 세포로 전달 하지만 CRISPR 중재 기능 손실 고기를 평가 하는 새로운 양적 접근 방식을 제안.
Introduction
뇌 질환 가장 무서운 인간의 질병 중 하나입니다. 그들은 유전자 변이 후속 dysregulation에서 수시로 유래한 다. 뇌 질환의 분자 메커니즘을 이해 하기 인간의 환자의 게놈 해독 영원한 노력 잠재적인 원인이 유전자의 수를 발견 했습니다. 지금까지 생식 유전자 조작 동물 모델 vivo에서 이득-의-(GOF) 기능과 같은 후보 유전자의 기능 손실 (LOF) 분석에 대 한 이용 되어 있다. 기능 유효성 검사 연구의 가속된 발달 때문에 더 가능 하 고 유연한 vivo에서 유전자 분석 결과 대 한 시스템 유전자 기능을 공부 하 고 바람직합니다.
개발 쥐의 뇌에는 vivo에서 유전자 electroporation 기반 전송 시스템의 응용 프로그램은이 목적에 적합 합니다. 사실, electroporation utero에서 를 사용 하 여 여러 연구 개발 두뇌1,2,3기능 분석을 그들의 잠재력을 보여왔다. 사실, 마우스 뇌의 대뇌 피 질4, 망막5, diencephalon6, hindbrain7,8, 소 뇌 및 척수9 등의 여러 지역 체세포 유전자 전달에 의해 표적이 되었고 지금까지 접근 한다.
실제로, vivo에서 electroporation 배아 마우스 두뇌에 의해 일시적인 유전자 발현은 오래 GOF 분석을 위해 사용 되었습니다. 최근 게놈 통합 transposon 기반 기술을 더 사용 관심10,11, 유전자의 장기 및/또는 조건부 식은 동안 공간 및 시간적으로 유전자 기능을 해 부에 유리 개발입니다. GOF 분석, 달리 LOF 분석 더 도전 하고있다. ShRNA 들고 플라스 미드 siRNAs의 과도 transfection를 수행 하는 동안 LOF 유전자의 장기 효과 플라스 미드 등 dsRNAs 것 소개 된 핵 산의 최종 저하로 인해 보장 되지 않습니다. 그러나, CRISPR/Ca 기술을 LOF 분석 통해 휴식을 제공합니다. 인코딩 형광 성 단백질 (예를 들어, GFP) 또는 (예를 들어, 반딧불 luciferase) 발광 단백질 유전자와 CRISPR-Cas9 sgRNAs CRISPR Cas9 중재 하는 체세포 돌연변이에 노출 하는 셀을 공동 페 되어 있다. 그럼에도 불구 하 고,이 방법은 한계에에서 있을 기능 연구 확산 셀에 exogenous 마커 유전자 희석 장기 확산 후 저하 때문. Transfected 세포와 그들의 딸 세포 그들의 게놈에서 돌연변이 CRISPR 유도 받 다, 하는 동안 시간이 지남에 그들의 발자국 손실 얻을 수 있습니다. 따라서, 유전자 표기 방법이이 문제를 극복 하기 위해 적합 한 것입니다.
우리는 최근 자신의 차별화12동안 장기 확산을 받아야 하는 소 뇌과 립 세포에 CRISPR 기반 LOF 방법을 개발. 유전자는 transfected 세포 레이블을, 우리는 Cre 함께 sgRNA를 들고 플라스 미드를 건설 하 고 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 마우스13 electroporation utero에서 를 사용 하 여 cerebella에 플라스 미드를 도입. 일반 플라스 미드 벡터 EGFP 인코딩, 달리이 방법을 성공적으로 표시 transfected과 립 신경 선구자 (GNPs)와 그들의 딸 세포. 정상적인 두뇌 개발 및 종양 발생 배경에서 증식 세포의 유전자의 기능 vivo에서 이해에 큰 지원을 제공 합니다.
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Protocol
모든 동물 실험 동물 복지 규정에 따라 실시 했다 고 책임 있는 권위에 의해 승인 되었습니다 (Regierungspräsidium Karlsruhe, 승인 번호: G90/13, G176/13, G32/14, G48/14, 및 G133/14).
1. pU6-sgRNA-Cbh-Cre 플라스 미드를 생성
- 대상 유전자-의-관심을14이전 게시 된 프로토콜 따라 sgRNA 디자인.
참고:이 실험에서 두 개의 sgRNAs 설계 되었습니다 마우스 Top2b 유전자 및 비 대상 컨트롤 sgRNA (표 1). 녹아웃 gene(s) CRISPR 기술을 사용 하 여, sgRNAs 5' 영역의 코딩 순서 또는 단백질의 필수 기능 도메인을 대상으로 설계 해야 합니다. 하나의 편리한 시작 지점 도마뱀 v 2 마우스 녹아웃 풀 라이브러리15 장 실험실에서 같은 공개적으로 사용할 수 있는 미리 디자인 된 sgRNA 시퀀스를 테스트 하는. 또는, sgRNAs 디자인 될 수 있다 다음 웹 사이트와 같은 공용 사용 가능한 소프트웨어를 사용 하 여: crispr.mit.edu. - PU6-sgRNA-Cbh-Cre 벡터에는 sgRNAs를 복제.
참고:이 연구에 사용 된 pU6-sgRNA-Cbh-Cre 벡터12 Cre recombinase와 SpCas9의 코딩 시퀀스를 대체 하 여 원래의 pX330 플라스 미드16 에서 파생 됩니다.- 다음과 같이 두 개의 DNA oligos 음성 합성. 감각: 5 '-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; Antisense: 3 '-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'.
참고: 20 N sgRNA 시퀀스에 대 한 스탠드 위에 표시의. - PU6-sgRNA-Cbh-Cre BbsI와 다음 시 약을 사용 하 여 37 ° C에서 30 분을 소화, 소화 샘플 1 %agarose 젤을 로드 하 고 젤 추출 키트를 사용 하 여 그들을 정화. 사용 3 µ g 플라스 미드; 3 µ L 게시판; 1 µ L FastAP; 소화 버퍼; X 5 µ L 10 ddH2O 50 µ L에 게 총 볼륨을 추가 합니다.
- Phosphorylate 및 anneal sgRNA oligos 다음 시 약 (10 µ L 총 볼륨)를 사용 하 여의 각 쌍: 1 µ L 사용자 지정 감각 올리고 (100 밀리미터); 1 µ L 맞춤 센스 올리고 (100 밀리미터); T4 결 찰 버퍼; X 1 µ L 10 6.5 µ L ddH2O; 0.5 Μ L T4 PNK. 37 ° C에서 30 분 동안 열 cycler에서 품 어와 95 ° C, 그리고 경사 5 ° C/min에서 25 ° c에서 5 분.
- 다음 결 찰 반응 하 고 실내 온도 (10 µ L 총 볼륨)에 10 분 동안 품 어: X µL 게시판플라스 미드를 소화 (50 ng); 1 µ L phosphorylated 고 단련, 올리고 듀플렉스 (1: 200 희석); 결 찰 버퍼; X 5 µ L 2 X µL ddH2O; 1 µ L 빠른 리가
- 화학적으로 유능한 DH5α 대장균 세포의 50 µ L에 결 찰 제품의 2 µ L를 추가 합니다. 얼음에 외피의 30 분, 후 열 충격 90에 대 한 샘플에서 42 ° C, s 및 얼음에 2 분 동안 품 어. LB 매체의 100 µ L을 추가 하 고 포함 하는 100 µ g/mL 암 피 실린 파운드 플레이트에 플레이트.
참고: pU6-sgRNA-Cbh-Cre 플라스 미드에 sgRNA 시퀀스의 통합 pX330 플라스 미드14에 대 한 복제 단계에 따라 수행 됩니다. - 두 식민지, 각 파운드 매체 6 h의 최소 37 ° C에서의 2 mL에 접종 하 고 키트를 사용 하 여 소형 예비 DNA 격리를 수행 합니다.
- 생어는 hU6-앞으로 뇌관을 사용 하 여 소형 예비 DNA 순서 및 단계 1.2.1에서에서 순서와 정렬 하 여 sgRNAs의 올바른 삽입 식민지를 식별 합니다. 뇌관 순서는 표 1에 표시 됩니다. 이 연구에 사용 된 플라스 미드는 pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre, pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre, 및 pU6-sgControl-Cbh-Cre 선정 됐다.
- 잘못 식별 된 식민지를 접종 하 고도 무료 플라스 미드 DNA electroporation utero에서 , 예를 들어, Qiagen에서 키트를 사용 하 여에 대 한 정화. 내 무료 TE 버퍼 1:10 (10% 테 버퍼) ddH2O 희석 DNA elute 플라스 미드 DNA 농도 2 mg/mL 보다 높이 필요가 있다.
참고: DNA 준비를 위한 일반 맥시 준비 키트를 사용 하지 마십시오. 플라스 미드-솔루션 일반 단기 사용 (최대 4 주), 또는 약 수 4 ° C에서 약 25 µ L의 적절 한 볼륨을 저장 하 고 장기 저장을 위한-20 ° C에서 유지.
- 다음과 같이 두 개의 DNA oligos 음성 합성. 감각: 5 '-CACCGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'; Antisense: 3 '-CNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5'.
2. EGxxFP 플라스 미드 시스템을 사용 하 여 sgRNAs의 효율성을 테스트
참고:는 sgRNAs의 효율성은 일반적으로 테스트 측량 또는 T7E1 (T7 endonuclease 나) 분석 실험. 이 프로토콜에는 간단 하 고 효율적인 대체 방법은 사용 됩니다. 이 방법의 키 사이트17를 대상으로 하는 sgRNA를 포함 하는 DNA 순서에 의해 구분 된 겹치는 EGFP 파편을 포함 하는 pCAG EGxxFP 플라스 미드를 사용 하는 것입니다. PCAG-EGxxFP sgRNA 및 Cas9 transfected 세포에 표현 시 대상 시퀀스에 이중 가닥 Cas9 중재 휴식 (DSB) 복구 생 homology-종속 메커니즘에 의해 어떤 EGFP 식 재구성 카세트입니다.
- 시퀀스를 대상으로 하는 sgRNA와 중심으로 게놈 영역을 증폭 하는 뇌관 디자인. PCR amplicon는 약 500 bp. 이 실험에서 DNA 어셈블리에 pCAG EGxxFP 플라스 미드 PCR 증폭 조각 복제에 적용 되었습니다.
참고: 또는, 적절 한 제한 사이트 추가할 수 있습니다 PCR 뇌관의 5' 끝에. PCAG-EGxxFP 벡터에 사용 가능한 제한 사이트는 BamHI, NheI, PstI, 사리, EcoRI, 및 EcoRV. - 폼 아래의 PCR 매개 변수를 사용 하 여 설계 된 뇌관으로 게놈 DNA를 증폭. 샘플을 로드 (19.7 µ L H2O; 0.3 µ L 10 ng / µ L 마우스 게놈 DNA; 2.5 µ L 10 µ M EGxxFP-Top2b-F; 2.5 µ L 10 µ M EGxxFP-Top2b-R; PCR 마스터 믹스 X 25 µ L 2; 50 µ L 총 볼륨)에 1 %agarose 젤 고 젤 정화 젤 추출 키트를 사용 하 여 PCR 파편. 3 분;에 대 한 다음과 같은 반응 조건: 95 ° C를 사용 하 여 다음 35 x 주기 98 ° C의 20 s, 15에 대 한 60 ° C s, 72 ° C 20 s, 그리고 1 분; 72 ° C에 대 한 4 ° C, 무기한입니다.
참고:이 실험에서 한 지역 Top2b exon 1에서에서 증폭 되었다; 표 1에 뇌관 시퀀스를 찾아. - 제한 효소 BamHI 및 1 %agarose 샘플을 로드 하는 37 ° C, 다음에서 2 h EcoRI pCAG EGxxFP 벡터 젤 고 젤 정화 젤 추출 키트를 사용 하 여 벡터 백본 다이제스트. 다음 시 약 (50 µ L 총 볼륨)를 사용 하 여: X µL 플라스 미드 (3 µ g); 2 µ L BamHI; 2 µ L EcoRI; 5 µ L 10 X 버퍼; X µL ddH2o.
- 제조업체의 지침에 따라 DNA 어셈블리 반응18 고 DH5α 유능한 대장균으로 변환 합니다.
- 두 식민지 접종, 각에 2 mL 6 h의 최소 37 ° C에서 파운드 매체의 소형 예비 DNA 분리, 예를 들어, Qiagen에서 키트를 사용 하 여 수행 및 올바른 삽입 (pCAG-예-Top2b-FP 라 함)와 식민지를 식별 생어를 사용 하 여 EGxxFP-Top2b-F 뇌관 시퀀싱.
- HEK293T 셀 transfect
- 종자는 HEK293T 세포 transfection 전에 24 h 24-잘 접시로.
참고: 셀 했다 교양 37 ° C 셀 인큐베이터에서 5% CO2, DMEM과 10 %FBS 및 1% 포함 된 글루타민 보충과 페니실린/스. 세포 transfection 하루에 60% 합칠 인지 확인 합니다. 이 실험에서 사용 안정적으로 SpCas9을 표현 하는 자 HEK293T 셀을 pU6-sgRNA-Cbh-Cre 테스트. 그러나, wildtype HEK293T 세포는 SpCas9 식 벡터를 제공 하는 경우 사용할 수 있습니다. - Polyethylenimine (페이) 시 약을 사용 하 여 HEK293T 셀 transfect PCAG-예-Top2b-FP 플라스 미드12 의 120 ng/잘 전지와 120 ng/pU6-sgTop2b-1-Cbh-Cre 또는 pU6-sgTop2b-2-Cbh-Cre 24-잘 접시에 잘 transfect. 플라스 미드 DNAs를 혼합 하 고 글루타민과 unsupplemented DMEM 매체의 80 µ L에서 페이 시의 1.8 µ L 보충 하 고 vortexing 후 실 온에서 15 분 동안 품 어.
- transfection, 후 6 h 매체를 제거 하 고 신선한 매체를 바꿉니다.
- 20 배 확대에 형광 현미경을 사용 하 여 transfection 후 라이브 GFP+ 세포 48 h의 존재를 모니터링 합니다.
참고: GFP+ 세포의 수는 sgRNA의 대상 효율을 나타냅니다. 유효 및 유효 하지 않은 sgRNAs의 결과 (sgTop2b-1 및 sgTop2b-2, 각각) 그림 2A에 표시 됩니다.
- 종자는 HEK293T 세포 transfection 전에 24 h 24-잘 접시로.
3. 수행 Electroporation Utero에서
- 6 8 주 오래 된 쥐를 사육 하 고 electroporation utero에 대 한 도구를 준비 합니다. 크로스 남성 homozygous Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 여성 CD-1 쥐와 쥐. 시간 날 질 플러그에서에서 CD-1 쥐의 임신 감지 (E0.5). 배아는 하루 E13.5에 electroporated.
- 붕 규 산 유리 모 세관을 당겨 (안쪽 직경: 0.6-0.8 m m) micropipette 끌어당기는 사람와. 다음 설정을 사용 합니다: P = 500, 열 560, 풀 = = 150, 벨 75, 시간 = = 250. 주사 하는 동안 더 나은 시각화에 대 한 검정 잉크와 모 세관 팁 레이블을 지정 합니다. 눈금자를 사용 하 여 stereomicroscope에서 모 세관 테이퍼를 트림 하 고 날카로운 바늘 핀셋 약 6 m m의 길이에 끝을 잘라.
- 재현 실험을 계속 하는 모세 혈관의 단결을 유지 합니다. 트리밍 동안 일방적인 3d 가장자리를 만듭니다. 팁 쉽게 침투 자 궁 벽과 태아의 조직 손상을 방지에 대 한 가능한 날카로운 되어야 합니다.
참고: 또는,1935 ° 각도 조정 하는 마이크로 그 라인 더를 사용 합니다. 모세는 실내 온도 10 cm 병원 체 자유로운 조건에서 배양 접시에에서 저장할 수 있습니다. - 압력솥 수술 도구.
- SgRNA 플라스 미드 같은 부분에 믹스 pT2K-IRES-뤽 각 플라스 미드 및 색상에 대 한 µ 1 µ g/L의 최종 농도에 빠른 그린 (0.05%의 최종 농도)와 플라스 미드 솔루션. 솔루션에서 염료 입자를 제거 하는 0.22 μ m 필터를 통해 빠른 녹색 1%도 없는 증류수와 필터 재고 솔루션을 준비 합니다.
참고: pT2K IRES 뤽의 공동 transfection 선택 사항 이지만 생물 발광 이미지를 사용 하 여 출생 후 가능한 electroporated 동물의 식별을 위해 허용 한다. 3.5 단계를 참조 하십시오. 운영 하기 위하여 임신 쥐의 총 수에 대 한 충분 한 양의 플라스 미드-믹스를 준비 합니다. 에 대 한 사용 하 여 마우스 당 15-20 µ L 믹스 (~ 12 태아). 즉시 수술 진행.
- 수술에 대 한 마우스를 준비 합니다.
- Isoflurane와 임신 CD-1 마우스 anesthetize 3-4 집-%isoflurane 함께 상자에 마 취를 유도 (산소 유량: 1.5 L/min) 2 집-% 코 콘을 통해 수술 하는 동안 그것을 유지 하 고.
참고: 완전 한 수술은 오래 안 걸릴 30 분 줄일 수 주입 및 electroporated 배아, 필요한 경우. 멸 균 글러브를 사용 하 여 수술에 대 한. - 생리대에 그것의 뒤에 마우스를 놓고 마 취를 조정 합니다.
- 진통제를 주사 (Metamizol, 800 밀리 그램/kg 체중, 피하 (사우스 캐롤라이나), 24 시간 서비스 센터).
참고: Metamizol 보다 다른 승인 된 진통제를 사용할 수 있습니다. - 수술 중 안구 건조를 방지 하기 위해 눈 연 고를 적용 합니다.
- 테이프와 사지를 해결 하 고 살 균 제와 복 부를 소독. 거 즈, 노출만 외과 영역을 떠나와 마우스를 커버. 외과 영역 및 거 즈 70% 에탄올을 확산.
- 길이 약 2 cm의 피부 절 개를 확인 하 고 바로 수술가 위로 부드럽게 격차를 확대. 교육을 찾아 알바 고 무딘 팁과가 위 티슈를 사용 하 여 복을 통해 절 개를 약간 더 작은 두 번째.
- 미리 데워 진 멸 균 1 열린된 복 부 구멍을 축 축 하 게 PBS x.
- 조심 스럽게 링 집게를 사용 하 여 복 부 구멍에서 자 궁 뿔을 추출 합니다. 부드럽게 두 인접 배아의 노른자위 낭 사이의 간격에서 전적으로 자 궁 벽을 잡아 당겨. 절 개를 통해 그것을 당기는 동안 태아에 어떤 압력을 피하십시오. 필요한 경우 절 개를 확대 하 고 여분의 주의 하지 자 궁 동맥을 통해 혈액의 흐름을 압축 하는 동안 복 부에 자 궁 뿔 위치.
참고: 일부의 경우, 그것은 한 번에 한 자 궁 경적을 추출 하 고 두 번째 자 궁 경적을 진행 하기 전에 그것을 대체 하도록 조언 된다.
- Isoflurane와 임신 CD-1 마우스 anesthetize 3-4 집-%isoflurane 함께 상자에 마 취를 유도 (산소 유량: 1.5 L/min) 2 집-% 코 콘을 통해 수술 하는 동안 그것을 유지 하 고.
- 주입 및 플라스 미드 DNAs의 electroporation
- 준비 된 유리 모 세관 색된 플라스 미드-솔루션의 약 15 µ L 발음 이 과정에서 모든 기포를 피하십시오.
참고: 플라스 미드-솔루션 막힐 수 있습니다 팁 쉽게 그것의 농도 높은 경우. 사출 직전 일부 DNA를 방출 하 여 모 세관을 테스트 합니다. - 부드럽게 배아 링 집게로 누른 목 부분을 찾습니다.
참고: 태아 주입 하기 어려운 위치에 경우에, 그것을 생략 하 고 태아에 대 한가. 태아의 재배치 증가 그들에 손상의 기회를 증가할 수 있습니다. - 천천히 지 hindbrain 통해 침투 하 여 제 4 뇌 실에 이전 준비 유리 모 세관의 팁과 피어스 그리고 이후에 약 1 µ L 플라스 미드-믹스의 주사. 염색된 DNA 두뇌에서 유출 되지 않습니다 확인 하는 다이아몬드 구조를 모양으로 표시 됩니다.
참고: 옵션으로 4 심 실의 더 나은 시각화를 위한 2.5-fold 확대경을 사용 하 고 혈관 주변. 다른 심에 플라스 미드-솔루션의 확산을 방지 하기 위해 주입 직후 전기 펄스를 제공 합니다. - 적용 전기 평방 펄스 (5 펄스, 32 mV, ms에 50 ms에서 950) 겸 자-같은 플래티넘 핀셋 ( 재료의 표참조)으로. 옆으로 귀 및 자 궁 벽을 통해 소 뇌 primordium에 위치 하는 긍정 극 부정 극 전극 넣습니다. 5 mm 직경 전극 플레이트를 사용 하 여 E13.5 배아의 효과적인 electroporation에 대 한.
참고: 댐 당 배아의 총 수의 2/3 미만rd 를 조작 하 여 새끼의 생존 율을 증가. 배아를 자 궁 경부에 너무 가까이 하지 마십시오. 조작 하는 경우 그들은 노동 하는 동안 합병증을 일으키는 원인이 되 고 전체 쓰레기를 위태롭게. 경우 전극 너무 배아의 마음,이 심장 마비를 일으킬 수 있습니다.
- 준비 된 유리 모 세관 색된 플라스 미드-솔루션의 약 15 µ L 발음 이 과정에서 모든 기포를 피하십시오.
- 게시물 electroporation 및 수술 후 치료
- 신중 하 게 자 궁 뿔 복 부 구멍에 다시 놓고 채우기 사전 예 열 살 균 1 PBS x. 자연 스러운 위치에 자 궁 뿔 슬라이드를 하자.
- 복과 간단한 연속 봉합으로 별도로 피부를 닫습니다.
참고: 복 막 봉합 할 때 자 궁 벽을 통해 피어스를 하지 여분의 주의. - 폐쇄 마 취 고 동물 배 다운 새로운 케이지 합니다.
- 수술 후 깨어 있는 위상 및 다시 24 시간 동안 동물을 모니터링 합니다. 15 분 시간 프레임 내에서 개선 되지 않으면는 떨림과 동물 손질 시작 되지 않는 경우가 열 램프에서 케이지를 놓습니다.
- 성공적인 electroporation luciferase 영상으로 확인 합니다.
- 운영된 댐 (E19.5)에 시간에 배아를 드롭 다는 것을 확인 하십시오.
참고: 생년월일 수 있습니다 지연 될 다음 날에 아마 작업 때문에. - Electroporated 새끼 (P5-P7) 2.5 %isoflurane anesthetize 및 주입 (복 (i.p.)) D-소 (3 mg/kg 체중) 이미징 하기 전에 5 분.
- 생물 발광 영상 장치를 사용 하 여 electroporated 새끼 luciferase 신호를 감지 합니다.
참고: 1 분 노출 시간 luciferase 신호를 검출 하기 충분 하다. 래 디 언스 (p/s/cm2/sr)은 약 > 1 x 106.
- 운영된 댐 (E19.5)에 시간에 배아를 드롭 다는 것을 확인 하십시오.
4. Electroporated Cerebella에서 Cryosections 준비
- Electroporated P7 강아지를 안락사와 소 뇌를 해 부.
참고: GFP 신호 관찰할 수 있습니다 epifluorescent stereoscope를 사용 하 여. - 밤새 5 mL 당 4%의 두뇌에에서는 cerebella를 수정 4 ° c.에 PBS에 PFA
- 4 ° c.에 PBS에서 30% 자당의 뇌 당 10 mL에서 하룻밤 고정된 cerebella 전송
참고: 조직 자당 솔루션에 부 화 후 15 mL 튜브의 하단이 되어야만 합니다. - 펄프 필터 종이의 한 조각으로 남아 있는 자당 솔루션을 몸을 담근 후 최적의 절삭 온도 (10 월) 일회용 플라스틱 금형에 화합물에서 소 뇌를 담가 그리고 드라이 아이스에 동결. 극저온 블록 사용까지-80 ° C에 저장할 수 있습니다.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기. - 극저온 블록 10 µ m 섹션으로 두께 cryostat를 사용 하 여 잘라내어 사용까지-80 ° C에서 섹션을 유지.
참고: 한 PBS를 가진 복합 OCT에 밖으로 세척 후 섹션에 GFP 식을 확인할 수 있습니다.
5입니다. Immunostaining는 Cryosections의
- 건조 30 분 동안 room temperature와 PBS에서 10 분 동안 두 번 세척에 슬라이드.
- 액체 차단 펜으로 섹션을 일주 하 고 차단 솔루션에서 섹션을 품 어 (0.1%를 포함 하는 PBS에 10% 정상 당나귀 세럼 트리톤 X100) 실 온에서 1 h.
- 1 차 항 체 분자의 (예를 들어, GFP와 topoisomerase II 베타 (Top2B)이이 연구에서) 차단 솔루션에 대 한 추가 및 4 ° c.에서 밤새 품 어
참고: 이름 및 사용 하는 항 체의 농도는 재료의 테이블에에서 나열 됩니다. GFP 신호를 강화 하기 위해 안티-GFP 항 체는 다른 항 체와 함께 선택적으로 사용할 수 있습니다. - 워시 0.1% 포함 하는 트리톤 PBST 3 X 10 분 품에 대 한 슬라이드는 fluorophore 활용 2 차 항 체로 차단 솔루션 포함 된 DAPI에서에서 희석 실 온에서 1 h에 대 한 섹션.
- 워시 PBS 3 X 10 분 마운트 슬라이드 슬라이드와 영상까지 4 ° C에서 유지.
참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.
6. 영상 및 분석
- 20 배 확대에 confocal 현미경을 사용 하 여 섹션 이미지.
- GFP 긍정적인 셀 대상 단백질의 식을 잃고의 수를 계산 합니다. 대표 이미지는 그림 2B에 표시 됩니다.
- Immuostaining12GNPs에 그들의 progenies 대상 유전자의 제거 시 분자 표현 형을 확인 합니다.
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Representative Results
Vivo에서 기능 분석을 위해 그것이는 외 인 gene(s) 도입 되었습니다 셀을 식별 하 중요 합니다. 표시자의 표현, 하는 동안과 같은 비 증식 세포에 GFP 수 수-를 오랜 기간에 대 한 신호 되 면 순차적으로 잃었다 확산 셀에. 이 효과의 삽화는 그림 1에서 보여 줍니다. LOF 분석에서 transfected 세포의 발자국을 잃고 회피, 우리는 CRISPR/Cas9 기술로 electroporation 기반 유전자 납품을 결합 하 여 새로운 접근 방식을 개발 했다.
대표 결과 그림 2에 표시 됩니다. PU6-sgTop2b-Cbh-Cre의 과도 transfection으로 플라스 미드 구조물의 기능을 테스트 및 pCAG-예-Top2b-FP17, HEK293T에 sgTop2b 대상 시퀀스를 들고 셀 안정적으로 표현 하는 SpCas9 (그림 2A). SgRNA 기반 Cas9 endonuclease 활동 EGFP 식 카세트의 homology 감독 수리 DSB 중재를 유도합니다. 따라서,는 sgRNA의 함수 직접 GFP 식의 탐지에 의해 분석 되었다. 꼬 외.에 따르면 30% 이상의 transfection 효율 효과적인17는 sgRNA를 결정합니다.
GNPs 마름모꼴 입술 (RL) E16.5까지 배아 단계 E12.5에서 4 우 심 실의 지붕 접경 지역에서에서 발생 한. 이 세포는 세포 주기20종료 후 내부 EGL (iEGL)로 이동 하 고 외부 외부과 립 층 (oEGL)에서 출생 후 대규모 확산을 알려져 있습니다. 따라서, GNPs는 우리의 유전 라벨 접근법의 장점 테스트 적절 한 예입니다.
이 프로토콜에 따라, GNPs의 utero에서 electroporation GFP와 편집된 셀의 추적을 수 있습니다. 우리는 배아 단계 E13.5에서 sgControl Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 마우스의 소 뇌 primordium으로 표현 하는 pU6-sgRNA-Cbh-Cre 플라스 미드를 도입. 쥐 출생 후 하루 P7, 희생 했다 그리고 소 뇌 조직 단면도의 화살 섹션 immunohistochemistry에 의해 얼룩이 있었다. 외부 및 내부 EGL Ki67 식 (oEGL)과 p27 식 (iEGL)에 의해 각각 정의 되었다. 성숙과 확산을 받고에 불구 하 고 성숙한 소 뇌과 립 신경 (CGNs)는 여전히 강한 GFP 식 (그림 2B) 유지.
이 프로토콜의 유틸리티를 강조, 우리는 또한 대표적인 예로 DNA Top2b를 대상으로 하는 sgRNA를 사용 합니다. 실험 절차 ( 그림 2B참조) 위에서 설명한 대로 수행 했다. SgRNAs와 Top2b 에 대 한 페 GFP-긍정적인 세포의 대부분 sgRNAs의 식 (그림 2C)의 명확한 감소 귀착되 지 않았다 제어의 도입 하면서 내부과 립 층 (IGL)에 Top2b 식의 손실을 전시. 이 결과의 정량화는 2D 그림에에서 표시 됩니다. 이러한 데이터 개발 또는 종양 형성 동안 오랜 기간에 대 한 편집 된 셀을 추적 하기 위한 유용한 도구를 제공 합니다.
그림 1: 확산 및 비 증식 세포에 GFP 식의 도식 대표. (A) 때 인코딩 GFP (예, pCAG-EGFP) 비 확산 셀, 셀에에서 페가 세 진 수 있습니다 (위 레인) 오랜 시간 동안 GFP를 표현 하 고 있다. 한편, GFP 식 확산 셀 exogenous GFP (중앙 차선)의 희석 때문에 사라질 수 있습니다. 반면, LoxP 그만 LoxP GFP (LSL GFP) transgene를 수행 하는 세포 transfection Cre recombinase (낮은 레인)와 후 확산 동안 GFP 식을 유지할 수 있습니다. (B)는 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP에서 sgRNA 및 Cre transfection 후 GFP 식 SpCas9 중재 한 유전자 침묵 원칙 마우스 스트레인. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2:이 프로토콜에서 결과의 대표 이미지. (A) HEK293T pU6-sgTop2b-Cbh-Cre 및 pCAG-예-Top2b-FP 플라스 미드와 안정적 SpCas9를 표현 하는 세포 페 했다. 라이브 셀에 GFP 식 형광 세포 영상 기를 사용 하 여 모니터링 했다 ( 재료의 표참조) transfection 후 48 h. 왼쪽 및 오른쪽 패널 각각 GFP 식에 따라 효과적이 고 비 효과적인 sgRNA 시퀀스를 표시 합니다. 스케일 바: 100 µ m. GFP, Ki67, p27 P7 cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 마우스에서에 (B) Immunostaining 대상이 electroporation E13.5에서 pU6-sgRNA-Cbh-Cre 플라스 미드 구조 제어 sgRNA를 표현. 섹션은 DAPI (파란색)와 counterstained. 스케일 바: 50 µ m; 20 x 확대입니다. GFP 표현 셀 Ki67에 의해 표시 oEGL note GFP의 (C) Immunostaining (녹색) 및 Top2b (마젠타) pU6-sgRNA-Cbh-Cre 플라스 미드와 E13.5에서 electroporated는 Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP 마우스에서 P7 cerebella에 Top2b에 대 한 표현 sgRNA 생성 (sgTop2b)와 제어 시퀀스 (sgControl)입니다. 화살표는 Top2b GFP+ 같은 필드 셀에 식을 나타냅니다. 스케일 바: 20 µ m; 20 x 확대입니다. (D) 정량화의 Top2b sgControl 및 sgTop2b 실험에서 electroporated (GFP-긍정적인) 세포에서. 2, 3 새끼 sgControl와 sgTop2b, 각각 조사 되었다 고 각 뇌에서 25 셀 분석 했다. 오차 막대 ± 표준 오차 평균 (SEM) 및 p의 대표-값 짝이 없는 t에 의해 계산 되었다-테스트, *p = 0.0002. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 이름 | 시퀀스 | 응용 프로그램 | |
| sgTop2b-1 | CTTCGTCCTGATACATACAT | sgRNA 대상 시퀀스 | |
| sgTop2b-2 | AGCTGTCCAAAAATTAAAGC | sgRNA 대상 시퀀스 | |
| sgControl | GCGACCAATACGCGAACGTC | sgRNA 대상 시퀀스 | |
| EGxxFP-Top2b-F | gctgcccgacaaccactgagTACCTTGATATCTTAGAGAGCTG | PCAG-EGxxFP으로 복제 | |
| EGxxFP-Top2b-R | gggtcagcttgccgatatcgCTCGCGCATTGTCTTAGC | PCAG-EGxxFP으로 복제 | |
| hU6-F | GAGGGCCTATTTCCCATGATT | SgRNA에 대 한 시퀀싱 | |
표 1: oligos이이 연구에서 사용 되 고의 시퀀스입니다.
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Discussion
엑 소 utero electroporation 사용 하 여, 우리는 이전 비보에 siRNA 기반 기능 분석 Atoh1의 소 뇌과 립의 초기 단계에서 세포 감 별 법8보고 했습니다. SiRNA 희석/저하 및 배아 자 궁 벽 외부의 노출, phenotypic 분석 electroporated과 립 세포의 배아 단계에 국한 되었다. 그러나, 현재 메서드는 출생 후 동물의 표현 형의 분석을 사용할 수 있습니다.
우리의 이전 연구 성공적으로 유도 electroporation medulloblastoma2 utero에 통해 종양 억제기 Ptch1 의 Cas9 중재 녹아웃 그 증명. 비교에서는, 현재 접근 전시 하는 두 가지 주요 이점이: 1) Cas9 필요가 없습니다 플라스 미드, 전달 될 여러 유전자 대신; 단일 플라스 미드에 여러 sgRNA 식 카세트를 수행 하 여 대상에 대 한 허용 그리고 2) 대상 세포와 그들의 progenies 영구적으로 GFP, 라이브 셀의 시각화를 활성화 표시 됩니다 및 변형 종양의 행동의 분석 세포 에 비보.
이 프로토콜의 가장 중요 한 단계는 플라스 미드 DNAs 정확한 위치에 적절 한 주입 및 뇌에 적절 한 장소에 전기 펄스의 배달. 소 뇌 신경 세포 생년월일 종속 방식으로 순차적으로 소 뇌 neuroepithelium에서 태어난 다. E12.5-14.5에만 특정 시간 창은 기술적으로 가능 하기 때문에 소 뇌 primordium 셀 모든 유형의 electroporation, 통해 대상 될 수 있습니다. 깊은 소 뇌 핵 신경 세포 및 Purkinje 세포 때 여분 미 발달 막 투명 하지 않습니다와 태아 DNA 주입을 위해 명확 하 게 표시 되지 않습니다 E10.5-11.5에서 발생 알려져 왔다. 나중에, 유 니 폴라 브러시 셀 E17.5 위 RL (uRL)에서 파생 됩니다, 그리고 4 심 실 때 너무 좁은 uRL 주변 DNA의 충분 한 양의 주사를. 따라서, 우리의 방법만 E12.5-14.5, GNPs 등 금지 수 중순-나중-탄생 창시자, 주로 대상에 적용 됩니다. 방법의 또 다른 단점은 전체 녹아웃 표현 형 때문에 소 뇌 세포의만 수천 electroporation 각 태아에 대상이 될 수 있다 생식 GEMMs, Cre/LoxP 중재에 비교 될 때 실현 되지 않을 수 있습니다.
이전 연구에서 GFP-긍정적인 소 뇌과 립의 약 80%는 타겟된 유전자12의 손실된 식 세포. 정체성과 립 세포의 분자 마커 및 그들의 배급에 의해 확인 되었다, 그러나이 식별 방법은 되지 않을 수도 항상 적용, 관심의 유전자 마커 표현과 신경 마이그레이션에 관련 된 수로. Cre 셀 전용 모터를 사용 하 여 조건부 활성화는이 경우에 문제를 해결할 것 이다. 따라서, pU6-sgRNA-Cbh-Cre 플라스 미드에 현재 유비 쿼터 스 Cbh 발기인 셀 특정 발기인으로 교체할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 기술 지원에 대 한로 라 Sieber, 애 나 Neuerburg, 야신 하림, 그리고 페트라 Schroeter 주셔서 감사합니다. 우리 또한 DKFZ; 동물 실험에 대 한 유용한 지원 박사 K. Reifenberg, K. 델, P. Prückl 감사 합니다. 이미징 핵심 시설은 DKFZ와 칼 Zeiss 이미징 센터는 DKFZ에 confocal 현미경 이미징. 이 작품은 도이치 가운데, 카 4472/1-1 (대표이사)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | - | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | - | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | - | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | - | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
References
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