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Immunology and Infection

एक उपंयास सेल छँटाई रणनीति का उपयोग कर Murine अस्थि मज्जा से माइलॉयड Progenitors और वृक्ष सेल पुरोगामी की बड़ी संख्या की पीढ़ी

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57365
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Auburn University

Summary

यहां हम की पहचान करने और जीएम की बड़ी संख्या अलग-सीएसएफ प्रेरित माइलॉयड उच्च गति सेल छंटाई का उपयोग कर कोशिकाओं के लिए एक विधि प्रदान करते हैं । पांच अलग आबादी (आम माइलॉयड progenitors, granulocyte/मैक्रोफेज progenitors, monocytes, monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज, और monocyte-व्युत्पंन dc) Ly6C और CD115 अभिव्यक्ति के आधार पर पहचाना जा सकता है ।

Abstract

monocyte की संस्कृतियों-व्युत्पंन वृक्ष कोशिकाओं (moDC) माउस अस्थि मज्जा से उत्पंन Granulocyte का उपयोग-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक फैक्टर (जीएम-सीएसएफ) हाल ही में पहले की सराहना की तुलना में अधिक विषम होने के लिए मांयता प्राप्त किया गया है । इन संस्कृतियों नियमित रूप से moDC के रूप में अच्छी तरह से monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज (moMac), और यहां तक कि कुछ कम विकसित कोशिकाओं monocytes के रूप में होते हैं । इस प्रोटोकॉल के लक्ष्य के लिए पहचान और इन संस्कृतियों में मौजूद कई कोशिका प्रकार की जुदाई के रूप में वे विकसित करने के लिए एक सुसंगत विधि प्रदान करना है, ताकि उनके विशिष्ट कार्य आगे की जांच की जा सकती है । छंटाई रणनीति यहां प्रस्तुत की चार Ly6C और CD115 की अभिव्यक्ति के आधार पर आबादी में पहले कोशिकाओं अलग, दोनों जिनमें से क्षणिक कोशिकाओं द्वारा व्यक्त कर रहे है के रूप में वे जीएम-सीएसएफ-संस्कृति संचालित में विकसित । इन चार आबादियों में आम माइलॉयड progenitors या सीएमपी (Ly6C-, CD115-), granulocyte/मैक्रोफेज progenitors या जीएमपी (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), और monocyte-व्युत्पन्न मैक्रोफेज या moMac (Ly6C-, CD115 +) शामिल हैं । CD11c भी छँटाई रणनीति में जोड़ा जाता है Ly6C के भीतर दो आबादी भेद-, CD115-जनसंख्या: सीएमपी (CD11c-) और moDC (CD11c +). अंत में, दो आबादी आगे Ly6C-, CD115 + MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर जनसंख्या के भीतर प्रतिष्ठित हो सकता है । MoMacs एक्सप्रेस MHC द्वितीय श्रेणी के निचले स्तर, जबकि एक monocyte डीसी प्रणेता (moDP) उच्च MHC वर्ग द्वितीय व्यक्त करता है । इस विधि कार्यात्मक और विकासात्मक विश्लेषण की एक किस्म के लिए पर्याप्त संख्या में कई विकास विशिष्ट आबादी के विश्वसनीय अलगाव के लिए अनुमति देता है । हम एक ऐसी कार्यात्मक readout पर प्रकाश डाला, रोगज़नक़ के साथ उत्तेजना के लिए इन सेल प्रकार के अंतर प्रतिक्रियाओं-आणविक पैटर्न (PAMPs) जुड़े ।

Introduction

cytokine Granulocyte-मैक्रोफेज कॉलोनी उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) के साथ murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं के संवर्धन व्यापक रूप से बड़ी संख्या 1में monocyte-व्युत्पन्न वृक्ष कोशिकाओं (moDC; भी भड़काऊ डीसी के रूप में जाना जाता है) उत्पन्न करने के लिए एक विधि के रूप में प्रयोग किया जाता है, 2,3,4,5. ये कोशिकाएं वृक्ष सेल (DC) फंक्शन 6,7,8के अध्ययन की एक किस्म में बेहद उपयोगी रही हैं । आमतौर पर, इन murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं 6-8 दिनों के लिए संस्कृति और फिर वृक्ष सेल समारोह 5के अध्ययन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं । इन संस्कृतियों लंबे समय ज्यादातर समरूप माना गया था, विभेदित moDC के बहुमत से मिलकर । हाल ही में, यह है कि यह 6 के अंत में स्पष्ट हो गया है-8 दिन संस्कृति अवधि, वहां वास्तव में कई moDC हैं, साथ ही साथ विभेदित monocyte का एक बड़ा सबसेट-मैक्रोफेज (moMacs) 9,10,11व्युत्पंन । हमारे अपने अध्ययन आगे इन moDC पुरोगामी (moDP) और monocytes के रूप में कम विकसित कोशिकाओं के अन्य सबसेट का प्रदर्शन है कि इन निष्कर्षों को बढ़ाया है, कम आवृत्ति पर भी 7 दिन 10के बाद संस्कृतियों में रहते हैं. इस प्रकार, वृक्ष कोशिकाओं के अध्ययन (डीसी) समारोह इस प्रणाली द्वारा उत्पंन कोशिकाओं का उपयोग कर सेल प्रकार के एक व्यापक पलटन की प्रतिक्रियाओं को प्रतिबिंबित से पहले की सराहना की ।

हम अंतर 12,13,14के अंतिम चरणों में इन कोशिकाओं के समारोह से संबंधित जीएम-सीएसएफ-जनित moDC के अध्ययन से एक महान सौदा सीखा है । हालांकि, हम इन कोशिकाओं के विकास मार्ग के बारे में काफी कम समझते हैं 2,15,16 और कैसे और जब वे इस तरह के रूप में विशिष्ट कार्यों का प्रदर्शन: रोगज़नक़ के लिए जवाबदेही आणविक जुड़े पैटर्न (PAMPs), phagocytosis, प्रतिजन प्रसंस्करण और प्रस्तुति 13, और विरोधी बैक्टीरियल गतिविधि । पारंपरिक Flt3L संचालित डीसी progenitors और पुरोगामी की बड़ी संख्या के अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल 17बताया गया है । इन अलग आबादी का अलगाव carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर (CFSE) का उपयोग कर हासिल किया गया था-अस्थि मज्जा कोशिकाओं दाग (कोशिकाओं को विभाजित ट्रैक करने के लिए) और Flt3L में संस्कृति 3 दिनों के लिए । कोशिकाओं तो linage सकारात्मक कोशिकाओं के समाप्त हो गए थे और जनक और अग्रदूत CD11c अभिव्यक्ति 17के आधार पर आबादी में हल । Leenen समूह द्वारा एक और दृष्टिकोण जीएम-सीएसएफ-संचालित संस्कृति में डीसी के जल्दी progenitors की पहचान करने के लिए CD31 और Ly6C 18के आधार पर कोशिकाओं को सॉर्ट करने के लिए किया गया था । प्रारंभिक लक्ष्य progenitors और जीएम-सीएसएफ चालित moDC के अग्रदूतों को प्राप्त करने के लिए एक समान विधि बनाने के लिए किया गया था । विशिष्ट कोशिका जीएम द्वारा उत्पंन प्रकार-सीएसएफ के कारण, हम दृष्टिकोण और छंटाई अणुओं है कि विकास के प्रारंभिक और बाद के चरणों में व्यक्त किए गए की अभिव्यक्ति के आधार पर रणनीति अनुकूलित । हम अंततः निर्धारित किया है कि Ly6C, CD115 (सीएसएफ-1 रिसेप्टर), और CD11c इन सेल प्रकार 10भेद के लिए सबसे अच्छा मार्करों थे ।

यहां, हम जीएम द्वारा संचालित भेदभाव के मार्ग के साथ विकास के कई विशिष्ट चरणों में कोशिकाओं के अलगाव के लिए एक विधि वर्तमान-सीएसएफ: आम माइलॉयड जनक (सीएमपी), Granulocyte-मैक्रोफेज जनक (जीएमपी), monocyte, monocyte-व्युत्पंन मैक्रोफेज (MoMac) और monocyte-व्युत्पन्न डीसी (MoDC). moMac जनसंख्या और MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के स्तर के आधार पर अलग किया जा सकता है, एक moDC प्रणेता जनसंख्या (moDP) 10खुलासा । हम Ly6C, CD115, और CD11c की अभिव्यक्ति के आधार पर इन 5 आबादी को अलग करने के लिए एक उच्च गति प्रतिदीप्ति-सक्रिय कक्ष छँटाई (FACS) रणनीति का उपयोग. हम तो कार्यात्मक परख PAMP उत्तेजना को अपनी प्रतिक्रियाओं खुलासा में इन कोशिकाओं की परीक्षा का प्रदर्शन ।

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Protocol

सभी पशु काम Auburn विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों के प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड में उल्लिखित सिफारिशों के अनुसार उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. अस्थि मज्जा संग्रह के लिए तैयारी

  1. रोसवेल पार्क मेमोरियल इंस्टिट्यूट (RPMI) १६४० माध्यम से 10% भ्रूण बछड़ा सीरम, 2 मिमी glutamine, और ५० µ एम 2-mercaptoethanol के एक ०.२२ µM वैक्यूम फिल्टर कुप्पी इकाई के शीर्ष करने के लिए पूरक के एक समाधान जोड़कर २५० मिलीलीटर पूरा मीडिया तैयार है, और वैक्यूम लागू होते हैं ।
    नोट: पूर्ण मध्यम 4 डिग्री सेल्सियस पर 2 महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
  2. एक ५०० मिलीलीटर कुप्पी में १५० मिलीलीटर बाँझ एच2ओ के साथ १००% इथेनॉल के ३५० मिलीलीटर मिश्रण से ७०% इथेनॉल समाधान तैयार करें ।
  3. सेट 4 ° c करने के लिए केंद्रापसारक ।
  4. संदंश, स्केलपेल, और ७०% इथेनॉल में कैंची निष्फल ।
  5. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, ३ ६० mm पेट्री व्यंजन के लिए पूरा मीडिया के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
  6. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए पूरा मीडिया के 30 मिलीलीटर जोड़ें ।

2. Murine अस्थि मज्जा कोशिकाओं का संग्रह

  1. २०१३ अमेरिकी पशु चिकित्सा संघ (AVMA) द्वारा स्थापित नियमों के अनुसार सह2 narcosis द्वारा एक C57BL/6 माउस Euthanize इच्छामृत्यु पर दिशानिर्देश ।
  2. निकालें और पट्टी हिंद पैर ।
    1. ७५% इथेनॉल के साथ हिंद पैर और धड़ संतृप्त, और घुमावदार ऊतक कैंची के साथ संयुक्त कूल्हे के आसपास त्वचा के माध्यम से उथले कटौती करते हैं । संदंश का प्रयोग, दृढ़ता से कूल्हे से त्वचा को टखने की ओर खींच, मांसपेशी खुलासा । त्वचा प्रालंब को दूर करने के लिए कैंची का प्रयोग करें ।
    2. सिर्फ फीमर/कूल्हे के ऊपर की हड्डी के माध्यम से काटने से पूरे हिंद पैर निकालें ।
      नोट: क्षेत्र को निष्फल करने के अलावा, इथेनॉल को साफ कटौती प्रदान करने में सहायता करेगा और बालों को दूषित नमूनों से बचाता है ।
    3. यदि पैर अस्थि मज्जा संचयन के लिए एक नए स्थान पर स्थानांतरित किया जाएगा, पूरा मीडिया में पैर जलमग्न ।
  3. एक बाँझ सुरक्षा कैबिनेट में काम करना, पहले से तैयार पेट्री व्यंजन में से एक के लिए पैर हस्तांतरण ।
  4. कैंची का उपयोग करने के लिए बस के नीचे टखने में कटौती, और ध्यान से संभव के रूप में मांसपेशियों और लोचदार संयोजी ऊतक के रूप में ज्यादा दूर । दूसरी तैयार पेट्री डिश को जरुर हड्डी में ट्रांसफर करें ।
    नोट: हालांकि यह आवश्यक नहीं है सभी मांसपेशियों को दूर करने के लिए, बहुत अधिक शेष ऊतक यह मुश्किल बाहर अस्थि मज्जा फ्लश करने के लिए कर सकते हैं ।
  5. फीमर, घुटने, और टिबिया को अलग करें ।
    1. संदंश का प्रयोग, घुटने में पैर पकड़ और मज्जा का पता लगाने ।
      नोट: अस्थि मज्जा फीमर के शीर्ष पर और टिबिया के अंत की ओर हड्डी गुहा के अंदर एक बेहोश लाल रेखा के रूप में दिखाई जानी चाहिए ।
      1. कैंची का प्रयोग, इस प्रकार के रूप में तीन कटौती करते हैं ।
        1. टिबिया बस ऊपर जहां मज्जा को समाप्त करने के लिए प्रकट होता है काटा ।
        2. बस घुटने के नीचे संयुक्त कट ।
        3. बस घुटने के ऊपर संयुक्त कट ।
        4. अगर कूल्हे संयुक्त अभी भी फीमर से जुड़ा हुआ है, बस कूल्हे के नीचे कट संयुक्त ।
      2. पेट्री डिश के लिए तीन टुकड़े वापस और दूसरे पैर पर इस प्रक्रिया को दोहराने ।
  6. फीमर और टिबिया से फ्लश अस्थि मज्जा ।
    1. ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब से पूरा मीडिया के साथ एक 10 मिलीलीटर सिरिंज भरें, और 23 जी सुई के साथ टोपी ।
    2. तीसरे तैयार पेट्री डिश के ऊपर संदंश के साथ हड्डी होल्डिंग, अस्थि नहर में सुई डालें और के माध्यम से मीडिया पुश, बाहर कोशिकाओं निस्तब्धता (जो एक बरकरार "प्लग" या के रूप में कई समूहों के रूप में उभर सकते हैं) । कोई और अधिक रंग की हड्डी के माध्यम से देखा जा सकता है जब तक दोहराएँ । आवश्यक के रूप में मीडिया के साथ सिरिंज फिर से भरना.
  7. epiphyses को कुचलना ।
    1. जबकि अभी भी दूसरे पेट्री डिश में, संदंश के साथ मजबूती से घुटने टोपी पकड़, और सिरिंज की नोक के साथ घुटनों मैश । जारी रखें जब तक कि epiphyses अब लाल नहीं हैं ।
  8. सिरिंज का प्रयोग, दूसरे और तीसरे पेट्री डिश से ५० एमएल ट्यूब के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण । ऊपर और नीचे धीरे pipetting द्वारा ऊपर के झुरमुट को गोलमाल । बुलबुले उत्पन्न करने के लिए नहीं की कोशिश करो । 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक ।
  9. लाइसे लाल रक्त कोशिकाओं
    1. सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ supernatant निकालें, झाड़ना द्वारा गोली हटाना, और लाइसे (अमोनियम क्लोराइड-पोटेशियम) के 1 मिलीलीटर में मशीन द्वारा लाल रक्त कोशिकाओं के कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए बफर Lysis ।
    2. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, HBSS (हैंक्स संतुलित नमक समाधान) बफर की ४० मिलीलीटर जोड़ें ।
  10. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, हालांकि एक नया ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में एक ७० µm सेल छलनी कोशिकाओं फिल्टर । 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक ।
  11. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, supernatant और धोने कोशिकाओं पूर्ण मीडिया के ४० मिलीलीटर के साथ निकालें । 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक ।
    नोट: इस स्तर पर, वंश सकारात्मक लिम्फोसाइटों FACS या चुंबकीय स्तंभ शुद्धि द्वारा हटाया जा सकता है । हालांकि, लिम्फोसाइटों संस्कृति में दीर्घकालिक नहीं रखा जाता है । हालांकि वंश सकारात्मक कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या अस्थि मज्जा पूर्व vivoमें Ly6C-CD115-जनसंख्या में मौजूद हैं, लगभग सभी 5 दिन से अनुपस्थित रहे है (चित्रा 2) ।
  12. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, supernatant निकालें, और संस्कृति पूर्ण मीडिया में अस्थि मज्जा कोशिकाओं के साथ 10 एनजी/एमएल के एक घनत्व पर रिकॉमबिनेंट माउस जीएम-सीएसएफ 1 x 106 कोशिकाओं/
    नोट: आमतौर पर, 4 x 107 कुल कोशिकाओं लाल रक्त कोशिका lysis के बाद काटा जा सकता है । हालांकि, के रूप में छोटे के रूप में 2 x 10 शुरुआती के लिए7 और अनुभवी हार्वेस्टर्स के लिए 5 x 107 कोशिकाओं को उंमीद करते हैं ।
  13. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग, ऊतक संस्कृति प्लेटों के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण, और 5% CO2में ३७ ° c पर मशीन । अगर एक 24 अच्छी तरह से प्लेट का उपयोग कर, बीज प्रत्येक अच्छी तरह से 2 मिलीलीटर सेल निलंबन के साथ ।
  14. हर ४८ एच, एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करने के लिए मीडिया के आधे हटाने और नए सिरे से पूरा मीडिया और जीएम सीएसएफ के साथ बदलें ।
    नोट: संस्कृतियों को 9 दिनों तक रखा जा सकता है. हालांकि, समय के साथ संरचना परिवर्तन । अधिक जानकारी के लिए अनुभाग 3 देखें ।

3. क्रमबद्ध के दिन का चयन

  1. के रूप में सेल जनसंख्या रचनाएं समय के साथ बदल, एक दिन का चयन करें कि पैदावार वांछित कोशिकाओं की सबसे अधिक संख्या ।
  2. 1 x 107 कोशिकाओं प्रति जीएम-सीएसएफ में संस्कृति के 3, 5, और 7 दिनों के बाद आबादी से प्रत्येक के लिए अपेक्षित सेल उपज पोस्ट प्रकार के लिए 1 तालिका देखें ।

4. धुंधला रणनीति

  1. नियंत्रण नमूने तैयार करने के लिए कक्षों की छोटी aliquots का उपयोग करें । एक दाग नियंत्रण, मुआवजा नियंत्रण केवल एक फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी प्रत्येक के साथ दाग नमूने शामिल हैं, और प्रतिदीप्ति-ऋण-एक नियंत्रण जिसमें सभी एंटीबॉडी एक को छोड़कर जोड़ रहे हैं, गैर के लिए नियंत्रण करने के लिए उस चैनल में विशिष्ट प्रतिदीप्ति । यदि अप्रत्यक्ष लेबलिंग का प्रयोग, प्राथमिक अकेले, माध्यमिक अकेले, और दोनों प्राथमिक और माध्यमिक शामिल हैं ।
    नोट: Phycoerythrin (पीई) और allophycocyanin (APC) टैग की गईं एंटीबॉडी जब एक साथ इस्तेमाल पर न्यूनतम खून के साथ अलग जुदाई प्रदान करते हैं । हालांकि, अगर fluorochrome विकल्प सीमित हैं, CD115 एक अपेक्षाकृत कम स्तर पर व्यक्त की है, जबकि Ly6C बहुत उच्च स्तर पर व्यक्त की है । इसलिए, उज्जवल fluorochromes विरोधी CD115 के लिए वांछनीय हैं, और विरोधी Ly6C fluorochromes पर खून रोकने के लिए चुना जाता है ।
  2. १०० FACS धोने बफर (FWB) के ९७ मिलीलीटर ठंडा Dulbecco फॉस्फेट बफर खारा (DPBS) के साथ एक ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब में भ्रूण बछड़ा के 3 मिलीलीटर, और एक बर्फ स्नान में जगह के मिश्रण से तैयार करें ।
  3. एक पिपेट का प्रयोग धीरे, लेकिन अच्छी तरह से, पिपेट कोशिकाओं को ऊपर और नीचे किसी भी शिथिल अनुयाई कोशिकाओं को उखाड़ फेंकना ।
  4. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग कर, ५० मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं को हस्तांतरण । 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक ।
    1. यदि सेल की मात्रा ५० मिलीलीटर से अधिक है, ट्यूबों की आवश्यक संख्या में स्थानांतरण कोशिकाओं और धुंधला कदम पर गठबंधन ।
  5. धीरे से supernatant डालो, और एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ FWB के 30 मिलीलीटर जोड़कर छर्रों कोशिकाओं को धो लें । 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक, और धो दोहराएं ।
    नोट: यदि उच्च कोशिका मृत्यु की उंमीद है, कोशिकाओं FWB के साथ के रूप में कम के रूप में ०.५% भ्रूण बछड़ा सीरम (FCS) के साथ धोया जा सकता है । इससे सेल का झुरमुट रोका जा सकेगा ।
  6. निलंबित और एंटीबॉडी निर्माता के निर्देशों के अनुसार कोशिकाओं दाग ।
    1. FWB के 1 मिलीलीटर में 5 x 107 कोशिकाओं को निलंबित और 2 µ g विरोधी के प्रत्येक Ly6C और विरोधी CD115 (शोधकर्ता की पसंद के fluorophores के साथ लेबल) जोड़ें । आगे moDC से सीएमपी भेद करने के लिए (दोनों Ly6C-और CD115 हैं-), विरोधी CD11c एंटीबॉडी के 2 µ जी जोड़ें (सीएमपी CD11c हैं-; moDC हैं CD11c+). बर्फ पर 30 मिनट के लिए मशीन ।
      नोट: चित्रा 3 Ly6C-पीई और CD115-APC का उपयोग कर उत्पन्न किया गया था.
  7. एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करना, FWB के 10 मिलीलीटर जोड़ें, और 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक ।
  8. धीरे से supernatant डालो, और एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट के साथ FWB के 30 मिलीलीटर जोड़कर छर्रों कोशिकाओं को धो लें । 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक, और धो दोहराएं ।
  9. कोशिकाओं को निलंबित करने से पहले, झटका ट्यूब अच्छी तरह से गोली बेदखल करने के लिए । सीरम वैज्ञानिक पिपेट 1 x 107 कक्ष/एमएल FWB, और फ़िल्टर ३५-µm सेल फ़िल्टर के माध्यम से पर निलंबित करने के लिए उपयोग करें । के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का प्रयोग करें, और जब तक तरह तैयार करने के लिए बर्फ पर जगह है ।
    नोट: यदि उपलब्ध नहीं है, प्रोटीन लेपित (नोनफेट शुष्क दूध या FCS) polystyrene ट्यूबों के लिए बाध्यकारी कम किया जा सकता है ।

5. सेट गेट्स नियंत्रण के नमूनों पर आधारित

नोट: उच्च गति प्रवाह स्ट्रीम के दबाव के कारण सेल व्यवधान को रोकने के लिए, सेल छंटाई के लिए एक 100 – 130 µm नोजल का उपयोग करें ।

  1. (चरण ४.१) कक्ष सॉर्टर के माध्यम से देखें दाग नियंत्रण चलाएँ, और छोटे मलबे को बाहर करने के लिए एक गेट लागू करें (कम आगे तितर बितर; FSC) और अत्यधिक दानेदार (उच्च पक्ष तितर बितर; एसएससी) कण ।
    1. केवल बाद के चरणों का विश्लेषण करने के लिए (monocytes, moMac/MoDP, और MoDC), केवल बड़े कक्षों (उच्च गेटिंग) को शामिल करने के लिए FSC लागू करें ।
    2. यदि व्यवहार्यता दाग इस्तेमाल किया जा रहा है, इन का उपयोग करने के लिए दाग, गैर व्यवहार्य घटनाओं को बाहर (एक उदाहरण के चित्र 1में सचित्र है) ।
  2. सेल सॉर्टर के माध्यम से एकल फ्लोरोसेंट नियंत्रण नमूने चलाने के लिए, और मुआवजे की जरूरत के रूप में समायोजित करें ।
  3. मल्टी-लेबल वाले नमूने का एक नमूना चलाएं । निरीक्षण चार अलग आबादी: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), और Ly6C-CD115-(CMPs/moDCs) । चार बड़ी आबादी में से प्रत्येक को अलग करने के लिए एक गेट लागू करें ।
    नोट: CMPs और moDC शेयर Ly6C-CD115-phenotype । हालांकि, वे CD11c अभिव्यक्ति के आधार पर विभेदित किया जा सकता है: सीएमपी कमी CD11c, जबकि MoDCs एक्सप्रेस CD11c.

6. पृथक आबादी का संग्रह

  1. पर्याप्त FCS जोड़कर संग्रह ट्यूबों तैयार करने के लिए कम से 20% अंतिम एकाग्रता जब पूर्ण प्राप्त करने के लिए । उदाहरण के लिए, यदि 5 मिलीलीटर ट्यूबों का उपयोग कर, छंटाई से पहले FCS की 1 मिलीलीटर जोड़ें, और जब यह 5 मिलीलीटर कुल मात्रा तक पहुंच ट्यूब हटा दें ।
  2. झिल्ली कारोबार और एंटीबॉडी को रोकने के लिए, सभी नमूनों को रखने के लिए (मिश्रित और क्रमबद्ध) 4 डिग्री सेल्सियस भर में सॉर्ट ।
    1. यदि यह संभव नहीं है, के रूप में अधिक संभव के रूप में बर्फ पर हल किया जा करने के लिए कोशिकाओं युक्त ट्यूब रखने के लिए और जरूरत के रूप में सॉर्टर को aliquots हस्तांतरण.
    2. इसके अतिरिक्त, हर 20-30 मिनट बर्फ के लिए हल नमूने हस्तांतरण ।
  3. कोशिकाओं की वांछित संख्या एकत्र किया गया है के बाद, एक नया शंकु ट्यूब के लिए कोशिकाओं को स्थानांतरित करने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट का उपयोग करें । 10 मिनट के लिए 4 ° c पर २५० x g पर केंद्रापसारक ।
    1. प्रत्येक एकत्र जनसंख्या से छोटे aliquots पर पोस्ट-क्रमबद्ध विश्लेषण के साथ शुद्धता की पुष्टि करें ।
  4. supernatant निकालें, FWB के 10 मिलीलीटर में निलंबित और 4 ° c पर २५० x g में 10 मिनट के लिए दो बहाकर एक कुल के लिए दोहराएं ।
    नोट: यह गोली अस्थाई बिना सभी supernatant को दूर करने के लिए मुश्किल हो सकता है । एक वैक्यूम लाइन के लिए एक पिपेट टिप संलग्न हटाने के साथ मदद कर सकते हैं । यदि यह उपलब्ध नहीं है, यह सुझाव दिया है कि supernatant गोली पृथक्करण के मामले में एक ताजा ट्यूब में एकत्र किया जाना है ।
  5. दूसरा वॉश करने के बाद supernatant को निकाल लें ।
  6. यदि उपयोगकर्ता के प्रयोगात्मक डिजाइन हुक्म कोशिकाओं को फिर से, संस्कृति हो, 2.12-2.14 चरणों का पालन करें । अंयथा, यदि कक्षों का उपयोग तत्काल विश्लेषण के लिए किया जाएगा, तो इच्छित प्रोटोकॉल के अनुसार कक्ष तैयार करें ।
    नोट: विशिष्ट कार्यात्मक विश्लेषण का एक उदाहरण चित्रा 4में शामिल किया गया है ।

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Representative Results

संभव के रूप में विश्लेषण के लिए उपलब्ध कई चैनलों के रूप में रखने के प्रयास में, व्यवहार्य कोशिकाओं नियमित रूप से आगे और साइड स्कैटर के आधार पर चयन किया गया था, बहुत छोटे और बहुत दानेदार घटनाओं को छोड़कर (एक ठेठ गेट सभी डॉट भूखंडों के लिए लागू है चित्र 1aमें). यह निर्धारित करने के लिए यदि इस गेटिंग रणनीति मज़बूती से मृत कोशिकाओं को छोड़ दिया, हम 7 अमीनो actinomycin डी (7 AAD) (आंकड़ा 1b) के साथ दाग । 7AAD मृत और मर झिल्ली पारगम्यता के कारण कोशिकाओं में दाग डीएनए, और व्यवहार्य कोशिकाओं द्वारा बाहर रखा गया है । जीएम की व्यवहार्यता-सीएसएफ प्रसंस्कृत अस्थि मज्जा कोशिकाओं का विश्लेषण किया गया था तुरंत बाद फसल (पीएच) और 1, 3, और 5 पीएच. सेल तुरंत विश्लेषण पीएच 7 के लगभग 10% था-AAD सकारात्मक कोशिकाओं जब एक ठेठ FSC/एसएससी गेट हड्डी से ताजा अलग कोशिकाओं के लिए लागू किया गया था मज्जा (1 चित्रा, कटाई के बाद) । मृत कोशिकाओं के समान अनुपात भी दिन में मौजूद था 1 (~ 12%) और दिन 3 (~ 11%) of संस्कृति (चित्रा 1, 1 दिन पीएच और 3 दिन पीएच) । 5 दिन तक, फाटक के भीतर मृत कोशिकाओं की संख्या ~ 5% (चित्रा 1, 5 दिन पीएच) को कम किया गया था । इस प्रकार, एक व्यवहार्यता गेट का उपयोग आम तौर पर 5 दिन और बाद छंटाई के लिए उपयुक्त है । इसलिए, उपयोगकर्ताओं को उपलब्ध पैरामीटर में सीमित हैं, तो FSC/SSC गेटिंग आमतौर पर उपयुक्त है । हालांकि, अधिक संवेदनशील परख के लिए (विशेष रूप से यदि वे सटीक सेल संख्या पर निर्भर), एक व्यवहार्यता दाग (सुझाव) शामिल ।

वृक्ष कोशिकाओं के प्रचार प्रसार के लिए कई प्रोटोकॉल संस्कृति 11,17से पहले अस्थि मज्जा से वंश सकारात्मक कोशिकाओं, विशेष रूप से लिम्फोसाइटों, की कमी की सिफारिश. इस प्रक्रिया के जीएम-सीएसएफ-मध्यस्थता भेदभाव पर बरामद कोशिकाओं की पवित्रता बढ़ाने के लिए सोचा है । आमतौर पर, कोशिकाओं टी कोशिकाओं (CD3), बी कोशिकाओं (CD45R या CD19), और NK कोशिकाओं (NK 1.1) के मार्करों को व्यक्त करने के लिए सकारात्मक चयन द्वारा समाप्त किया जा सकता चुंबकीय मोती या कक्ष छंटाई 11,17,18। हालांकि, संवर्धन प्रणाली के आधार पर, लिम्फोसाइटों शायद ही कभी बरामद या इन परख में पता चला रहे थे । इस प्रकार, हमने जीएम-सीएसएफ-चालित कक्षों (चित्रा 2a) के बीच Ly6C-CD115-जनसंख्या में लिम्फोसाइटों की दीर्घायु का आकलन करने की मांग की । जीएम-सीएसएफ संस्कृतिपूर्ण अस्थि मज्जा कोशिकाओं (है कि समाप्त नहीं किया गया था वंश) CD3, CD45R, और nk 1.1 के लिए एंटीबॉडी के साथ दाग रहे थे (एक ही fluorophore में) और प्रवाह cytometry (चित्रा बी) द्वारा दैनिक मापा । Ly6C-CD115-जनसंख्या के भीतर, CD3/CD45R सकारात्मक कोशिकाओं 0 – 3 (चित्रा 2 बी) दिनों के माध्यम से दृढ़ता से बनी हुई है । 4 दिन पर, केवल कुछ CD3/CD45R सकारात्मक कोशिकाओं बने रहे, और दिन 5 और 6 के द्वारा, वहां थे कोई CD3/CD45R व्यक्त कोशिकाओं उपस्थित । इस प्रकार, जीएम-सीएसएफ में संस्कृति के 4 दिनों के भीतर, वंश सकारात्मक कोशिकाओं को अनिवार्य रूप से अनुपस्थित थे और 5 और संस्कृति के 6 दिनों में सभी पर नहीं पाया गया ।

जीएम सीएसएफ की संरचना सेल संस्कृति इस प्रणाली में दैनिक परिवर्तन के रूप में कोशिकाओं को विकसित करने और अंतर (तालिका 1; चित्रा 3) । प्रारंभिक समय बिंदुओं पर, सबसे प्रचुर मात्रा में कोशिकाओं progenitors और पुरोगामी हैं, और बाद के समय में कोशिकाओं के बहुमत अधिक 10विभेदित कर रहे हैं । निर्धारित करने के लिए कैसे संस्कृति के विभिंन दिनों पर छंटाई बाद के विकास के रास्ते या कैनेटीक्स को प्रभावित कर सकता है, प्रकार 3, 5 प्रदर्शन किया गया, और 7 दिन पीएच (1 ए3) । MoMac जनसंख्या (Ly6C-CD115 +) के विकास के बाद संस्कृति (चित्रा3 डी) में 2-3 आगे दिन पर नज़र रखी गई ।

जब हल 3 दिन पीएच, केवल ४०% Ly6C-CD115 + कोशिकाओं के 24 घंटे के भीतर CD115 अभिव्यक्ति की कमी हुई थी पोस्ट-सॉर्ट (PS) (चित्र 3 बी) । द्वारा ४८ एच पी एस, अंश है कि नीचे विनियमित CD115 था ६६% था, और ७२ एच द्वारा, ७०% कोशिकाओं के इस phenotype था । इस phenotypic रचना (~ 70-72% Ly6C-CD115-) संस्कृति के आगे के दिनों के बाद भी (डेटा नहीं दिखाया) बनाए रखा गया था । जब हल 5 दिन पीएच, ~ कोशिकाओं के ७५% Ly6C-CD115 थे, तेजी से नीचे 24 एच पी एस के भीतर विनियमित CD115, और ~ ८०% थे CD115-केवल ४८ एच के बाद । यह वितरण ७२ ज (चित्रा 3सी) के बाद बनाए रखा गया था । अंत में, जब हल 7 दिन पीएच, नीचे CD115 के विनियमन भी काफी तेजी से था । 24 एच पी एस के भीतर, ~ ७५% कोशिकाओं के नीचे था विनियमित CD115 अभिव्यक्ति, और इस प्रवृत्ति के बाद बनाए रखा गया था ४८ (चित्रा 3 डी) । दिलचस्प है, जब 7 दिन में हल, CD115 अभिव्यक्ति के समग्र स्तर CD115 + जनसंख्या के भीतर कोशिकाओं पर कम था ।

इस प्रकार, इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि विकास के कैनेटीक्स कुछ हद तक धीमी गति से कर रहे है जब एक प्रारंभिक दिन में छंटाई, इस तरह के दिन के रूप में 3 क्रमबद्ध कोशिकाओं और अधिक तेजी से विकास और भेदभाव की तुलना में दिन पर छंटाई के बाद मनाया 5 या 7 । इन परिणामों के आधार पर, एक उपयोगकर्ता moDC की बड़ी संख्या की मांग की संभावना तरह दिन 5 या 7 पर होना चाहिए ।

डीसी की परिपक्वता प्रतिक्रिया अच्छी तरह से 6,7,12,14की स्थापना की है । जब रोगज़नक़ से जुड़े आणविक पैटर्न (PAMPs), अपरिपक्व डीसी अप की एक किस्म के साथ इलाज किया-MHC की अभिव्यक्ति को विनियमित, costimulatory अणुओं, और समर्थक भड़काऊ साइटोकिंस, अपने टी सेल को बढ़ाने क्षमता 6सक्रिय. हालांकि, यह कम स्पष्ट जब कोशिकाओं के विकास के लिए PAMP उत्तेजना और जो डीसी परिपक्वता की सुविधा वे प्रदर्शित हो सकता है की प्रतिक्रिया की क्षमता हासिल है । जो क्रमबद्ध आबादी का निर्धारण करने के लिए परिपक्वता उत्तेजनाओं का जवाब होगा, प्रत्येक जनसंख्या शीघ्र ही पाली I:C, lipopolysaccharides (एलपीएस), और CpG डीएनए सहित PAMPs के एक कॉकटेल के साथ छंटाई के बाद इलाज किया गया था टोल रिसेप्टर (TLR) की तरह ट्रिगर करने के लिए 3 (TLR3), TLR4, और TLR9, क्रमशः । कोशिकाओं का इलाज किया गया (या अनुपचारित) के लिए 24 ज और CD86 की अभिव्यक्ति और MHCII प्रवाह cytometry द्वारा मापा गया था (चित्रा 4a-4B). इसके अलावा, il-12p40/70 और आईएल-6 उत्पादन supernatants में cytokine सरणी एलिसा (चित्रा 4c-4d) द्वारा मापा गया था ।

CMPs और GMPs एक उत्तेजित राज्य में MHC वर्ग द्वितीय और CD86 के बहुत कम स्तर पर व्यक्त की है, और इन अभिव्यक्ति पैटर्न PAMPs (चित्रा 4a और 4B) के कॉकटेल के लिए जोखिम पर काफी परिवर्तन नहीं किया । इसी तरह, monocytes द्वारा MHC कक्षा द्वितीय की अभिव्यक्ति भी कम थी और PAMP जोखिम पर थोड़ा बदल (4a आंकड़ा) । हालांकि, CD86 की अभिव्यक्ति छंटाई के बाद monocytes 24 एच पर उदारवादी था, और यह आगे बढ़ा 24 एच उत्तेजना निंनलिखित । MHC वर्ग द्वितीय और MoMacs और MoDCs में CD86 के उच्च बेसल अभिव्यक्ति मनाया गया था, और दोनों आबादी PAMP उत्तेजना पर इन अणुओं के एक मजबूत प्रेरण प्रदर्शन किया । उत्तेजना के बाद MHC वर्ग द्वितीय अभिव्यक्ति के संदर्भ में, वहां CMPs, GMPs, और monocytes के बीच कोई सांख्यिकीय अंतर था, जबकि MoMacs और MoDCs एक विशिष्ट समूह का गठन किया । फिर भी, CD86 अभिव्यक्ति के संदर्भ में, CMPs और GMPs कोशिकाओं सांख्यिकीय MoMacs और MoDCs से अलग थे । हालांकि, monocytes MoMacs या MoDCs से अलग नहीं थे ।

हम अगले पांच आबादी में से प्रत्येक के सापेक्ष क्षमता का आकलन करने के लिए TLR उत्तेजना के जवाब में साइटोकिंस उपज चाहता था । इस प्रकार, हम TLR एगोनिस्ट ऊपर इस्तेमाल किया कॉकटेल की उपस्थिति या अनुपस्थिति में संस्कृति के बाद हल आबादी पर एक cytokine परख प्रदर्शन किया । कोशिकाओं को 24 घंटे के लिए उत्तेजनाओं के साथ संस्कृति थे, तो supernatants एकत्र किए गए । हम बहुत कम il-12p40/70 या il-6 उत्पादन TLR उत्तेजना पर CMPs द्वारा (चित्रा 4c-4d) मनाया । दूसरी आबादी, GMPs, il-12p40/70 (चित्र 4c) का उत्पादन करने में असमर्थ थे, लेकिन इन कोशिकाओं PAMPs (चित्रा 4d) द्वारा उत्तेजना पर il-6 की एक कम राशि का उत्पादन किया । उत्तरार्द्ध में तीन आबादी में cytokine उत्पादन के उच्चतम स्तर मनाया गया । Monocytes और MoMacs बहुत समान पैटर्न और cytokine उत्पादन के परिमाण था । दोनों बहुत वृद्धि हुई il-12p40/70 और मामूली वृद्धि हुई il-6 उत्पादन उत्तेजना ऊपर (चित्रा 4c-4d) । दिलचस्प बात यह है कि PAMPs MoDCs की उपस्थिति में IL-12p40/ हालांकि, इस आबादी ने आईएल-6 उत्पादन (फिगर 4c-4d) को काफी बढ़ा दिया । इन निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि हल आबादी अलगाव के बाद उनके प्रतिरक्षा कार्य बनाए रखा ।

Figure 1
चित्रा 1: आगे की ओर तितर बितर गेट बनाम के भीतर व्यवहार्य कोशिकाओं । माउस अस्थि मज्जा जीएम में संस्कृति-सीएसएफ था, और व्यवहार्यता 7 का उपयोग कर मापा गया-AAD (7 एमिनो-actinomycin डी) धुंधला के बाद फसल (पीएच) और 1, 3, और 5 दिनों के बाद फसल । (क) व्यवहार्य कोशिकाओं एक फाटक (व्यवहार्य) जो छोटे और उच्च दानेदार FSC और एसएससी पर आधारित घटनाओं का लोप लागू करने के द्वारा चयनित किया गया । (ख) 7-AAD के हिस्टोग्राम व्यवहार्य (FSC/एसएससी) गेट के भीतर की घटनाओं से उत्पंन दाग । 7-AAD के लिए सकारात्मक घटनाक्रम apoptosis के दौर से गुजर कोशिकाओं का संकेत । तीर व्यवहार्य सेल गेटिंग संकेत मिलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: Ly6C-CD115-जनसंख्या के भीतर लिम्फोसाइटों । माउस अस्थि मज्जा जीएम में संस्कृति-सीएसएफ और लिम्फोसाइट मार्करों (CD3, CD145R, और nk 1.1) प्रवाह cytometry द्वारा दैनिक विश्लेषण किया गया । (क) कोशिका Ly6C-पीई और CD115-सुरक्ष से Ly6C-CD115-कोशिकाओं की पहचान के लिए दाग थे. चक्र गेट एकल रंग नियंत्रण के आधार पर लागू किया गया था. Pseudocolor डॉट साजिश 0 दिन से उत्पंन (ख) CD3, CD45R, और Ly6C की nk 1.1 अभिव्यक्ति-CD115-कोशिकाओं फसल के दिन पर विश्लेषण किया गया था (दिन 0) 6 दिन तक । कक्ष गणना प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके मोड में सामान्यीकृत किए गए थे । तीर Ly6C-CD115-गेटिंग को इंगित करता है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: विभिन्न दिनों पर छंटाई के बाद Ly6C-CD115 + कोशिकाओं के विकास के कैनेटीक्स. (क) माउस अस्थि मज्जा काटा गया था और जीएम-सीएसएफ में संस्कृति । Aliquots 1 x 107 कोशिकाओं (बी) 3, (ग) 5, या (घ) 7 दिनों के बाद फसल (पीएच) काटा गया था । संकेत दिन पीएच पर, Ly6C-CD115 + कोशिकाओं मिश्रित संस्कृति से हल किया गया (पूर्व सॉर्ट) और तुरंत पोस्ट-सॉर्ट (PS) विश्लेषण । क्रमबद्ध कोशिकाओं को फिर से जीएम-सीएसएफ में कल्चरित थे, और Ly6C/CD115 अभिव्यक्ति में परिवर्तन प्रवाह cytometry द्वारा दैनिक विश्लेषण किया गया । बॉक्स और तीर सॉर्टिंग गेट इंगित करता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: परिपक्वता और cytokine अभिव्यक्ति निंनलिखित TLR उत्तेजना । कक्ष 5 आबादी में संस्कृति के दिन 3 पर जीएम-सीएसएफ में हल किया गया । वे तो PAMPs के एक कॉकटेल के साथ इलाज किया गया (एलपीएस, पाली I:C, और CpG डीएनए) के लिए 24 ज. मतलब फ्लोरोसेंट तीव्रता (MFI) के (ए) MHC वर्ग द्वितीय और (ख) CD86 तुरंत विश्लेषण किया गया था के बाद तरह (पी एस) और 24 के साथ एच और PAMPs के बिना प्रवाह cytometry द्वारा । त्रुटि पट्टियां 3-5 प्रतिकृति प्रयोगों के मानक विचलन का प्रतिनिधित्व करते हैं । (C) il-12p40/70 और (D) il-6 से supernatants में 3 pooled नमूनों से मापा गया cytokine सरणी डॉट दाग एलिसा के बाद के साथ और बिना PAMPs 24 ज । RLU; सापेक्ष प्रकाश इकाइयां; -/+ निर्दिष्ट जनसंख्या के लिए सेल सतह मार्कर की उपस्थिति का संकेत है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Day 3 Day 5 Day 7
Phenotype कक्ष प्रकार न्यूनतम अधिकतम न्यूनतम अधिकतम न्यूनतम अधिकतम
Ly6C-CD115-CD11c- Cmp 3 x 106 4 x 106 5 x 105 1 x 106 N/a N/a
Ly6C + CD115- जीएमपी 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 N/a N/a
Ly6C + CD115 + मोनो 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 5 x 105 1 x 106
Ly6C-CD115 + MoMac 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106 3 x 106 4 x 106
Ly6C-CD115-CD11c + MoDC N/a N/a 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106

तालिका 1: अपेक्षित ंयूनतम और अधिकतम कक्षों की संख्या पोस्ट-सॉर्ट प्रति 1 x 107 कक्षों को पुनर्प्राप्त । सीएमपी (आम माइलॉयड जनक); जीएमपी (granulocyte/मैक्रोफेज जनक) मोनो (monocytes); MoMac (monocyte-व्युत्पन्न मैक्रोफेज); MoDC (monocyte-व्युत्पन्न वृक्ष कोशिका); N/a (उपलब्ध नहीं); न्यूनतम (1 x 107 कोशिकाओं से बाहर ंयूनतम सेल उपज); अधिकतम (1 x 107 कोशिकाओं से बाहर अधिकतम सेल उपज) ।

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Discussion

इस प्रोटोकॉल जीएम-सीएसएफ के अलगाव की सुविधा जनक और अग्रदूतों की संख्या में संकेतक सेल प्रकार जैव रासायनिक परख सहित विश्लेषण के कई प्रकार के लिए पर्याप्त, इन विट्रो मेंसेलुलर समारोह की परख, या vivo मेंजगाकर । इस विधि monocyte के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण अग्रिम का प्रतिनिधित्व करता है-व्युत्पंन वृक्ष कोशिका विकास, विश्वसनीय अलगाव और कोशिकाओं की पहचान के विकास के इस मार्ग में जल्दी सक्षम करने के साथ ही उन विभेदित कोशिका प्रकार अधिक सामांयतः पूर्व अध्ययनों में पृथक ।

progenitors और अग्रदूतों में अस्थि मज्जा से उत्पन्न की अलगाव के लिए पिछले प्रोटोकॉल इन विट्रो CFSE पर भरोसा किया है-प्रफलन जनक कोशिकाओं 17 की पहचान करने के लिए धुंधला या CD31 और Ly6C के साथ माइलॉयड कोशिकाओं के मार्कर के रूप में धुंधला पर 18 . नाईक द्वारा वर्णित CFSE दाग प्रोटोकॉल को Flt3L-चालित डीसी progenitors और पुरोगामी 17की पीढ़ी में इस्तेमाल के लिए तैयार किया गया था । जब हम जीएम सीएसएफ संस्कृति प्रणाली में इस दृष्टिकोण का प्रयास किया, हम दो मुख्य मुद्दों का सामना करना पड़ा । CFSE कुछ विकासशील कोशिकाओं को साइटोटोक्सिक था और बहुत उज्ज्वल था (यहां तक कि विभाजित कोशिकाओं में) है कि यह मुआवजा मुश्किल बना दिया । यह दृष्टिकोण प्रारंभिक कोशिका प्रकार (progenitors) को अलग करने के हमारे लक्ष्यों के लिए अनुपयुक्त साबित हुआ, साथ ही साथ विकासात्मक स्पेक्ट्रम भर में कोशिकाओं, अत्यधिक प्रफलन (CMPs/GMPs) से अत्यधिक विकसित (MoDC/MoMac) । हम भी जीएम के लिए छंटाई रणनीति-सीएसएफ की कोशिश की Leenen समूह है जो CD31 और Ly6C 18पर आधारित था द्वारा वर्णित कोशिकाओं चालित । हालांकि, हमने पाया कि CD31 समस्याग्रस्त था । यह बहुत कम स्तर पर व्यक्त की थी (यह मुश्किल बनाने के लिए साफ छंटाई के लिए आबादी को हल करने के लिए) कोशिकाओं के एक लुप्त छोटे सबसेट द्वारा, और केवल बहुत संस्कृति अवधि के दौरान जल्दी । वास्तव में, CD31 अभिव्यक्ति जीएम-सीएसएफ 10में संस्कृति के पिछले दिन 2 detectable नहीं था ।

Ly6C, हालांकि, 10अभिव्यक्ति के अपने क्षणिक पैटर्न के कारण विकास के विभिन्न चरणों में कोशिकाओं को अलग करने के लिए एक बहुत ही उपयोगी अणु था. CD115 के अलावा हमें मध्यवर्ती और विकास की है कि CD31 के साथ संभव नहीं था के बाद के चरणों में और अधिक निकटता से विचार कोशिकाओं को सक्षम होना चाहिए । हम भी इन प्रारंभिक कोशिकाओं 10की बड़ी संख्या को अलग करने की उंमीद में CD34 और CD117 जैसे progenitors के अंय मार्करों की जांच की । हालांकि, कि Flt3L प्रणाली में रिपोर्ट के विपरीत, हमने पाया है कि CD34 और CD117 भी कोशिकाओं के एक बहुत छोटे सबसेट पर व्यक्त किए गए थे और 17संस्कृति के दिन 3 से वस्तुतः अनुपस्थित थे । इन स्टेम सेल मार्करों भविष्य के अध्ययनों में उपयोगी हो सकता है तथापि, सीएमपी या जीएमपी आबादी के भीतर उपसमुच्चय भेद ।

वहां कई प्रोटोकॉल है कि वांछित कोशिका आबादी की उपज को प्रभावित कर सकते है संभावित संशोधनों हैं । सबसे पहले, उपयोगकर्ता के लिए एक व्यवहार्यता किसी भी मृत कोशिकाओं को बाहर निकालने के दाग लागू चुन सकते हैं । टिप्पणियों के आधार पर, एक ठेठ आगे और पक्ष तितर बितर गेट के भीतर मृत कोशिकाओं की दर अपेक्षाकृत सामांय में कम कर रहे हैं, और केवल संस्कृति के पहले कुछ दिनों के दौरान समस्याओं मुद्रा, वंश सकारात्मक लिम्फोसाइटों में कमी के साथ संयोग । हालांकि, अनुप्रयोगों के लिए जिसमें कक्ष संख्या सटीक होना चाहिए, एक व्यवहार्यता दाग मृत कोशिकाओं का अपवर्जन सुनिश्चित करेगा ।

एक दूसरे संभावित संशोधन वंश की कमी है-सकारात्मक लिम्फोसाइटों संस्कृति से पहले । हम इस दृष्टिकोण की कोशिश की है वंश सकारात्मक कोशिकाओं है कि नियमित रूप से Ly6C-CD115-सेल जनसंख्या के भीतर मनाया गया की छोटी आबादी का पता । कुल सेल उपज 5 और 6 दिनों में थोड़ा कम था, और शुद्धता काफी अधिक नहीं था (डेटा नहीं दिखाया गया है) । इस प्रकार पवित्रता ने घटे हुए उपज का औचित्य नहीं समझा । इसी तरह, अगर उपयोगकर्ता के लिए 5 दिन या बाद में तरह की योजना, संस्कृति के भीतर लिम्फोसाइटों की आवृत्ति अच्छी तरह से 1% से नीचे है और एक समस्या उपस्थित नहीं करना चाहिए ।

अंत में, क्योंकि इस रणनीति के लिए एक बड़े विकास स्पेक्ट्रम उपयोगकर्ता अपने तरह के समय दर्जी के लिए संभव के रूप में वांछित आबादी के कई के रूप में जमा करना चाहिए भर में कोशिकाओं को अलग बनाया गया है । इस छँटाई रणनीति ईमानदारी से कोशिकाओं को हल कर रहे हैं जिस पर संस्कृति के दिन की परवाह किए बिना संकेत दिया सेल प्रकार पैदावार. उदाहरण के लिए, phenotype Ly6C के साथ कोशिकाओं + CD115-CD11c-जीएमपी phenotype करने के लिए सही है और इस तरह से काम करते है कि वे हल कर रहे है और 3 या संस्कृति के 5 दिन पर अलग थलग । हालांकि, इन कोशिकाओं की आवृत्ति बहुत अधिक दिन 3 से 5 है, इसलिए यदि लक्ष्य इस सेल प्रकार के अलगाव है, 3 दिन पर छंटाई की सिफारिश की जाएगी । यह भी उल्लेखनीय है कि यदि वे दिन पर हल किया गया से अधिक धीमी कैनेटीक्स के साथ बाद के विकास चरणों के माध्यम से 3 प्रगति दिन पर हल कोशिकाओं 5 या 7 (चित्रा 3) ।

हालांकि इस विधि स्पष्ट विरेखांकन और 5 के अलगाव के लिए अनुमति देता है-6 विकासात्मक स्पेक्ट्रम के साथ अलग आबादी, वहां संभावना है कि इस मार्ग के साथ कई और अधिक आबादी या संक्रमणकालीन चरणों रहे हैं । पांच वर्णित आबादी में से प्रत्येक के भीतर वहां कई उप विकास के थोड़ा अलग वेतन वृद्धि पर आबादी हो सकती है । उदाहरण के लिए, हमने देखा है "अलग" CD115 के मध्यवर्ती स्तर और Ly6C के साथ आबादी है जो विकास के थोड़ा अलग पैटर्न से गुजरना, कितने moMac और moDC उत्पंन कर रहे है के संदर्भ में (डेटा नहीं दिखाया गया है) । यह भी संभावना है कि पहले vivo में मनाया आबादी संस्कृति और छंटाई प्रणाली में मौजूद हैं, लेकिन इन किया गया है उनके बहुत कम आवृत्ति के कारण की पहचान मुश्किल है । cMOP 19, एचडीपी 20, या CDP 21 के रूप में आबादी मौजूद होने की संभावना है, लेकिन बड़ी आबादी के भीतर छिप सकता है । भविष्य के अध्ययन के लिए आगे कई विकासात्मक चरणों कि विभेद के विशिष्ट मार्कर के अलावा के साथ इस छंटाई ढांचे के भीतर अलग किया जा सकता है स्पष्ट करने की जरूरत होगी । इस छंटाई रणनीति का मूल्य यह है कि यह डीसी ontogeny के दौरान विकास के विशिष्ट चरणों की बड़ी संख्या के अनुरूप अलगाव की अनुमति देता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

हम एलिसन चर्च बर्ड से तकनीकी सहायता के लिए Auburn विश्वविद्यालय के स्कूल में पशु चिकित्सा प्रवाह Cytometry सुविधा के लिए, NIH से धन के लिए ईएचएस R15 R15 AI107773 और Auburn विश्वविद्यालय में सेलुलर और आणविक जीवविज्ञान कार्यक्रम के लिए आभारी है PBR के लिए ग्रीष्मकालीन अनुसंधान के लिए धन ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HBSS buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60 mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50 mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10 mL Syringe BD Biosciences 301604
23 G needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

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References

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू १३८ वृक्ष सेल डेवलपमेंट जीएम-एससीएफ कॉमन माइलॉयड जनक granulocyte-मैक्रोफेज जनक Monocyte Monocyte-व्युत्पन्न वृक्ष सेल Monocyte-व्युत्पन्न मैक्रोफेज हाई स्पीड सेल छँटाई
एक उपंयास सेल छँटाई रणनीति का उपयोग कर Murine अस्थि मज्जा से माइलॉयड Progenitors और वृक्ष सेल पुरोगामी की बड़ी संख्या की पीढ़ी
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Rogers, P. B., Schwartz, E. H.… More

Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

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