Summary
Aquí proporcionamos un método para la identificación y aislamiento de grandes cantidades de GM-CSF por células mieloides con clasificación de celda de alta velocidad. Pueden identificarse cinco poblaciones distintas (progenitores mieloides comunes, progenitores de granulocitos/macrófagos, monocitos, macrófagos derivados de monocitos y DCs derivados de monocitos) basado en la expresión Ly6C y CD115.
Abstract
Cultivos de células dendríticas derivadas de monocitos (moDC) generadas a partir de médula ósea de ratón usando Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) han sido reconocidos recientemente para ser más heterogéneos que apreciado previamente. Estas culturas habitualmente contienen moDC derivados de monocitos y macrófagos (moMac) e incluso algunas menos desarrolladas células tales como monocitos. El objetivo de este protocolo es proporcionar un método coherente para la identificación y separación de los diversos tipos de células presentes en estas culturas que se desarrollan, por lo que sus funciones específicas pueden ser investigada más a fondo. La estrategia de clasificación presentada aquí separa las células primero en cuatro poblaciones basadas en expresión de Ly6C y CD115, los cuales se expresan transitoriamente por las células que se desarrollan en la cultura impulsada por el GM-CSF. Estas cuatro poblaciones incluyen comunes progenitores mieloides o CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulocitos/macrófagos o GMP (Ly6C +, CD115), monocitos (Ly6C +, CD115 +) y macrófagos derivados de monocitos o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c se agrega también a la estrategia de clasificación para distinguir dos poblaciones dentro del Ly6C, CD115-población: CMP (CD11c-) y moDC (CD11c +). Finalmente, dos poblaciones pueden ser distinguidas más lejos dentro del Ly6C, CD115 + población basado en el nivel de expresión II de la clase de MHC. MoMacs expresan bajos niveles de MHC de clase II, mientras que un precursor DC derivados de monocitos (moDP) expresa mayor MHC de clase II. Este método permite el aislamiento fiable de varias poblaciones con distinta en números suficiente para una variedad de análisis funcionales y de desarrollo. Destacamos una tal lectura funcional, la respuesta diferencial de estos tipos celulares a la estimulación con patrones moleculares Pathogen-Associated (PAMPs).
Introduction
Cultivo de células de médula ósea murina con la citoquina Factor de estimulante de Colonia del Granulocyte-macrófago (GM-CSF) es ampliamente utilizado como un método para generar células dendríticas derivadas de monocitos (moDC; también conocido como DC inflamatoria) en gran número 1, 2,3,4,5. Estas células han sido extremadamente útiles en una variedad de estudios de la función de células dendríticas (DC) 6,7,8. Normalmente, estas células de médula ósea murina se cultivan para 6-8 días y luego se utilizan para el estudio de las células dendríticas función 5. Estas culturas habían sido considerado como sobre todo homogéneas, compuesto por una mayoría de moDC diferenciado. Más recientemente, ha quedado claro que al final de este período de cultivo de 6 a 8 días, hay de hecho muchos moDC, así como un subconjunto grande de macrófagos derivados de monocitos diferenciado (moMacs) 9,10,11. Nuestros propios estudios han ampliado estos resultados demostrando que otros subconjuntos de menos células desarrolladas, como precursores de moDC (moDP) y monocitos, siendo en las culturas a baja frecuencia incluso después de 7 días 10. Así, los estudios de la función de células dendríticas (DC) con células generadas por este sistema podrían reflejar las respuestas de una cohorte más amplia de tipos de células que previamente apreciado.
Hemos aprendido mucho del estudio de moDC de GM-CSF-generan relacionadas con la función de estas células en la fase final de diferenciación 12,13,14. Sin embargo, entendemos que significativamente menos por la vía del desarrollo de estas células 2,15,16 y de cómo y cuándo exhibir específicas funciones tales como: capacidad de respuesta a patógenos asociados moleculares Patrones (PAMPs), fagocitosis, procesamiento y presentación de antígeno 13y actividad antibacteriana. Un protocolo para el aislamiento de un gran número de progenitores basada en Flt3L DC convencionales y precursores ha sido reportado 17. Aislamiento de estas poblaciones distintas se logró utilizando carboxyfluorescein succinimidyl éster (CFSE)-tinción de las células de la médula ósea (para seguimiento de células divisorias) y la cultura en Flt3L por 3 días. Las células fueron agotadas de las células positivas de linaje y clasificó en poblaciones progenitoras y precursoras en la expresión de CD11c 17. Otro enfoque por grupo de Leenen identificar progenitores tempranos de DC en la cultura impulsada por el GM-CSF fue ordenar las células partiendo de CD31 y Ly6C 18. El objetivo inicial era crear un método similar para la obtención de progenitores y precursores de moDC de GM-CSF-conducido. Debido a los tipos de células específicos generados por GM-CSF, adaptamos el enfoque y estrategia basada en la expresión de las moléculas que se expresan en etapas tempranas y posteriores de desarrollo de la clasificación. Finalmente determinamos que Ly6C, CD115 (receptor CSF-1), y CD11c fueron los mejores marcadores para distinguir estas células tipos de 10.
Aquí, presentamos un método para el aislamiento de las células en varias etapas distintas de desarrollo a lo largo de la vía de diferenciación impulsada por GM-CSF: monocito Progenitor mieloide común (CMP), Progenitor del Granulocyte-macrófago (GMP), macrófagos derivados de monocitos (MoMac) y DC (MoDC) derivados de monocitos. La población de moMac puede más separada en base a nivel de expresión II, clase de MHC revelando un moDC precursor población (moDP) 10. Utilizamos un celular activado por fluorescencia alta velocidad clasificación estrategia (FACS) para aislar a estas 5 poblaciones basadas en expresión de CD11c, Ly6C y CD115. Entonces demostramos el examen de estas células en ensayos funcionales revelando sus respuestas a la estimulación de PAMP.
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Protocol
Todo trabajo animal fue aprobado por la Auburn University institucional Animal Care y uso según las recomendaciones indicadas en la guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio de los institutos nacionales de salud.
1. preparación para la recolección de médula ósea
- Preparar medios completo 250 mL mediante la adición de una solución de medio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con suero de ternera fetal 10%, glutamina 2 mM y 50 μm 2-Mercaptoetanol en la parte superior de una unidad de matraz 0.22 μm filtro de vacío y aplicar vacío.
Nota: Medio completo puede conservarse a 4 ° C hasta 2 meses. - Mezclar 350 mL de etanol al 100% con 150 mL estéril H2O en un matraz de 500 mL para preparar solución de etanol 70%.
- Set centrifugar a 4 ° C.
- Esterilización fórceps, bisturí y tijeras en etanol al 70%.
- Con una pipeta serológica, añadir 5 mL de medio completo a tres platos de Petri de 60 mm.
- Con una pipeta serológica, Añadir 30 mL de medio completo a un tubo cónico de 50 mL.
2. colección de células de médula ósea murina
- Eutanasia a un ratón C57BL/6 por CO2 narcosis con arreglo a las reglas establecidas por las directrices de la Asociación Médica Veterinaria americana (AVMA) de 2013 sobre la eutanasia.
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Retire y tira de las patas traseras.
- Saturar las patas traseras y el torso con etanol al 75% y realizar cortes superficiales a través de la piel alrededor de la articulación de la cadera con tijeras curvas del tejido. Con unas pinzas, tire firmemente la piel de la cadera hacia abajo hacia el tobillo, revelando el músculo. Use tijeras para quitar la aleta de la piel.
- Retirar la pierna entera cortando a través del hueso justo por encima de la articulación del fémur, cadera.
Nota: Además de la zona de esterilización, el etanol ayuda proporciona cortes limpios y evitar que el pelo contamine las muestras. - Si las piernas se trasladará a una nueva ubicación para la recolección de médula ósea, sumergir las piernas en los medios de comunicación completa.
- Trabajar en un gabinete de bioseguridad estéril, transferir las piernas a uno de los platos de Petri previamente preparado.
- Utilice tijeras para cortar el justo debajo de los tobillos y con cuidado quitar tanto de los tejidos muscular y elástica posible. Transferir el hueso limpio para el segundo plato de Petri preparado.
Nota: Aunque no es necesario quitar todo el músculo, demasiado tejido restante puede hacerlo difícil eliminar la médula ósea. -
Separar el fémur, la rodilla y la tibia.
- Con unas pinzas, sujetar la pierna en la rodilla y localizar la médula.
Nota: la médula ósea debe verse como una tenue línea roja dentro de la cavidad ósea en la parte superior del fémur y hacia el final de la tibia.- Con unas tijeras, hacer tres cortes como sigue.
- Cortar la tibia justo por encima de donde aparece la médula para terminar.
- Corte justo por debajo de la articulación de la rodilla.
- Corte justo por encima de la articulación de la rodilla.
- Si la articulación de la cadera todavía está conectada con el fémur, cortar justo por debajo de la articulación de la cadera.
- Retomar los tres fragmentos de la placa de Petri y repita este proceso en la otra pierna.
- Con unas tijeras, hacer tres cortes como sigue.
- Con unas pinzas, sujetar la pierna en la rodilla y localizar la médula.
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Al ras de la médula del fémur y la tibia.
- Llene una jeringa de 10 mL con medios completo del tubo cónico de 50 mL y tapa con aguja de 23 G.
- Sujeta el hueso con el fórceps sobre el tercer plato de Petri preparado, inserte la aguja en el canal óseo y empuje de los medios de comunicación a través de lavado las células (que pueden surgir como un "enchufe" intacto o varios clusters). Repita hasta que no más color se puede ver a través del hueso. Vuelva a llenar la jeringa con los medios de comunicación según sea necesario.
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Aplastar las epífisis.
- Mientras que en la segunda placa de Petri, sujete firmemente el casquillo de la rodilla con unas pinzas y puré las rodillas con la punta de la jeringa. Continúe hasta que las epífisis no son rojas.
- Usando la jeringa, transferir las células de la segunda y tercera caja Petri para el tubo de 50 mL. Desintegración grumos transfiriendo suavemente hacia arriba y hacia abajo. Trate de no generar burbujas. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
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Lyse células de sangre rojas
- Retirar el sobrenadante con pipeta serológica desalojar pellets por chasquear y lyse las células de sangre rojas por incubación en 1 mL de tampón de lisis ACK (amonio cloruro de potasio) durante 1 min a temperatura ambiente.
- Con una pipeta serológica, añadir 40 mL de tampón HBSS (Hanks equilibrada solución de sal).
- Utilizando una pipeta serológica, filtrar las células aunque un colador de célula 70 μm en un tubo cónico de 50 mL nuevo. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- Con una pipeta serológica, eliminar las células sobrenadante y lavar con 40 mL de medio completo. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
Nota: En esta fase, los linfocitos positivos linaje pueden eliminarse por FACS o purificación magnética de la columna. Sin embargo, los linfocitos no se mantienen a largo plazo en la cultura. Aunque un gran número de células positivas de linaje está presente en la población Ly6C-CD115 en la médula ósea ex vivo, casi todos están ausentes por día 5 (figura 2). - Con una pipeta serológica, quite el sobrenadante y las células de médula ósea en medios completo con 10 ng/mL de GM-CSF recombinante del ratón a una densidad de 1 x 106 células/mL de la cultura.
Nota: Por lo general, 4 x 107 células totales se pueden cosechar después de lisis de glóbulos rojos. Sin embargo, esperar tan poco como 2 x 107 para principiantes y hasta 5 x 107 células para cosechadoras experimentados. - Con una pipeta serológica, transferir las células a las placas de cultivo de tejidos e incubar a 37 ° C en 5% CO2. Si usando una placa de 24 pocillos, semilla cada uno con 2 mL de la suspensión celular.
- Cada 48 h, utilice una pipeta serológica para quitar la mitad de los medios de comunicación y sustituir por medio completo fresco y GM-CSF.
Nota: Las culturas pueden ser guardadas durante 9 días. Sin embargo, la composición cambia con el tiempo. Para más información vea la sección 3.
3. elegir día de clase
- Como composiciones de población celular cambian con el tiempo, seleccione un día que produce el mayor número de células deseadas.
- Ver tabla 1 para la clase de post producción celular prevista para cada una de las poblaciones después de 3, 5 y 7 días de la cultura en GM-CSF por 1 x 107 células.
4. estrategia de tinción
- Utilizar pequeñas alícuotas de células para preparar muestras de control. Incluir un control sin manchas, muestras de control de compensación teñidas con anticuerpos fluorescentes solamente una cada uno, y fluorescencia-menos-uno controla en que los anticuerpos se añaden excepto uno, al control de fluorescencia no específica en ese canal. Si uso etiquetado indirecta, incluye primaria secundaria solo, solo y tanto primaria como secundaria.
Nota: Ficoeritrina (PE) y allophycocyanin (APC) con la etiqueta anticuerpos proporcionan distinta separación con sangrado mínimo sobre cuando se utilizan juntos. Sin embargo, si el fluorocromo opciones son limitadas, CD115 se expresa en un nivel relativamente bajo, mientras que Ly6C se expresa en niveles muy altos. Por lo tanto, más brillantes fluorocromos son deseables para anti-CD115 y anti-Ly6C fluorocromos son elegidos para evitar sangrado. - Preparar 100 mL de tampón de lavado FACS (FWB) mediante la mezcla de 97 mL de solución salina de refrigerada Dulbecco tampón fosfato (DPBS) con 3 mL de suero de ternera fetal en un tubo cónico de 50 mL y colocar en un baño de hielo.
- Utilice una pipeta para suavemente pero a fondo, pipetear las células arriba y abajo para desplazar las células ligeramente adherentes.
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Mediante una pipeta serológica, transferir las células a un tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- Si volumen celular superior a 50 mL, transferir las células al número necesario de tubos y combinan en el paso de la tinción.
- Suavemente retirar el sobrenadante y lavar las células pildoradas añadiendo 30 mL de FWB con una pipeta serológica. Centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos y repetir el lavado.
Nota: Si se espera que la muerte celular alta, las células se pueden lavar con FWB con tan bajo como 0.5% de suero de ternero fetal (FCS). Esto evitará aglutinación celular. -
Suspender y mancha las células por anticuerpos fabricante.
- Suspender 5 x 107 células en 1 mL de FWB y añadir 2 μg de anti Ly6C y anti-CD115 con fluoróforos (de elección del investigador). Para distinguir más lejos CMP de moDC (ambos son Ly6C - y CD115-), agregar 2 μg de anticuerpos anti-CD11c (CMP son CD11c–; moDC son CD11c+). Incubar durante 30 min en hielo.
Nota: Figura 3 se generó utilizando Ly6C-PE y CD115-APC.
- Suspender 5 x 107 células en 1 mL de FWB y añadir 2 μg de anti Ly6C y anti-CD115 con fluoróforos (de elección del investigador). Para distinguir más lejos CMP de moDC (ambos son Ly6C - y CD115-), agregar 2 μg de anticuerpos anti-CD11c (CMP son CD11c–; moDC son CD11c+). Incubar durante 30 min en hielo.
- Con una pipeta serológica, añadir 10 mL de FWB y centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- Suavemente retirar el sobrenadante y lavar las células pildoradas añadiendo 30 mL de FWB con una pipeta serológica. Centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos y repetir el lavado.
- Antes de suspender las células, la película tubo a fin de desalojar la pelotilla. Utilice una pipeta serológica para suspender las células 1 x 107 células/ml de FWB y filtrar con filtro de 35 μm de la célula. Utilice una pipeta serológica para transferir células filtradas en tubo de polipropileno y coloque en hielo hasta que esté listo para ordenar.
Nota: Si el polipropileno está disponible, pueden utilizarse tubos de poliestireno recubierto de proteína (leche descremada en polvo o FCS) para reducir el atascamiento.
5. sistema basado en muestras de Control de puertas
Nota: Para evitar la interrupción de la célula debido a la presión de la corriente de flujo de alta velocidad, utilice una boquilla de 100 – 130 μm para la clasificación de la célula.
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Ejecutar el control sin mancha (ver paso 4.1) a través del clasificador de la célula y una puerta para excluir los desechos pequeños (baja dispersión hacia adelante; FSC) y altamente granulares (dispersión de alta presión; Partículas SSC).
- Para analizar sólo los estadios (monocitos, moMac/MoDP y MoDC), aplicar control para incluir sólo las celdas más grandes (alto FSC).
- Si se utilizan las manchas de la viabilidad, utilizarlos para excluir acontecimientos manchados, no viables (un ejemplo se ilustra en la figura 1).
- Ejecutar los ejemplos de control fluorescente único a través del clasificador de la célula y ajustar la compensación según sea necesario.
- Correr una muestra de la muestra multi-labeled. Observar cuatro poblaciones distintas: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monocitos), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) y Ly6C-CD115 - (CMP/moDCs). Aplicar una puerta para aislar cada una de las cuatro poblaciones principales.
Nota: CMPs y moDC comparten el fenotipo de CD115 Ly6C. Sin embargo, pueden diferenciarse en base a la expresión de CD11c: CMP carecen de CD11c, mientras que MoDCs expresa CD11c.
6. colección de poblaciones aisladas
- Preparar tubos agregando suficiente FCS para alcanzar al menos el 20% concentración final cuando esté lleno. Por ejemplo, si utiliza tubos de 5 mL, añadir 1 mL de FCS antes de la clasificación y retire el tubo cuando se alcanza el volumen total de 5 mL.
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Para evitar absorción de facturación y el anticuerpo de membrana, mantener todas las muestras (mezclado y ordenadas) a 4 ° C a lo largo de la clase.
- Si esto no es posible, mantenga el tubo que contiene las células para ordenarse en el hielo tanto como sea posible y transferir alícuotas al clasificador según sea necesario.
- Además, transferir muestras ordenadas para cada 20-30 min de hielo.
- Después de que el número de células se han recogido, utilice una pipeta serológica para transferir las células a un tubo cónico nuevo. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos.
- Confirmar la pureza con el análisis de la especie en pequeñas alícuotas de cada población recogido.
- Eliminar el sobrenadante, suspensión en 10 mL de FWB y centrifugue a 250 x g a 4 ° C durante 10 minutos Repita para un total de dos lavados.
Nota: Puede ser difícil quitar el sobrenadante sin el desalojamiento de la pelotilla. Colocar una punta de pipeta a una línea de vacío puede ayudar con la eliminación. Si esto no está disponible, se recomienda recoger el sobrenadante en un tubo fresco en caso de disociación de la pelotilla. - Quite el sobrenadante después del segundo lavado.
- Si el diseño experimental del usuario dicta las células volver a cultivarse, siga los pasos 2.12-2.14. De lo contrario, si las células se utilizará para el análisis inmediato, preparar células según protocolo deseado.
Nota: Un ejemplo de análisis funcional típico se incluye en la figura 4.
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Representative Results
En un esfuerzo por mantener tantos canales disponibles para el análisis como posibles, viables las células habitualmente fueron seleccionados basados en la dispersión hacia delante y lateral, excluyendo eventos muy pequeños y muy granulares (una puerta típica se aplica a todos lo punto parcelas en figura 1A). Para determinar si esta estrategia bloquea excluye confiablemente las células muertas, manchó con 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (figura 1B). 7AAD manchas de ADN en las células muertas y moribundas debido a la permeabilidad de la membrana y es excluido por células viables. Viabilidad de GM-CSF de las células cultivadas de la médula fue analizada inmediatamente inmediatamente analiza después de la cosecha (PH) y celda de pH 1, 3 y 5 PH tenía aproximadamente 10% de células positivas 7-AAD cuando una puerta típica de FSC/SSC fue aplicada a las células recién aisladas del hueso médula ósea (figura 1, después de la cosecha). Una proporción similar de las células muertas también estuvo presente en el día 1 (~ 12%) y 3 (~ 11%) de la cultura (figura 1, día 1 PH y PH de 3 días). Día 5, el número de células muertas en la puerta fue reducido a ~ 5% (figura 1, PH de 5 días). Así, utilizando una puerta de viabilidad es generalmente apropiado para la clasificación el día 5 y después. Por lo tanto, si los usuarios están limitados en sus parámetros disponibles, FSC/SSC gating es generalmente apropiado. Sin embargo, para los ensayos más sensibles (sobre todo si cuentan con un número exacto de células), incorporar una tinción de viabilidad (sugerencia).
Muchos protocolos para la propagación de las células dendríticas recomiendan disminución de las células positivas de linaje, especialmente los linfocitos de la médula ósea antes de cultura 11,17. Este procedimiento está pensado para aumentar la pureza de las células recuperadas sobre diferenciación mediada por el GM-CSF. Normalmente, las células que expresan marcadores de células T (CD3), las células B (CD45R o CD19) y las células NK (NK1.1) pueden ser agotadas por selección positiva mediante bolas magnéticas o célula clasificación 11,17,18. Sin embargo, basado en el sistema de cultivo, linfocitos fueron raramente recuperados o detectados en estos ensayos. Así, se intentó evaluar la longevidad de los linfocitos en la población Ly6C-CD115 entre las células de GM-CSF-conducido (figura 2A). GM-CSF cultivadas de la médula las células (que no habían sido agotado de linaje) fueron teñidas con anticuerpos frente a CD3, CD45R y NK1.1 (en el mismo fluoróforo) y medido diariamente por citometría de flujo (figura 2B). Dentro de la población Ly6C-CD115, las células positivas CD3/CD45R persistieron fuertemente a través de días 0-3 (figura 2B). En el día 4, seguía siendo sólo unos CD3/CD45R las células positivas y al día 5 y 6, no había CD3/CD45R expresando células presentes. Así, dentro de 4 días de la cultura en GM-CSF, las células positivas de linaje eran esencialmente ausentes y no fueron detectadas en los días 5 y 6 de la cultura.
La composición de la cultura de GM-CSF-conducido de la célula cambia a diario en este sistema como las células desarrolla y diferencia (tabla 1; Figura 3). En primeros puntos del tiempo, las células más abundantes son progenitores y precursores y en más adelante épocas la mayoría de las células son más diferenciados 10. Para determinar cómo clasificar en días diferentes de la cultura podría afectar la trayectoria del desarrollo posterior o cinética, las clases se realizan 3, 5 y 7 días PH (Figura 3A). El desarrollo de la población de MoMac (Ly6C-CD115 +) se realiza un seguimiento durante 2-3 días más en la cultura (figura 3B-3D).
Se ordenan 3 días PH, sólo el 40% de Ly6C-CD115 + células habían disminuido CD115 expresión dentro 24 horas después (PS) (figura 3B). 48 h PS, la fracción que había regula CD115 fue 66% y 72 h, 70% de las células tenía este fenotipo. Esta composición fenotípica se mantuvo (~ 70-72% Ly6C - CD115-) incluso después de más días de cultivo (datos no mostrados). Se ordenan 5 días PH, ~ 75% de las células fueron Ly6C - CD115-, tener CD115 rápidamente regula dentro de 24 h PS y el ~ 80% fueron CD115 - después de sólo 48 h. Esta distribución se mantuvo después de 72 h (figura 3). Finalmente, se ordenan 7 días PH, regulación de CD115 también fue bastante rápido. Dentro de las 24 h PS, ~ 75% de las células tenían expresión CD115 regula, y esta tendencia se mantuvo después de 48 h (figura 3D). Curiosamente, se ordenan en el día 7, el nivel global de expresión CD115 fue menor en las células dentro de la población CD115 +.
Por lo tanto, estos resultados indican que la cinética de desarrollo algo más lento al ordenar en un día temprano, como el día de 3 clasificar las células en comparación con el más rápido desarrollo y la diferenciación observada después de clasificar el día 5 o 7. Basado en estos resultados, debería probablemente un usuario que busca un mayor número de moDC clase día 5 ó 7.
La respuesta de la maduración de la C.C. está bien establecida 6,7,12,14. Cuando son tratados con una variedad de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), DC inmadura hasta-regulan la expresión de MHC, las moléculas coestimuladoras y citoquinas pro inflamatorias, mejorando su capacidad de activación de la célula de T de la 6. Sin embargo, es menos claro cuando las células en desarrollo obtener la capacidad para responder a la estimulación de PAMP y que característica de maduración DC pudieron exhibir. Para determinar cuál de las poblaciones ordenadas respondería a estímulos de maduración, cada población fue tratado poco después de su clasificación con un cóctel de PAMPs incluyendo poli I: C, lipopolisacáridos (LPS) y el ADN CpG para activar el receptor de tipo toll (TLR) 3 (TLR3), TLR4 y TLR9, respectivamente. Las células fueron tratadas (o sin tratar) durante 24 h y expresión de CD86 y MHCII fue medida por citometría de flujo (Figura 4A-4B). Además, producción de IL-12p 40/70 y IL-6 se midió en los sobrenadantes por arsenal de citoquinas ELISA (figura 4-4D).
CMP y GMPs expresadas muy bajos niveles de MHC de clase II y CD86 en un estado sin estimular y estas expresión patrones no cambió significativamente a la exposición el cóctel de PAMPs (Figura 4A y 4B). Asimismo, la expresión de MHC de clase II por los monocitos también era baja y poco cambió con la exposición PAMP (Figura 4A). Sin embargo, la expresión de CD86 fue moderada en los monocitos 24 h después de su clasificación, y aumentó aún más después de 24 h estimulación. Expresión basal mayor de MHC clase II y CD86 en la MoMacs y MoDCs fue observada, y ambas poblaciones exhiben una fuerte inducción de estas moléculas sobre el estímulo de PAMP. En cuanto a la expresión de MHC clase II después del estímulo, no hubo ninguna diferencia estadística entre el CMPs, GMPs y monocitos, mientras que el MoMacs y MoDCs formaron un grupo distinto. Sin embargo, en cuanto a la expresión de CD86, las células del CMPs y correctas eran estadísticamente diferentes de MoMacs y MoDCs. Sin embargo, los monocitos no fueron diferentes que MoMacs o MoDCs.
A continuación hemos querido evaluar la capacidad relativa de cada una de las cinco poblaciones para producir citoquinas en respuesta a la estimulación de TLR. Así, realizamos un análisis del cytokine en las poblaciones ordenadas después de cultura en la presencia o ausencia de agonista TLR cóctel utilizado anteriormente. Las células fueron cultivadas con los estímulos para 24 h, luego sobrenadantes se colectaron. Se observó muy poco IL - 12 p 40/70 o la producción de IL-6 por CMP sobre el estímulo de TLR (figura 4-4D). La segunda población, GMPs, era incapaces de producir IL-12p 40/70 (figura 4), pero estas células producen una baja cantidad de IL-6 sobre el estímulo por PAMPs (figura 4). Se observaron los mayores niveles de producción de citoquinas en las tres últimas poblaciones. Monocitos y MoMacs tuvieron magnitudes de producción de citoquinas y patrones muy similares. Ambos aumentaron grandemente IL - 12 p 40/70 y modesto aumentaron de la producción de IL-6 por estimulación (figura 4-4D). Curiosamente, en presencia de PAMPs MoDCs no aumentaron la secreción de IL-12 p 40/70; sin embargo, esta población había aumentado considerablemente la producción de IL-6 (figura 4-4D). Estos resultados indican que las poblaciones ordenadas mantienen sus funciones inmunológicas después de aislamiento.
Figura 1: células viables dentro de avance versus dispersión lateral puerta. Médula ósea de ratón fue cultivada en GM-CSF, y viabilidad se midió usando 7-AAD (7-amino-actinomicina D) tinción después de la cosecha (PH) y 1, 3 y 5 días después de la cosecha. (A) células viables fueron seleccionadas mediante la aplicación de una puerta (Viable) que omite eventos pequeños y altamente granulares FSC y SSC. (B) histogramas de 7-AAD manchas generan por eventos en puerta Viable (FSC/SSC). Eventos positivos para 7-AAD indican las células que experimentan apoptosis. Las flechas indican células viables que bloquean. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: linfocitos dentro de la población-CD115 Ly6C. Médula ósea de ratón fue cultivada en GM-CSF y marcadores de linfocitos (CD3, CD145R y NK1.1) se analizaron diariamente por citometría de flujo. (A) células se tiñeron con PE Ly6C y CD115 APC para identificar células de CD115 Ly6C. Puerta del cuadrante se aplicó en base a controles del solo-color. Parcela de pseudocolor punto generado desde el día 0 (B) CD3, CD45R y NK1.1 expresión de células de CD115 Ly6C se analizó en el día de la cosecha (día 0) hasta el día 6. Recuento se normalizaron al modo utilizando un software de análisis de citometría de flujo. La flecha indica Ly6C-CD115 - gating. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: cinética de desarrollo de Ly6C-CD115 + células después de clasificar en días diferentes. Ratón (A) médula ósea fue cosechada y cultivada en GM-CSF. Alícuotas de 1 x 107 células fueron cosechadas (B) (C) 5, 3, o (D) 7 días posteriores a la cosecha (PH). En los indicados días PH, Ly6C-CD115 + células fueron ordenadas de cultivo mixto (la especie) y analizadas inmediatamente después tipo (PS). Ordenada de las células fueron nuevamente cultivadas en GM-CSF, y cambios en la expresión Ly6C/CD115 se analizaron diariamente por citometría de flujo. Caja y flecha indican la puerta de clasificación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: expresión de la maduración y del cytokine después del estímulo TLR. Las células se clasifican en 5 poblaciones el día 3 de cultivo de GM-CSF. Entonces fueron tratados con un cóctel de PAMPs (LPS, poli I: C y el ADN CpG) 24 h. supone la intensidad fluorescente (MFI) de clase II de MHC (A) y (B) CD86 fue analizada inmediatamente posterior tipo (PS) y 24 h con y sin pmap por citometría de flujo. Barras de error representan la desviación estándar de experimentos repetidos 3-5. (C) IL - 12 p 40/70 y (D) IL-6 en sobrenadantes de muestras agrupadas 3 fueron medidos por mancha blanca /negra del cytokine matriz dot ELISA después de 24 h con y sin pmap. RLU; Unidades relativas de luz; -/ + indica la presencia del marcador de superficie celular para la población señalada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Día 3 | Día 5 | Día 7 | |||||
| Fenotipo | Tipo de la célula | Min | Max | Min | Max | Min | Max |
| Ly6C-CD115-CD11c - | CMP | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 | N / a | N / a |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | N / a | N / a |
| Ly6C + CD115 + | Mono | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | MoDC | N / a | N / a | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
Tabla 1: Espera número mínimo y máximo de las células recuperadas post tipo por 1 x 107 células. CMP (progenitor mieloide común); GMP (progenitor de colonias de granulocitos/macrófagos) Mono (monocitos); MoMac (macrófagos derivados de monocitos); MoDC (células dendríticas derivadas de monocitos); N/a (no disponible); Min (rendimiento de la célula mínima de 1 x 107 células); Máximo (rendimiento máximo de la célula de 1 x 107 células).
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Discussion
Este protocolo facilita el aislamiento de GM-CSF-conducido progenitoras y precursoras tipos celulares en una cantidad suficiente para varios tipos de análisis incluyendo ensayos bioquímicos, análisis de la función celular in vitro, o la instilación in vivo. Este método representa un avance significativo en el campo del desarrollo de células dendríticas derivadas de monocitos, lo que permite el aislamiento fiable e identificación de células en esta vía de desarrollo, así como los tipos de células diferenciadas más comúnmente aislados en estudios previos.
Anteriores protocolos para el aislamiento de progenitores y precursores generados a partir de médula ósea en vitro han confiado en la CFSE-coloración identificar de las células progenitoras proliferativa 17 o en la coloración con CD31 y Ly6C como marcadores de células mieloides 18 . La CFSE descrita por Naik protocolo de tinción fue diseñado para su uso en generación de progenitores y precursores de DC basada en Flt3L 17. Cuando trató de este enfoque en el sistema de cultivo de GM-CSF, nos encontramos con dos problemas principales. La CFSE fue algo citotóxica a las células en desarrollo y tan brillante (incluso en las células divididas) que hizo difícil compensación. Este enfoque demostró para ser inadecuado para nuestros objetivos de aislar los tipos de células tempranas (progenitores), así como las células de todo el espectro del desarrollo, desde altamente proliferativas (CMP/BPF) a altamente desarrollado (MoDC/MoMac). También tratamos la estrategia de clasificación de células impulsado por el GM-CSF, según grupo de Leenen basado en CD31 y Ly6C 18. Sin embargo, encontramos que el CD31 era problemática. Se expresó en niveles muy bajos (lo que hace difícil resolver las poblaciones para clasificar limpia) por un vanishingly pequeño subconjunto de células y sólo muy temprano durante el período de la cultura. De hecho, expresión de CD31 no era perceptible más allá de la jornada 2 de la cultura en el GM-CSF 10.
Ly6C, sin embargo, era una molécula muy útil para separar las células en diferentes etapas de desarrollo debido a su patrón transitorio de expresión 10. La adición de CD115 nos permitió discernir más de cerca las células intermedias y posteriores etapas del desarrollo que no era posible con CD31. También examinamos otros marcadores de progenitores CD34 y CD117 con la esperanza de aislar gran cantidad de estas células tempranos 10. Sin embargo, a diferencia de que en el sistema de Flt3L, encontramos que CD34 y CD117 también se expresaron en un subconjunto muy pequeño de las células y eran prácticamente ausentes durante el día 3 de cultura 17. Estos marcadores de células madre pueden ser útiles en futuros estudios, sin embargo, distinguir subconjuntos dentro de las poblaciones de CMP o GMP.
Hay varias posibles modificaciones al protocolo que pueda afectar la producción de poblaciones celulares deseados. En primer lugar, el usuario puede elegir aplicar una tinción de viabilidad para excluir cualquier células muertas. Basado en las observaciones, la tasa de células muertas dentro de un típico delantero y puerta de dispersión lateral son relativamente baja en general y plantean problemas solamente durante los primeros días de la cultura, coincidente con la disminución en los linfocitos positivos de linaje. Sin embargo, para aplicaciones en que celda números deben ser precisos, una mancha de viabilidad asegurará de exclusión de células muertas.
Una segunda modificación potencial es agotamiento de linfocitos de estirpe-positivos antes de la cultura. Hemos probado este enfoque para hacer frente a la pequeña población de células positivas de linaje que fueron observados regularmente dentro de la población Ly6C-CD115-célula. El rendimiento celular global fue ligeramente inferior a los días 5 y 6, y la pureza no era significativamente mayores (datos no mostrados). Así, la pureza no justificaba el rendimiento reducido. Asimismo, si el usuario pretende ordenar el día 5 o después, la frecuencia de linfocitos dentro de la cultura está muy por debajo de 1% y no debe presentar un problema.
Finalmente, porque esta estrategia está diseñada para aislar las células a través de un amplio espectro del desarrollo, el usuario deben adaptar el tiempo de su clase para recoger como muchas de las poblaciones deseadas posible. Esta estrategia de clasificación fielmente rendimientos indicados sin importar el día de la cultura en la que las células se clasifican los tipos de células. Por ejemplo, las células con el fenotipo Ly6C + CD115-CD11c-son fieles al fenotipo de la GMP y la función del mismo modo si son ordenados y aislados en día 3 o 5 de la cultura. Sin embargo, la frecuencia de estas células es mucho mayor el día 3 de 5, por lo que si el objetivo es el aislamiento de este tipo celular, clasificación el día 3 se recomienda. También es notable que las células se ordenan en progreso día 3 a través de las etapas posteriores del desarrollo con cinética más lenta que si se ordenan en día 5 ó 7 (figura 3).
Mientras que este método permite la clara delimitación y aislamiento de poblaciones distintas de 5 – 6 a lo largo del espectro del desarrollo, probablemente hay muchas más poblaciones o etapas transitorias a lo largo de esta vía. Dentro de cada una de las cinco poblaciones descritas pueden ser varias subpoblaciones en incrementos ligeramente diferentes del desarrollo. Por ejemplo, hemos observado "" poblaciones distintas con niveles intermedios de CD115 y de Ly6C que experimentan ligeramente diferentes patrones de desarrollo, en términos de cuántos moMac y moDC son generan (datos no mostrados). También es probable que las poblaciones observaron previamente en vivo están presentes en la cultura y el sistema de clasificación, pero estos han sido difíciles de identificar debido a su muy baja frecuencia. Poblaciones como cMOP 19, MDP 20o 21 de CDP están probablemente presentes, pero pueden quedar oculto dentro de las poblaciones más grandes. Se necesitarán estudios futuros para aclarar más las numerosas etapas de desarrollo que pueden ser aisladas dentro de este marco de clasificación con la adición de marcadores específicos de la diferenciación. El valor de esta estrategia de clasificación es que permite aislamiento constante de un gran número de etapas de desarrollo distintas durante la ontogenia de la DC.
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Disclosures
Los autores no tienen de revelar los conflictos.
Acknowledgments
Estamos muy agradecidos por la asistencia técnica de Alison iglesia Bird en el Auburn Universidad de medicina veterinaria de flujo citometría de planteles escolares, para la financiación de los NIH para EHS R15 R15 AI107773 y al programa de Biología Molecular en la Universidad de Auburn y celular para la financiación de investigación de verano para PBR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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