Summary
Burada biz belirlenmesi ve GM-CSF myeloid hücrelerin hücre yüksek hızlı sıralama kullanarak tahrik çok sayıda ayırma için bir yöntem sağlar. Beş ayrı nüfus (ortak miyeloid ataları, granülosit/makrofaj ataları, monosit, monosit kaynaklı makrofajlar ve monosit kaynaklı DCs) Ly6C ve CD115 ifade üzerinde göre tespit edilebilir.
Abstract
Fare kemik iliği granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) kullanılarak üretilen monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC) kültürleri son zamanlarda daha önceden takdir daha heterojen olduğu kabul. Bu kültürler rutin de monosit türetilmiş moDC makrofaj (moMac) ve monosit gibi hatta bazı az gelişmiş hücreler içerir. Bu iletişim kuralı gibi onlar geliştirmek, böylece özel işlevleriyle daha fazla soruşturma tutarlı bir yöntem kimlik ve birçok hücre tipleri bu kültürlerde mevcut ayrılması için sağlamak için hedeftir. Burada sunulan sıralama strateji hücreleri ilk dört nüfus Ly6C ve CD115, ifadeye dayalı GM-CSF-driven kültür geliştirdikçe ikisi de geçici hücreleri tarafından ifade edilir içine ayırır. Bu dört nüfus ortak miyeloid ataları veya Cumhuriyetçi millet Partisi (Ly6C-, CD115-), granülosit/makrofaj ataları veya GMP (Ly6C +, CD115-), monosit (Ly6C +, CD115 +) ve monosit kaynaklı makrofajlar veya moMac (Ly6C-, CD115 +) içerir. CD11c da içinde Ly6C-, CD115-nüfus iki popülasyonun ayırt etmek için sıralama strateji ekledi: CMP (CD11c-) ve moDC (CD11c +). Son olarak, iki örneğin alınma olasılığını daha da içinde Ly6C-, MHC sınıf II ifade düzeyine göre CD115 + nüfus ayırt. Monosit kaynaklı bir DC habercisi (moDP) daha yüksek MHC sınıf II ifade ederken MoMacs alt düzeyleri MHC sınıf II, hızlı. Bu yöntemi birkaç gelişimsel olarak ayrı nüfus sayıları güvenilir yalıtım fonksiyonel ve gelişimsel analizleri çeşitli için yeterli olanak sağlar. Biz bir tür işlevsel okuma, stimülasyon Pathogen-Associated moleküler desenleri (PAMPs) ile fark yanıtlarını bu hücre tiplerinin vurgulayın.
Introduction
Sitokin ile fare kemik iliği hücre kültürü çalışmalarının granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) yaygın bir yöntem olarak monosit kaynaklı dendritik hücreler (moDC; da inflamatuar DC) çok sayıda 1'oluşturmak için kullanılır, 2,3,4,5. Bu hücreler içinde a değişiklik-in dendritik hücre (DC) işlevi 6,7,8çalışmaların son derece yararlı olmuştur. Genellikle, bu fare kemik iliği hücreleri 6-8 gün boyunca kültürlü ve daha sonra dendritik hücre işlevi 5çalışma için kullanılır. Bu kültürler uzun çoğunlukla farklılaşmış moDC çoğunluğu oluşan homojen olarak kabul edilmiştir. Son zamanlarda, bu 6-8 gün kültür dönemin sonunda, orada gerçekten çok moDC, hem de büyük bir alt kümesini farklılaştırılmış monosit kaynaklı makrofajlar (moMacs) 9,10,11açık hale gelmiştir. Kendi çalışmaları diğer alt kümeleri moDC öncüleri (moDP) ve monosit, gibi daha az gelişmiş hücre kültürlerinde düşük frekansta sonra bile 107 gün kalmasını gösteren bu bulgular daha da genişletmiştir. Böylece, çalışmalar bu sistem tarafından oluşturulan hücreler kullanarak dendritik hücreler (DC) işlevinin yanıt-e doğru daha geniş bir kohort hücre tiplerinin daha önceden takdir yansıtmak.
GM-CSF-oluşturulan moDC farklılaşma 12,13,14son aşamasında bu hücreler işleve ilişkin çalışma çok şey öğrendik. Bununla birlikte, önemli ölçüde bu gelişimsel yolu hakkında daha az 2,15,16 hücreleri ve nasıl ve ne zaman onlar özel sergi gibi işlevleri anlamak: patojen ilişkili moleküler yanıt Desenler (PAMPs), fagositoz, antijen işleme ve sunum 13ve anti-bakteriyel etkinlik. Yalıtım geleneksel Flt3L tahrik DC ataları ve hareketlenme öncesi ilk belirtiler çok sayıda için bir protokol bildirilen 17oldu. Yalıtım bu farklı nüfus elde kullanarak carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-(sayesinde bunun bölünen hücreler izlemek için) kemik iliği hücreleri lekeli ve Flt3L kültür 3 gündür. Hücreleri sonra hiza pozitif hücrelerinin tükenmiş ve içine yaratıcı ve öncü nüfus CD11c ifade 17tarihinde göre sıralanır. CD31 ve Ly6C 18tarihinde dayalı hücreleri sıralamak için DC erken ataları GM-CSF-driven kültür tanımlamak için Leenen'ın Grup tarafından başka bir yaklaşımı oldu. Ataları ve GM-CSF-driven moDC nın elde etmek için benzer bir yöntem oluşturmak için ilk hedefi oldu. GM-CSF tarafından oluşturulan belirli hücre tipleri nedeniyle, yaklaşım ve strateji geliştirme erken ve daha sonraki aşamalarında ifade edildi molekülleri ifade dayalı sıralama uyarlanmış. Biz sonuçta belirlenen Ly6C, CD115 (CSF-1 reseptör), ve CD11c bu hücre ayırt 10türleri için en iyi işaretler vardı.
Burada, birkaç farklı gelişimin yolu boyunca GM-CSF tarafından tahrik farklılaşma, hücre izolasyon için bir yöntem mevcut: ortak Myeloid dede (CMP), granülosit-makrofaj dede (GMP), monosit, monosit kaynaklı makrofaj (MoMac) ve monosit kaynaklı DC (MoDC). MoMac nüfus daha fazla dayalı MHC sınıf II ifade, düzeyde moDC habercisi nüfus (moDP) 10açığa ayrılmış olabilir. Biz Ly6C, CD115 ve CD11c ifade üzerinde göre bu 5 nüfus yalıtmak için (FACS) strateji sıralama yüksek hızlı bir floresan aktif hücre kullanmaktadır. O zaman bu hücrelerin fonksiyonel deneyleri PAMP stimülasyon yanıtlarını ifşa olarak muayene göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan iş bakım ve kullanım Laboratuvar hayvanları Ulusal Sağlık Enstitüleri için Kılavuzu'nda açıklanan önerileri doğrultusunda Auburn Üniversitesi Kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi tarafından kabul edildi.
1. kemik iliği toplama için hazırlık
- Bir çözüm Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) 1640 orta % 10 fetal buzağı serum, 2 mM glutamin ve 0,22 µm vakum filtre kabı birim üst 50 µM 2-mercaptoethanol ile takıma ekleyerek 250 mL tam ortam hazırlamak ve vakum uygulanır.
Not: Tam orta 4 ° C'de 2 aya kadar saklanır. - % 70 etanol çözüm % 100 etanol 350 mL 150 mL steril H2O'bir 500 mL şişe ile karıştırarak hazırlayın.
- Set santrifüj ile 4 ° c
- Forseps, neşter ve makas % 70 etanol içinde sterilize.
- Serolojik pipet kullanarak, komple bir medya 5 mL üç 60 mm Petri yemekler için ekleyin.
- Serolojik pipet kullanarak, komple bir medya 30 mL 50 mL konik tüp ekleyin.
2. fare kemik iliği hücre koleksiyonu
- C57BL/6 fare tarafından CO2 narkoz ötenazi 2013 Amerikalı hayvan hastalıklarıyla ilgili tıbbi Derneği (travma) yönergeler tarafından kurulan kurallarına göre ötenazi.
-
Kaldırmak ve arka ayakları şerit.
- Arka ayakları ve gövde % 75 etanol ile emdirmek ve kıvrımlı doku makasla kalça eklemi çevresindeki deri yoluyla sığ kesim yapmak. Forseps kullanarak, sıkıca kalça derisinden kas açığa ayak bileği doğru aşağı çekin. Makas Cilt kapağı kaldırmak için kullanın.
- Bütün arka bacak kemik hemen üstünde uyluk kemiği/kalça eklemi içinden çıkarın.
Not: bölgeyi sterilize yanı sıra, etanol temiz kesim sağlanmasında yardım edecek ve saç örnekleri kirletici önlemek. - Eğer bacaklar kemik iliği hasat için yeni bir konuma aktarılır, komple bir medya bacaklarda daldırın.
- Steril Biyogüvenlik kabini çalışma, bacaklar önceden hazırlanmış Petri yemekler birine aktarın.
- Sadece kesmek için makas kullanın aşağıda ayak bileği ve dikkatli bir şekilde mümkün olduğunca kas ve elastik bağ dokusu daha fazla kaldırmak. Temizlenmiş kemik için ikinci hazırlanmış Petri kabına aktarın.
Not: tüm kas kaldırmak için gerekli olmasa da, çok fazla kalan doku kemik iliğini temizlemek zorlaştırabilir. -
Uyluk, diz ve tibia ayırın.
- Forseps kullanarak, bacak diz tutun ve kemik iliği bulun.
Not: kemik iliği üst femur ve tibia sonuna doğru kemik boşluğu içinde hafif bir kırmızı çizgi olarak görünür olmalıdır.- Makas kullanarak, aşağıdaki gibi üç kesim yapmak.
- Hemen ilik sona erdirmek için görüntülendiği üzerinde tibia kesmek.
- Sadece diz eklemi kesti.
- Sadece diz eklemi kesmek.
- Kalça eklemi hala femur bağlı ise, sadece kalça eklemi kesti.
- Üç parçaları Petri kabına dönmek ve diğer bacak bu işlemi yineleyin.
- Makas kullanarak, aşağıdaki gibi üç kesim yapmak.
- Forseps kullanarak, bacak diz tutun ve kemik iliği bulun.
-
Femur ve tibia floş kemik iliği.
- Bir 10 mL şırınga ile 50 mL konik tüp ve kap tam medyadan 23 G iğne ile doldurun.
- Üçüncü hazırlanmış Petri kabına yukarıda forseps ile kemik tutan, iğne kemik kanalı içine yerleştirin ve medya aracılığıyla, (ki sağlam bir "tak" veya çeşitli kümeleri olarak ortaya çıkabilir) hücreleri dışarı fışkırma itin. Daha fazla renk-ebilmek var olmak seen kemiğe kadar yineleyin. Şırınga ile kitle iletişim araçları gerektiği gibi doldurun.
-
Epifizleri ezmek.
- Hala ikinci Petri dish iken, diz kapağı sıkıca forseps ile tutun ve diz şırınga ucu ile püre. Epifizleri artık kırmızı kadar devam edin.
- Şırınga kullanarak, hücreleri 50 mL tüp ikinci ve üçüncü Petri kabına aktarın. Ayrılık kümeleri tarafından hafifçe yukarı ve aşağı pipetting kadar. Kabarcıklar oluşturmamanız çalışın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
-
Kırmızı kan hücreleri parçalayıcı
- Serolojik pipet ile süpernatant kaldırmak, Pelet flicking tarafından çıkarmak ve ACK (amonyum klorür potasyum) lizis arabellek için oda sıcaklığında 1 dk 1 ml kuluçka tarafından kırmızı kan hücreleri parçalayıcı.
- Serolojik pipet kullanarak HBSS (Hanks dengeli tuz solüsyonu) arabelleği 40 mL ekleyin.
- Serolojik pipet kullanarak, hücreleri bir 70 µm hücre süzgeç rağmen bir yeni 50 mL konik tüp içine filtre. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
- Serolojik pipet kullanarak, tam medya 40 mL süpernatant ve yıkama hücrelerle kaldırın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
Not: Bu aşamada lineage olumlu lenfositler FACS veya manyetik sütun arıtma tarafından kaldırılabilir. Ancak, lenfositler kültür uzun vadede korunmaz. Lineage pozitif hücrelerinin çok sayıda Ly6C-CD115-nüfus kemik iliği ex vivoiçinde mevcut olmakla birlikte, neredeyse tüm eksik gün 5 (Şekil 2). - Serolojik pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve tam medya 10 ng/mL 1 x 106 hücre/mL yoğunluğu, rekombinant fare GM-CSF ile kemik iliği hücrelerinde kültür.
Not: Genellikle, 4 x 107 toplam hücreleri kırmızı kan hücre lizis sonra hasat edilebilir. Ancak, 2 x 107 kadar az yeni başlayanlar için ve ilâ 5 x 107 hücreleri deneyimli biçerdöver için bekler. - Serolojik pipet kullanarak hücreleri doku kültürü tabakaları bana aktarmak ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. 24-şey plaka kullanarak tohum Eğer her hücre süspansiyon 2 mL ile iyi.
- Her 48 h, serolojik pipet medya yarısı kaldırmak ve taze tam medya ve GM-CSF ile değiştirmek için kullanın.
Not: Kültürler için 9 gün tutulabilir. Ancak, kompozisyon zaman içinde değişir. Daha fazla bilgi için bkz: Bölüm 3.
3. gün tür seçimi
- Hücre nüfus besteleri zaman içinde değiştikçe, istenen hücre en yüksek sayısını verir bir günü seçin.
- Tablo 1 GM-CSF kültürü 1 x 107 hücre başına 3, 5 ve 7 gün sonra beklenen hücre verim post sıralama beher-in belgili tanımlık nüfus için bkz:.
4. strateji boyama
- Küçük aliquots hücre kontrol örnekleri hazırlamak için kullanın. Bir günahı denetimi, yalnızca bir floresan antikor ile her, lekeli tazminat kontrol örnekleri içerir ve floresan eksi bir bir, non-spesifik floresans o kanal için denetime dışında tüm hangi antikor eklenir kontrol eder. Yalnız, ikincil yalnız, birincil dolaylı etiketleme, kullanarak eklerseniz ve hem birincil ve ikincil.
Not: Phycoerythrin (PE) ve allophycocyanin (APC) öğesini antikorlar en az kanama ile ayrı ayrımı üzerinden birlikte kullanıldığında sağlamak. Ancak, fluorochrome seçenekleri sınırlı değilse, Ly6C çok yüksek düzeylerde ifade edilir iken CD115 nispeten düşük bir seviyede gösterilir. Bu nedenle, daha parlak fluorochromes anti-CD115 için arzu edilir ve anti-Ly6C fluorochromes üzerinde kanama önlemek için seçilir. - 100 mL FACS yıkama arabellek (FWB) ile fetal buzağı serum 50 mL konik tüp içinde 3 mL 97 mL soğuk Dulbecco'nın fosfat tamponlu tuz (DPBS) karıştırılarak hazırlamak ve bir buz banyosu yerleştirin.
- Yumuşak, ama iyice, yukarı ve aşağı herhangi bir gevşek yapışık hücreleri çıkarmak için hücreleri pipet için bir pipet kullanın.
-
Serolojik pipet kullanarak, hücreleri 50 mL konik tüp aktarın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
- Hücre hacmi 50 mL aşarsa, tüpler gereken sayıda hücre aktarmak ve boyama adımda birleştirmek.
- Yavaşça süpernatant dökün ve FWB 30 mL serolojik pipet ile ekleyerek pelleted hücreleri yıkayın. 250 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve yıkama tekrarlayın.
Not: Eğer yüksek hücre ölümü beklenen, hücreleri ile FWB ile yıkanabilir % 0.5 fetal buzağı serum (FCS) gibi düşük. Bu topaklanma Hücre engeller. -
Askıya alma ve antikor üretici yönergelerine başına hücre leke.
- 5 x 107 hücreleri FWB 1 ml askıya alma ve anti-Ly6C ve anti-CD115 (araştırmacı seçtikleri) fluorophores ile etiketli her 2 µg ekleyin. Cumhuriyetçi millet Partisi (her ikisi de Ly6C - ve CD115 - vardır) moDC daha fazla ayırt etmek için anti-CD11c antikorların 2 µg ekleyin (CMP CD11c olan-; moDC vardır CD11c+). Buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
Not: Şekil 3 Ly6C-PE ve CD115-APC kullanarak oluşturulmuştur.
- 5 x 107 hücreleri FWB 1 ml askıya alma ve anti-Ly6C ve anti-CD115 (araştırmacı seçtikleri) fluorophores ile etiketli her 2 µg ekleyin. Cumhuriyetçi millet Partisi (her ikisi de Ly6C - ve CD115 - vardır) moDC daha fazla ayırt etmek için anti-CD11c antikorların 2 µg ekleyin (CMP CD11c olan-; moDC vardır CD11c+). Buz üzerinde 30 dk için kuluçkaya.
- Serolojik pipet kullanarak, FWB ve santrifüj 10 mL 250 x g 4 ° C'de 10 dakika için ekleyin.
- Yavaşça süpernatant dökün ve FWB 30 mL serolojik pipet ile ekleyerek pelleted hücreleri yıkayın. 250 x g 10 dk 4 ° C'de, santrifüj kapasitesi ve yıkama tekrarlayın.
- Hücreleri askıya almadan önce iyice Pelet çıkarmak için tüp hafifçe vur. 1 x 107 hücre/mL FWB hücreleri askıya alma ve 35-µm hücre filtreden filtrelemek için serolojik pipet kullanın. Filtre uygulanmış hücreler Polipropilen tüp içine aktarıp sıralamak için hazır kadar buza koyun serolojik pipet kullanın.
Not: Polipropilen kullanılamıyorsa, kaplı protein (yağsız Kuru süt veya FCS) polistren tüpleri bağlama azaltmak için kullanılabilir.
5. kontrol örneklere dayalı Gates ayarla
Not: yüksek hızlı akım akışı baskısı nedeniyle hücre kesintileri önlemek için hücre sıralamak için 100-130 µm meme kullanın.
-
Günahı denetimi çalıştırmasına (bkz. Adım 4.1) hücre sıralayıcısı aracılığıyla ve küçük enkaz (düşük ileri dağılım; dışlamak için bir kapı uygulamak FSC) ve son derece taneli (yüksek dağılım; SSC) parçacıklar.
- Yalnızca sonraki aşamalar (monosit, moMac/MoDP ve MoDC) çözümlemek için yalnızca daha büyük hücreleri (yüksek FSC) içerecek şekilde geçişi uygulayın.
- Canlılığı lekeleri kullanılıyorsa, bunlar lekeli, uygun olmayan olaylar ( Şekil 1' de bir örnek gösterilmiştir) dışarıda bırakmak için kullanın.
- Tek floresan kontrol örnekleri hücre sıralayıcısı çalıştırın ve değerini gerektiği gibi ayarlayın.
- Çok etiketli örnek örneği çalıştırın. Dört ayrı nüfus gözlemlemek: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monosit), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) ve Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Her dört büyük nüfusun yalıtmak için bir kapı uygulanır.
Not: Ly6C-CD115-fenotip CMPs ve moDC paylaşın. Ancak, CD11c ifade dayalı farklılaşmış: CMP eksikliği CD11c, MoDCs CD11c hızlı ise.
6. izole nüfus topluluğu
- En az %20 ulaşmak için yeterli FCS ekleyerek koleksiyonu tüpleri hazırlayın final toplama ne zaman tam. Örneğin, 5 mL tüpler kullanıyorsanız, sıralamadan önce FCS 1 mL ekleyin ve 5 mL toplam hacim ulaştığında tüpü çıkarması.
-
Membran ciro ve antikor alımını önlemek için sıralama boyunca 4 ° C'de (karışık ve sıralanmış) tüm örneklerini tutun.
- Bu mümkün değilse, mümkün olduğu kadar buz üstünde sıralanması ve aliquots sıralayıcısı için gerektiği gibi aktarmak için hücreleri içeren tüp tutun.
- Ayrıca, her 20-30 dk buz için sıralanmış örnekleri aktarın.
- Hücreler için istediğiniz sayıyı topladıktan sonra serolojik pipet hücreleri için yeni bir konik tüp aktarmak için kullanın. Santrifüj 250 x g 4 ° c de 10 dakika.
- Saflık sonrası sıralama analizi üzerinde toplanan her nüfusunun küçük aliquots ile onaylayın.
- Süpernatant kaldırmak için FWB ve santrifüj 250 x g 4 ° c de iki yıkar, toplam 10 dk. tekrar 10 ml askıya alma.
Not: Tüm süpernatant Pelet kekii olmadan kaldırmak zor olabilir. Pipet Ucu bir vakum hattına ekleme kaldırma ile yardımcı olabilir. Bu yoksa, bu süpernatant Pelet ayrılma durumunda taze bir tüp toplanan önerilmektedir. - Süpernatant sonra ikinci yıkama kaldırın.
- Hücreleri yeniden kültürlü kullanıcının deneysel tasarım belirler, 2.12-2,14 adımları. Hücreleri hemen analiz için kullanılacaksa, aksi takdirde, hücre istenen protokol göre hazırlayın.
Not: Tipik fonksiyonel analiz örneği Şekil 4' e eklenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bir çaba olarak birçok kanal analiz için kullanılabilir olası, canlı hücreler olarak tutmak için düzenli olarak ön ve yan dağılım, çok küçük ve çok parçalı Etkinlikleri (tipik bir kapı tüm 1A rakamnokta çizer uygulanır) hariç göre seçildi. Bu perdeleme strateji güvenilir bir şekilde ölü hücreleri hariç olup olmadığını belirlemek için 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (Şekil 1B) ile lekeli. 7AAD membran geçirgenliği nedeniyle ölü ve ölmek üzere olan hücrelerdeki DNA lekeleri ve hücrelerin tarafından söz konusu değildir. Tipik bir FSC/SSC kapı kemiğinden taze izole hücrelere uygulandığında GM-CSF kültürlü kemik iliği hücreleri analiz hemen hemen analiz PH hasat sonrası (PH) ve 1, 3 ve 5 PH. hücre canlılığı 7-AAD pozitif hücrelerinin yaklaşık yüzde 10'u vardı kemik iliği (1 rakam, hasat sonrası). Ölü hücreleri benzer bir oran da gün 1 (~ %12) ve gün 3 (~ %11) kültür (Şekil 1, 1 gün PH ve 3 gün PH) mevcuttu. Gün 5, kapı içinde ölü hücreleri ~ %5 için (Şekil 1, 5 gün PH) düşürüldü. Bu nedenle, böyle bir canlılık kapı kullanarak 5 gün ve sonra sıralama için genellikle uygundur. Kullanıcılar kendi parametrelerin sınırlıdır, bu nedenle, FSC/SSC geçişi genellikle uygun ise. (Özellikle onlar hassas cep numaraları güveniyorsanız) ancak, daha duyarlı deneyleri için bir canlılık leke (öneri) dahil.
Birçok iletişim kuralları dendritik hücreler yayılması için lineage pozitif hücrelerinin, özellikle lenfositler, kemik iliği kültür 11,17önce gelen tükenmesi öneririz. Bu yordamı, GM-CSF-aracılı farklılaşma kurtarılan hücreleri saflığı artırmak için düşünülmektedir. Tipik olarak, ifade etme belirteçleri T hücreleri (CD3) hücreleri, B hücreleri (CD45R veya CD19) ve NK hücreleri (NK1.1) manyetik boncuklar veya hücre 11,17,18sıralama kullanarak pozitif seçerek tükenmiş. Ancak, kodlamayla sistemini temel alarak, lenfositler nadiren kurtarılan veya bu deneyleri algılandı. Böylece, uzun ömürlü Ly6C-CD115-nüfus GM-CSF-driven hücreleri (Şekil 2A) arasında tutulan lenfositlerin değerlendirmek istedi. GM-CSF kemik iliği (Bu tükenmiş lineage olmasaydı) hücrelerin CD3, CD45R ve NK1.1 antikor (içinde aynı fluorophore) ile lekeli kültürlü ve günlük akış sitometresi tarafından (2B rakam) ölçülür. Ly6C-CD115-nüfus içinde CD3/CD45R pozitif hücrelerinin şiddetle 0 – 3 (Şekil 2B) gün boyunca devam etti. Gün 4, sadece birkaç CD3/CD45R pozitif hücrelerinin kaldı ve gün 5 ve 6, hiçbir CD3/CD45R hücreleri mevcut ifade vardı. Böylece, 4 gün GM-CSF kültür içinde lineage pozitif hücrelerinin aslında yoktun ve her gün 5 ve 6 kültür algılanmadı.
Günlük değişiklikleri bu sistemde hücreler olarak geliştirmek ve (Tablo 1; ayırt GM-CSF-driven hücre kültürü bileşimi Şekil 3). Erken zaman noktalarda en bol hücreler ataları ve öncüleri ve sonra hücreleri çoğu daha farklılaştırılmış 10altındadır. Kültür farklı günlerde sıralama sonraki gelişimsel yolu veya kinetik nasıl etkileyeceğini belirlemek için şu sıralar 3, 5 ve 7 gün PH (Şekil 3A) gerçekleştirilmiştir. MoMac nüfus gelişimi (Ly6C-CD115 +) sonra üzerinden takip edildi 2-3 daha fazla gün içinde Kültür (Şekil 3B-3D).
3 gün PH, Ly6C sadece % 40'ını sıralandığında-CD115 + hücre CD115 ifade içinde 24 saat sonrası sıralama (PS) (Şekil 3B) azalma. 48 h PS, CD115 aşağı düzenlenmiş olan fraksiyonu % 66, ve 72 h tarafından hücreleri % 70'i bu fenotip vardı. Bu fenotipik kompozisyon devam edildi (~ 70-%72 Ly6C - CD115-) kültür (veri gösterilmez) daha fazla gün sonra bile. 5 gün PH sıralandığında, hücrelerin % ~ 75 Ly6C olduğunu - CD115-, 24 h PS ve ~ %80 içinde hızla aşağı düzenlenir CD115 sahip olduğunu CD115 - sadece 48 saat sonra. Bu dağıtım 72 h (Şekil 3 c) sonra devam edildi. Son olarak, 7 gün PH sıralandığında, aşağı-CD115 düzenlenmesi de oldukça hızlı. 24 h PS içinde ~ %75 hücre aşağı düzenlenir CD115 ifade vardı ve bu eğilim 48 h (şekil 3D) sonra devam edildi. İlginçtir, gün 7 sıralandığında, CD115 ifade genel düzeyini CD115 + nüfus içindeki hücreleri üzerinde düşük oldu.
Böylece, bu bulgular erken bir gün sıralarken geliştirme kinetik biraz daha yavaş, daha hızlı gelişmesine göre hücreleri ve günde 5 ya da 7 sıraladıktan sonra gözlenen farklılaşma 3 gün gibi sıralanmış gösterir. Bu sonuçlara göre moDC daha büyük sayıda arayan bir kullanıcı büyük olasılıkla gerekir sıralama günde 5 ya da 7.
İyi kurulmuş 6,7,12,14DC olgunlaşma yanıttır. Moleküler desenleri (PAMPs) patojen ilişkili çeşitli ile tedavi ederken, olgunlaşmamış DC yukarı-düzenleyen MHC, costimulatory molekülleri ve pro-inflamatuar sitokinlerin ifade onların T hücre aktive kapasitesi 6artırılması. Net kazanç gelişmekte olan hücreleri PAMP stimülasyon ve hangi özellikle DC olgunlaşma onlar sergilemek cevap için kapasite ancak, daha az olmasıdır. Hangi sıralanmış nüfusun olgunlaşma uyaranlara yanıt vereceğini belirlemek için her nüfus kısa bir süre sonra sıralama PAMPs Poly dahil olmak üzere bir kokteyl ile ben tedavi edildi: C, lipopolisakkaritler (LPS) ve CpG toll benzeri reseptör (TLR) 3 (TLR3), tetiklemek için DNA TLR4 ve TLR9, anılan sıraya göre. Hücreleri tedavi (tedavi edilmediği için 24 saat ya da) ve CD86 ve MHCII ifadesi akış sitometresi (Şekil 4A-4B) tarafından ölçüldü. Ayrıca, IL-12p 40/70 ve Il-6 üretim sitokin dizi ELISA (Şekil 4 c-4D) tarafından supernatants ölçülmüştür.
CMPs ve ifade GMPs çok az düzeyde MHC sınıf II ve CD86 unstimulated bir devlet ve bu ifade desenleri maruz PAMPs (Şekil 4A ve 4B) kokteyl için üzerine önemli ölçüde değişmedi. Aynı şekilde, MHC sınıf II monosit tarafından ifade de düşük ve PAMP maruz (Şekil 4A) üzerine biraz değiştirilmiş. Ancak, CD86 ifade sonra sıralama monosit 24 h ılımlı ve daha fazla 24 s stimülasyon takip arttı. Daha yüksek bazal ifade MHC sınıf II ve CD86 MoMacs ve MoDCs gözlenen ve her iki nüfus PAMP stimülasyon üzerine moleküllerin güçlü bir indüksiyon sergilenmektedir. Stimülasyon takip MHC sınıf II ifade açısından CMPs, GMPs ve monosit, arasında istatistiksel fark ise ayrı bir grup kurdu ve MoMacs ve MoDCs vardı. Ancak, CD86 ifade açısından CMPs ve GMPs hücreleri MoMacs ve MoDCs daha istatistiksel olarak farklı idi. Ancak, monosit MoMacs veya MoDCs farklı değildi.
Sonra sitokinler TLR stimülasyon yanıt üretmek için göreli yetenek her beş örneğin alınma olasılığını değerlendirmek istedim. Böylece, biz yukarıda kültür varlığı veya yokluğu TLR agonist kokteyl kullanılan sonra üzerinde sıralanmış nüfus bir sitokin tahlil gerçekleştirilen. Hücreleri 24 h için çekim gücü ile kültürlü, o zaman supernatants toplanmıştır. Biz çok az IL - 12 p 40/70 veya CMPs tarafından IL-6 üretim TLR stimülasyon (Şekil 4 c-4D) üzerine gözlenen. İkinci nüfus, GMPs, IL-12 p 40/70 (Şekil 4 c) üretmek mümkün idi, ancak bu hücreleri Il-6 düşük miktarda üzerine stimülasyon PAMPs (Şekil 4 d) tarafından üretilen. Sitokin üretiminin en üst düzey ikinci üç nüfus tespit edildi. Monosit ve MoMacs çok benzer desenler ve büyüklükleri sitokin üretiminin vardı. Her ikisi de büyük ölçüde IL - 12 p 40/70 arttı ve mütevazi stimülasyon (Şekil 4 c-4D) Il-6 üretimi arttı. İlginçtir, PAMPs MoDCs huzurunda IL-12 p 40/70 salgılanmasını artırmak değil; Ancak, bu nüfus Il-6 üretimi (Şekil 4 c-4D) büyük ölçüde arttı. Bu bulgular sıralanmış nüfus yalıtım sonra bağışıklık işlevlerini muhafaza göstermektedir.
Şekil 1: ileri içinde hücrelerin kapısı yan dağılım karşı. Fare kemik iliği GM-CSF kültürlü ve canlılığı 7-AAD hasat sonrası (PH) ve 1, 3 ve 5 gün hasat sonrası boyama (7-amino-actinomycin D) kullanılarak ölçüldü. (A)hücrelerin FSC ve SSC dayalı küçük ve çok parçalı olaylar ihmal bir kapı (Viable) uygulayarak seçildi. 7-AAD boyama (B) histogramlar olaylar Viable (FSC/SSC) kapı içinde oluşturulan. 7-AAD için olumlu olaylar apoptosis geçiren hücreleri gösterir. Oklar uygun hücre geçişi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: Ly6C-CD115-nüfus içinde lenfositler. Fare kemik iliği GM-CSF kültürlü ve lenfosit işaretleri (CD3, CD145R ve NK1.1) günlük akış sitometresi tarafından analiz edildi. (A)hücre lekeli Ly6C-PE ve CD115-APC ile Ly6C-CD115-hücreleri tanımlamak için. Dörtgen Bölümlü kapısı bağlı tek renkli denetimleri olarak uygulandı. Yalancı nokta Arsa 0 (B) CD3, CD45R ve NK1.1 ifade Ly6C-CD115-hücre hasat (0 gün) günde 6 gün kadar analiz edildi günden itibaren oluşturulan. Hücre sayısı bir Akış Sitometresi Analizi yazılım kullanarak moduna normalleştirilmiş. Ok gösterir Ly6C-CD115 - geçişi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: kinetik Ly6C gelişimi-farklı günlerde sıralama sonra CD115 + hücre. Kemik iliği hasat ve GM-CSF içinde kültürlü(a)fare. Aliquots 1 x 107 hücre hasat (B) 3, (C) 5 veya (D) 7 gün hasat sonrası (PH) idi. Belirtilen günlerde PH, Ly6C-CD115 + hücre karma Kültür (öncesi sıralama) sıralanmış ve hemen analiz sonrası sıralama (PS). Sıralanmış hücreleri yeniden GM-CSF kültürlü ve Ly6C/CD115 ifade değişiklikleri günlük akış sitometresi tarafından analiz edildi. Kutusu ve ok sıralama kapıyı gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: olgunlaşma ve sitokin ifade TLR stimülasyon takip. Hücre 5 nüfus günde 3 GM-CSF kültür sıralanmış. Bunlar daha sonra PAMPs bir kokteyl ile tedavi edildi (LPS, Poly ben: C ve CpG DNA) için 24 h(a)MHC sınıf II floresan yoğunluğu (MFI) demek ve (B) CD86 analiz sonrası sıralama (PS) ve 24 h ve PAMPs tarafından olmayan akış sitometresi hemen. Hata çubukları temsil eden 3-5 Çoğalt deneyler standart sapması. (C) IL - 12 p 40/70 ve (D) Il-6 supernatants 3 havuza alınan örneklerinden sitokin dizi nokta leke ELISA tarafından 24 h ve PAMPs olmadan sonra ölçüldü. RLU; Göreli ışık birimleri; -/ + hücre yüzey işaretçiyi belirlenen nüfus için varlığını gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| 3. gün | Gün 5 | Gün 7 | |||||
| Fenotip | Hücre tipi | Min | Max | Min | Max | Min | Max |
| Ly6C-CD115-CD11c - | CUMHURİYETÇİ MİLLET PARTİSİ | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115 + | Mono | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | MoDC | N/a | N/a | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
Tablo 1: hücre minimum ve maksimum sayısı başına 1 x 107 hücreleri sonrası sıralama kurtarılan bekleniyor. Cumhuriyetçi millet Partisi (ortak miyeloid atası); GMP (granülosit/makrofaj atası) Mono (monosit); MoMac (makrofaj monosit türetilmiş); MoDC (dendritik hücre monosit türetilmiş); N/a (mevcut değil); Min (1 x 107 hücrelere en düşük hücre verim); Max (1 x 107 hücrelere en fazla hücre verim).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı yalıtım GM-CSF-driven yaratıcı ve öncü hücre tiplerinin çeşitli biyokimyasal deneyleri, hücresel işlev içinde vitroveya korumak içinde vivodeneyleri de dahil olmak üzere analizleri için yeterli sayıda kolaylaştırır. Bu yöntem güvenilir izolasyon ve erken geliştirme hem de bu farklı hücre tipleri para nereye hücrelerinin kimlik daha yaygın olarak etkinleştirme monosit kaynaklı dendritik hücre gelişimi alanında önemli bir ilerleme temsil eder. önceki çalışmalarda izole.
Önceki iletişim kuralları için yalıtım ataları ve kemik iliği vitro oluşturulan öncüleri CFSE proliferatif progenitör hücre 17 tanımlamak için boyama ya da CD31 ve Ly6C ile myeloid hücrelerin 18 imleyicileri boyama yararlanmıştır . Naik tarafından açıklanan protokol boyama CFSE Flt3L tahrik DC ataları ve öncüleri 17nesil için tasarlanmıştır. Bu yaklaşım GM-CSF kültür sistemi içinde çalışırken, iki ana konu ile karşılaştı. CFSE biraz gelişmekte olan hücrelere sitotoksik ve (bölünen hücreler bile) çok parlak bu tazminat zorlaştırdı. Bu yaklaşım için erken hücre tipleri (ataları), yanı sıra son derece proliferatif (CMPs/GMPs) Gelişmiş (MoDC/MoMac) için gelen gelişimsel yelpazesinde hücreleri izole hedeflerimize uygun olduğu ortaya çıktı. Ayrıca GM-CSF-driven hücrelerin CD31 ve Ly6C 18tarihinde dayalı Leenen'ın Grup tarafından açıklanan sıralama strateji denedik. Ancak, CD31 sorunlu bulundu. (Temiz sıralamak için nüfusları gidermek zor yapım) çok düşük seviyelerde ifade edildi hücreleri ve sadece çok erken kültür döneminde vanishingly küçük bir alt tarafından. Aslında, CD31 ifade algılanamaz GM-CSF 10kültür 2 gün geçmiş değildi.
Ly6C, ancak, gelişme nedeniyle geçici onun desen ifade 10farklı aşamalarında hücreleri ayırmak için çok yararlı bir molekül oldu. CD115 ilavesi daha yakından CD31 ile mümkün değildi gelişim ara ve sonraki aşamasında hücreleri ayırt etmemizi sağladı. Ayrıca ataları CD34 ve CD117 gibi diğer işaretleri bu erken hücreleri 10çok sayıda yalıtma umuduyla inceledi. Ancak, bu Flt3L sisteminde bildirdi, CD34 ve CD117 da hücrelerin çok küçük bir alt ifade edildi ve neredeyse yoktun bulundu gün 3 Kültür 17tarafından. Ancak, bu kök hücre işaretleri CMP veya GMP nüfus içinde alt kümeleri ayırt etmek için gelecek çalışmalarda yararlı olabilir.
İstenen hücre popülasyonlarının verimini etkileyebilir protokolü için birkaç olası değişiklikler vardır. İlk olarak, kullanıcının herhangi bir ölü hücreleri dışlamak için bir canlılık leke uygulamak seçebilirsiniz. Gözlem dayalı, ölü hücreleri tipik ileri ve yan dağılım kapı içinde oranı genel olarak nispeten düşüktür ve kültür, soy olumlu lenfositler düşüşler ile çakışık ilk birkaç gün boyunca sadece sorun teşkil. Ancak, hangi hücreye bir sayı kesin olmalıdır uygulamalarda, ölü hücreleri dışlanması canlılığı leke sağlayacaktır.
İkinci bir potansiyel değişiklik tükenmesi kültür önce soy-pozitif lenfositlerin olduğunu. Biz-si olmak güvenilir Ly6C-CD115-hücre nüfus içinde düzenli olarak gözlendi lineage pozitif hücrelerinin küçük nüfusu adrese bu yaklaşım. Genel hücre verim 5 ve 6 gün biraz daha düşük ve saflık (anlamlı olarak daha yüksek veri gösterilmez) değildi. Böylece, saflık düşük verim haklı değil. Aynı şekilde, Kullanıcı 5 gün veya daha sonra sıralamak planlıyorsa, kültür içinde lenfositler sıklığını de %1 altında ve bir sorun mevcut değil.
Son olarak, bu strateji yalıtmak için tasarlanmıştır çünkü hücreler arasında büyük bir gelişim spektrum Kullanıcı istenen nüfus mümkün olduğunca çoğunu toplamak için kendi sıralama zamanlaması terzi. Bu sıralama strateji sadakatle hücreleri sıralandığı kültür gün ne olursa olsun belirtilen hücre tipleri verir. Sıralanmış ve günde 3 ya da 5 kültürünün izole olup olmadığını Örneğin, GMP fenotip ve işlev Ly6C + CD115-CD11c-are fenotip ile benzer şekilde hücreleri. Eğer amaç yalıtım bu hücre tip 3 gününde sıralama tavsiye edilir böylece ancak, bu hücreler 5'ten 3 günde çok büyük sıklığıdır. Hücreleri 3. gün ilerleme onlar günde 5 ya da 7 (Şekil 3) sıralanmış daha yavaş kinetik ile sonraki gelişim dönemleri boyunca sıralanmış çekicidir.
Bu yöntem da net ve gelişimsel spektrum boyunca 5-6 farklı nüfusun yalıtım için izin verirken, var büyük olasılıkla çok daha fazla nüfus ya da bu yolu boyunca geçiş aşamaları. Her beş açıklanan nüfus içinde biraz daha farklı artışlarla, birkaç alt nüfus gelişimi olabilir. Örneğin, hangi geliştirme açısından ne kadar moMac ve moDC, biraz daha farklı desenler geçmesi "farklı" nüfus ara düzeyleri ile CD115 ve Ly6C (veri gösterilmez) oluşturulan gözlemledim. Nüfus daha önce vivo içinde kültür ve sıralama sistemi mevcut olmakla birlikte, bunlar onların çok düşük frekanslı nedeniyle belirlemenin zor olmuştur gözlenen olasıdır. Nüfus cMOP 19, MDP 20veya CDP 21 gibi büyük olasılıkla mevcut olmakla birlikte, daha büyük nüfus içinde görünmeyebilir. Gelecekteki çalışmaları belirli işaretleri farklılaşma ilavesi ile sıralama bu çerçevede izole olabilir çeşitli gelişim aşamalarında daha da netleştirmek için gerekli olacaktır. Sıralama bu stratejinin değerini DC ontogeny sırasında gelişimsel olarak farklı aşamalarında çok sayıda tutarlı yalıtımı sağlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa etmek herhangi bir çakışma var.
Acknowledgments
Alison kilise kuş, Auburn Üniversitesi Okul, hayvan hastalıklarıyla ilgili ilaç akış sitometresi NIH cep ve Auburn Üniversitesi Moleküler Biyoloji programı için EHS R15 R15 AI107773 ve fon için tesis, teknik yardım için minnettarız Yaz PBR için araştırma fonu için.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
