Summary
Här tillhandahåller vi en metod för att identifiera och isolera stort antal GM-CSF driven myeloida celler med hög hastighet cell sortering. Fem distinkta populationer (gemensamma myeloida, granulocyt/makrofag stamfäder, monocyter, monocyt-derived makrofager och monocyt-derived DCs) kan identifieras baserat på Ly6C och CD115 uttryck.
Abstract
Kulturer av monocyt-derived dendritiska celler (moDC) genereras från mus benmärg med granulocyt-makrofag koloni stimulerande faktor (GM-CSF) har nyligen erkänts vara mer heterogen än tidigare uppskattat. Dessa kulturer innehåller rutinmässigt moDC samt monocyt-derived makrofager (moMac) och även några mindre utvecklade celler såsom monocyter. Målet med detta protokoll är att tillhandahålla en konsekvent metod för identifiering och separation av de många celltyper som förekommer i dessa kulturer som de framkallar, så att deras specifika funktioner kan undersökas vidare. Sortering strategin presenteras här separerar celler först till fyra populationer baserat på uttryck för Ly6C och CD115, som båda uttrycks normalnivå av celler eftersom de utvecklas i GM-CSF-driven kultur. Dessa fyra populationer inkluderar gemensamma myeloida eller CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyt/makrofag föräldraparets eller GMP (Ly6C +, CD115-), monocyter (Ly6C +, CD115 +), och monocyt-derived makrofager eller moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c läggs också till sortering strategin för att skilja två populationer inom Ly6C-, CD115-befolkning: CMP (CD11c-) och moDC (CD11c +). Slutligen kan två populationer särskiljas ytterligare inom Ly6C-, CD115 + population baserad på jämnt av MHC klass II uttryck. MoMacs express lägre nivåer av MHC klass II, medan en monocyt-derived DC föregångare (moDP) uttrycker högre MHC klass II. Denna metod tillåter för tillförlitlig isolering av flera utvecklingsmässigt distinkta populationer i nummer tillräckligt för en mängd funktionella och utvecklingsmässiga analyser. Vi lyfta fram en sådan funktionell avläsning, differentiell svaren från dessa celltyper att stimulering med Pathogen-Associated molekylära mönster (PAMPs).
Introduction
Odling av murina benmärgsceller med cytokin används granulocyt-makrofag koloni stimulerande faktor (GM-CSF) allmänt som en metod för att generera monocyt-derived dendritiska celler (moDC; även känd som inflammatoriska DC) i stora antal 1, 2,3,4,5. Dessa celler har varit extremt användbar i en mängd studier av dendritiska cellen (DC) funktion 6,7,8. Normalt dessa murina benmärgsceller finns odlade för 6-8 dagar och sedan används för studier av dendritiska cellen funktion 5. Dessa kulturer hade länge ansetts mest homogen, bestående av en majoritet av differentierade moDC. Mer nyligen, har det blivit tydligt att i slutet av denna period med 6 – 8 dagar i kultur, det finns verkligen många moDC, liksom en stor delmängd av differentierade monocyt-derived makrofager (moMacs) 9,10,11. Våra egna studier har ytterligare dessa fynd visar att andra grupper av mindre utvecklade celler, såsom moDC prekursorer (moDP) och monocyter, förbli i kulturer på låg frekvens även efter 7 dagar 10. Studier av dendritiska celler (DC) funktion som använder celler som genereras av detta system kan således spegla svaren från en bredare kohort av celltyper än tidigare uppskattat.
Vi har lärt oss en hel del från studien av GM-CSF-genererade moDC avser funktionen av dessa celler i slutskedet av differentiering 12,13,14. Vi förstår emellertid betydligt mindre om utvecklingstoxicitet vägen av dessa celler 2,15,16 och av hur och när de uppvisar specifika funktioner såsom: lyhördhet för patogener associerade molekylära Mönster (PAMPs), fagocytos, antigen bearbetning och presentation 13och antibakteriell aktivitet. Ett protokoll för isolering av stort antal konventionella Flt3L-driven DC stamfäder och prekursorer har varit rapporterade 17. Isolering av dessa distinkta populationer uppnås med hjälp av carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-målat benmärgsceller (för att spåra delande celler) och kultur i Flt3L i 3 dagar. Cellerna var sedan utarmat radantal positiva celler och sorteras till stamceller och föregångaren populationer utifrån CD11c uttryck 17. En annan metod av Leenens grupp att identifiera tidiga stamfäder för DC i GM-CSF-driven kultur var att sortera celler baserat på CD31 och Ly6C 18. Det ursprungliga målet var att skapa en liknande metod för att erhålla stamfäder och prekursorer av GM-CSF-driven moDC. På grund av de specifika celltyper som genereras av GM-CSF, anpassat vi metoden och sortering strategi baserad på uttryck för molekyler som uttrycktes i början och senare stadier av utveckling. Vi slutligen fastställt att Ly6C, CD115 (CSF-1-receptorn), och CD11c var bästa markörerna för särskilja dessa cell typer 10.
Här presenterar vi en metod för isolering av celler på flera olika faser av utvecklingen längs vägen av differentiering drivs av GM-CSF: gemensamma myeloida stamceller (CMP), granulocyt-makrofag stamceller (GMP), monocyt, monocyt-derived makrofag (MoMac) och monocyt-derived DC (MoDC). MoMac befolkningen kan ytterligare uppdelas baserat på nivå av MHC klass II uttryck, avslöjar en moDC föregångare befolkningen (moDP) 10. Vi använder en höghastighets fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) strategi för att isolera dessa 5 populationer baserat på uttryck för Ly6C, CD115 och CD11c. Vi visar då prövningen av dessa celler i funktionella analyser avslöjar sina svar till PAMP stimulering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djur arbetet godkändes av Auburn University institutionella djur vård och användning kommittén i enlighet med de rekommendationer som beskrivs i handboken för skötsel och användning av laboratoriedjur av National Institutes of Health.
1. beredning för benmärg samling
- Förbered 250 mL komplett genom att lägga till en lösning av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium kompletteras med 10% fetalt kalvserum, 2 mM glutamin och 50 µM 2-merkaptoetanol till toppen av en 0,22 µm vakuum kolv filterenheten och tillämpa vakuum.
Obs: Komplett medium kan lagras vid 4 ° C i upp till 2 månader. - Bered 70% etanol genom att blanda 350 mL 100% etanol med 150 mL steril H2O i en 500 mL mätkolv.
- Ställ in centrifug till 4 ° C.
- Sterilisera pincett, skalpell och sax i 70% etanol.
- Med serologisk pipett, tillsätt 5 mL av komplett media till tre 60 mm petriskålar.
- Med serologisk pipett, tillsätt 30 mL komplett media till en 50 mL konisk tub.
2. insamling av murina benmärgsceller
- Avliva en C57BL/6 mus av CO2 narkos i enlighet med de regler som fastställts av 2013 amerikanska veterinärmedicinska Medical Association (AVMA) riktlinjer för dödshjälp.
-
Ta bort och band bakbenen.
- Mätta på bakbenen och torso med 75% etanol och göra grunda snitt genom huden runt höftleden med böjda vävnad sax. Med pincett, fast dra huden från höften ner mot ankeln, avslöjar muskeln. Använd sax för att ta bort hudfliken.
- Ta bort hela hind benet genom att skära genom benet strax ovanför lårbenet/höftleden.
Obs: Utöver sterilisering området, etanolen kommer stöd i att ge rena nedskärningar och hindrar håret från att förorena proverna. - Om benen kommer att överföras till en ny plats för benmärg skörd, sänk benen i komplett media.
- Arbetar i en steril biosäkerhet skåp, överföra benen till en av de tidigare beredda Petriskålarna.
- Använd sax för att klippa precis nedanför fotleden och noggrant avlägsna så mycket av muskel och elastisk bindväv som möjligt. Överföra rensade benet till den andra beredda petriskål.
Obs: Men det inte är nödvändigt att ta bort alla muskeln, alltför mycket kvarvarande vävnad kan göra det svårt att spola ut benmärgen. -
Avgränsa lårben, knä och skenben.
- Med pincett, håll benet på knä och leta upp märgen.
Obs: benmärg bör vara synlig som en svag röd linje inuti benet hålighet på toppen av lårbenet och mot slutet av skenbenet.- Med sax, kapningar av tre följande.
- Skär skenbenet strax ovanför där märgen visas till slut.
- Klipp strax nedanför knäleden.
- Klipp strax ovanför knäleden.
- Om höftleden är fortfarande ansluten till lårbenet, skär precis nedanför höftleden.
- Tillbaka tre fragmenten till petriskål och upprepa proceduren på andra benet.
- Med sax, kapningar av tre följande.
- Med pincett, håll benet på knä och leta upp märgen.
-
Spola benmärg från lårben och skenben.
- Fyll en 10 mL spruta med komplett media från 50 mL koniska tub och cap med 23 G nål.
- Håller benet med pincett ovanför tredje beredd petriskål, stick in nålen i kanalen ben och tryck media via, spola ut celler (som kan dyka upp som en intakt ”plug” eller flera kluster). Upprepa tills inget mer färg kan ses genom benet. Fyll sprutan med media som behövs.
-
Krossa epifyser.
- Samtidigt i andra petriskål, hålla knäskålen fast med pincett och mosa knäna med spetsen på sprutan. Fortsätt tills epifyser inte längre röda.
- Använda sprutan, överföra cellerna från de andra och tredje petriskål till 50 mL röret. Uppbrottet upp klumpar av pipettering försiktigt upp och ner. Försök inte att generera bubblor. Centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min.
-
Lysera röda blodkroppar
- Ta bort supernatanten med serologiska pipett, rubba pellets genom att snärta och lysera röda blodkroppar genom ruvning i 1 mL lyseringsbuffert ACK (Ammonium-klorid-kalium) för 1 min i rumstemperatur.
- Med serologisk pipett, tillsätt 40 mL HBSS (Hanks balanserad saltlösning) buffert.
- Med serologisk pipett filtrera cellerna men en 70 µm cell SIL till en ny 50 mL koniska tub. Centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min.
- Med serologisk pipett avlägsna supernatanten och tvätta cellerna med 40 mL komplett media. Centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min.
Obs: I detta skede härstamning positiva lymfocyter kan tas bort genom FACS eller magnetiska kolumn rening. Lymfocyter bibehålls dock inte lång sikt i kultur. Även om ett stort antal härstamning positiva celler finns i Ly6C-CD115-befolkningen i den benmärg ex vivo, nästan alla är frånvarande av dag 5 (figur 2). - Med serologisk pipett avlägsna supernatanten och kultur benmärgsceller i komplett media med 10 ng/mL rekombinant mus GM-CSF med en täthet på 1 x 106 celler/mL.
Obs: Vanligtvis 4 x 107 totala celler kan skördas efter röd blod cell lysis. Dock förväntar sig så lite som 2 x 107 för nybörjare och upp till 5 x 107 celler för erfarna skördare. - Med serologisk pipett överföra cellerna till vävnadsodling plattor och inkubera vid 37 ° C i 5% CO2. Om använder en 24-well platta, utsäde varje väl med 2 mL cellsuspension.
- Varje 48 h, använda serologisk pipett för att ta bort hälften av media och ersätta med färsk komplett media och GM-CSF.
Obs: Kulturer kan hållas upp till 9 dagar. Men förändras sammansättning över tid. Se avsnitt 3 för mer information.
3. att välja dag typ
- Som cell befolkningen kompositioner förändras över tid, Välj en dag som ger det högsta antalet önskade celler.
- Se tabell 1 för beräknade cellen avkastning post sorteringen för varje av befolkningsgrupperna efter 3, 5 och 7 dagar av kultur i GM-CSF per 1 x 107 celler.
4. färgning strategi
- Använd små delprover av celler för att förbereda kontrollprover. Inkluderar en ofärgade kontroll, ersättning kontrollprover färgas med endast en fluorescerande antikropp varje, och fluorescens-minus-one styr i vilken alla antikroppar läggs utom en, till kontrollen för icke-specifik fluorescens i kanalen. Om använda indirekt märkning, inkluderar primära ensam, sekundär ensam, och både primär och sekundär.
Obs: Fykoerytrin (PE) och allophycocyanin (APC) taggade antikroppar ger distinkt avskiljande med minimal utfall över när de används tillsammans. Dock om fluorokrom alternativ är begränsade, uttrycks CD115 på en relativt låg nivå, medan Ly6C uttrycks på mycket höga nivåer. Därför ljusare fluorokromer är önskvärda för anti-CD115 och anti-Ly6C fluorokromer väljs att förhindra utfall över. - Bereda 100 mL av FACS Wash Buffer (FWB) genom att blanda 97 mL kylt Dulbeccos fosfatbuffrad koksaltlösning (DPBS) med 3 mL av fetalt kalvserum i en 50 mL konisk tub och placera i ett isbad.
- Använd en pipett för att försiktigt men grundligt, Pipettera celler upp och ner för att få bort löst vidhäftande celler.
-
Med serologisk pipett överföra celler till en 50 mL konisk tub. Centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min.
- Om cellvolym överstiger 50 mL, överföra celler till det nödvändiga antalet rör och kombinera vid färgning steg.
- Försiktigt Häll av supernatanten och tvätta pelleterat cellerna genom att lägga till 30 mL FWB med serologiska pipett. Centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 minuter och upprepa tvätten.
Obs: Om hög celldöd förväntas, celler kan tvättas med FWB med så låg som 0,5% fetalt kalvserum (FCS). Detta förhindrar cell klumpar. -
Avbryta och fläckar celler per antikropp tillverkarens anvisningar.
- Avbryta 5 x 107 celler i 1 mL FWB och lägga till 2 µg varje av anti-Ly6C och anti-CD115 märkt med fluorophores (av forskarens val). För att ytterligare skilja CMP från moDC (båda är Ly6C- och CD115-), lägga till 2 µg av anti-CD11c antikroppar (CMP är CD11c-, moDC är CD11c+). Inkubera i 30 min på is.
Obs: Figur 3 genererades med hjälp av Ly6C-PE och CD115-APC.
- Avbryta 5 x 107 celler i 1 mL FWB och lägga till 2 µg varje av anti-Ly6C och anti-CD115 märkt med fluorophores (av forskarens val). För att ytterligare skilja CMP från moDC (båda är Ly6C- och CD115-), lägga till 2 µg av anti-CD11c antikroppar (CMP är CD11c-, moDC är CD11c+). Inkubera i 30 min på is.
- Med serologisk pipett, tillsätt 10 mL av FWB och centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min.
- Försiktigt Häll av supernatanten och tvätta pelleterat cellerna genom att lägga till 30 mL FWB med serologiska pipett. Centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 minuter och upprepa tvätten.
- Innan vi avbryter celler, svep tube noggrant för att rubba pelleten. Använda en serologisk pipett för att upphäva celler på 1 x 107 cell/mL FWB och filtrera genom 35 µm cell filter. Använd en serologisk pipett och flytta filtrerad celler i polypropylen rör och placera på is tills redo att sortera.
Obs: Om polypropylen är tillgänglig, kan protein belagd (nonfat torr mjölk eller FCS) polystyren rör användas för att minska bindande.
5. Ställ in Gates baserat på kontrollprover
Obs: För att förhindra cell störningar på grund av trycket av höghastighets-flöde ström, använda ett 100 – 130 µm munstycke för cell sortering.
-
Köra ofärgade kontrollen (se steg 4.1) genom cell Sorteraren, och tillämpa en grind för att utesluta små skräp (låg framåt scatter; FSC) och extremt detaljerade (hög side scatter; SSC) partiklar.
- För att analysera gäller endast de senare stadierna (monocyter, moMac/MoDP och MoDC), gating för att endast inkludera större celler (hög FSC).
- Om livskraft fläckar som används, Använd dessa för att utesluta betsad, icke-viabla händelser (ett exempel illustreras i figur 1).
- Kör de enda fluorescerande kontrollproverna genom cell Sorteraren och justera efter behov.
- Kör ett prov av multi-märkt provet. Följa fyra distinkta populationer: Ly6C + CD115-(god tillverkningssed), Ly6C + CD115 + (monocyter), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), och Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Applicera en grind för att isolera varje av de fyra stora populationerna.
Obs: CMPs och moDC delar Ly6C-CD115-fenotypen. Men de kan differentieras baserat på CD11c uttryck: CMP saknar CD11c, medan MoDCs express CD11c.
6. insamling av isolerade populationer
- Förbereda samling rören genom att lägga till tillräckligt FCS för att uppnå minst 20% slutlig koncentration när den är full. Till exempel använder 5 mL-rör, tillsätt 1 mL av FCS före sortering och ta bort röret när det når 5 mL totalvolym.
-
För att förhindra membran omsättning och antikropp upptag, hålla alla prover (blandade och sorterade) vid 4 ° C under Sortera.
- Om detta inte är möjligt, hålla röret som innehåller celler för att sorteras på is så mycket som möjligt och överför alikvoter till Sorteraren som behövs.
- Dessutom överföring sorterade prover till is var 20 – 30 min.
- Efter önskat antal celler har samlats in, Använd en serologisk pipett överföra cellerna till en ny konisk tub. Centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min.
- Bekräfta renhet med efter sortera analys på små delprover från varje insamlade befolkningen.
- Ta bort supernatanten, tillfälligt i 10 mL FWB och centrifugera vid 250 x g vid 4 ° C i 10 min. Upprepa för totalt två tvättar.
Obs: Det kan vara svårt att ta bort alla supernatanten utan lossnar pelleten. Bifoga en pipettspetsen till en vakuum linje kan hjälpa med borttagning. Om detta inte är tillgänglig, föreslås det att supernatanten samlas i en frisk slang vid pellet dissociation. - Ta bort supernatanten efter andra tvätten.
- Om användarens experimentell design dikterar cellerna vara åter odlade, anvisningarna 2.12 – 2,14. Annars, om celler kommer att användas för omedelbar analys, förbereda celler enligt önskat protokoll.
Obs: Ett exempel på typiska funktionell analys ingår i figur 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
I ett försök att hålla så många kanaler som är tillgängliga för analys som möjligt, livskraftiga celler valdes rutinmässigt baserat på framåt och side scatter, exklusive mycket små och mycket granulat (en typisk grind tillämpas på alla dot tomter i figur 1A). För att avgöra om denna Usenets strategi på ett tillförlitligt sätt uteslutna döda celler, fläckade vi 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (figur 1B). 7AAD fläckar DNA i döda och döende celler på grund av membran permeabilitet och undantas av viabla celler. Lönsamheten för GM-CSF odlade benmärgsceller analyserades omedelbart efter skörd (PH) och 1, 3 och 5 PH. Cell analyseras omedelbart PH hade ungefär 10% av 7-AAD positiva celler när en typisk FSC/SSC grind kopplades till nybakade isolerade celler från benet benmärg (figur 1, efter skörd). En liknande andel döda celler var också närvarande vid dag 1 (~ 12%) och dag 3 (~ 11%) av kultur (figur 1, 1 dag PH och 3 dagar PH). Dag 5 sänktes antalet döda celler inom grinden till ~ 5% (figur 1, 5 dagar PH). Således är använder sådan livskraft grind allmänt lämpliga för sortering på dag 5 och efter. Om användare är begränsade i sin tillgängliga parametrar, därför FSC/SSC gating generellt. Dock för känsligare analyser (särskilt om de förlitar sig på exakt cell nummer), införliva en livskraft fläck (förslag).
Många protokoll för förökning av dendritiska celler rekommenderar utarmning av härstamning positiva celler, särskilt lymfocyter, från benmärg före kultur 11,17. Detta förfarande är tänkt att öka renheten av cellerna återhämtat sig på GM-CSF-medierad differentiering. Normalt celler som uttrycker markörer av T-celler (CD3), B-celler (CD45R eller CD19) och NK-celler (NK1.1) kan vara uttömda genom positiva urval använder magnetiska pärlor eller cellen sortera 11,17,18. Men var baserat på det culturing systemet, lymfocyter sällan återvunna eller upptäcks i dessa analyser. Således, vi försökte bedöma livslängden av lymfocyter som underhålls i Ly6C-CD115-befolkningen bland GM-CSF-driven cellerna (figur 2A). GM-CSF odlade benmärg celler (som inte hade härstamning utarmat) var fläckade av antikroppar mot CD3, CD45R och NK1.1 (i samma fluorophore) och mäts dagligen av flödescytometri (figur 2B). Inom Ly6C-CD115-befolkningen framhärdade CD3/CD45R positiva celler starkt genom dagar 0 – 3 (figur 2B). Endast några CD3/CD45R positiva celler återstod på dag 4 och dag 5 och 6, fanns det ingen CD3/CD45R uttrycker celler som finns. Således, inom 4 dagar av kultur i GM-CSF, härstamning positiva celler var i huvudsak frånvarande och upptäcktes inte alls på dag 5 och 6 i kultur.
Sammansättningen av GM-CSF-driven cellkulturen ändras dagligen i detta system som cellerna utveckla och differentiera (tabell 1; (Se figur 3). Vid tidig tidpunkter, vanligast förekommande cellerna är stamfäder och prekursorer, och på tider flesta celler är senare mer differentierad 10. För att avgöra hur sortering på olika dagar av kultur kan påverka efterföljande utvecklingsmässiga sökvägen eller kinetik, utfördes sorterar 3, 5 och 7 dagar PH (figur 3A). Utvecklingen av befolkningens MoMac (Ly6C-CD115 +) spårades sedan över 2 – 3 ytterligare dagar i kultur (figur 3B-3D).
När sorterade 3 dagar PH, endast 40% av Ly6C-CD115 + celler hade minskat CD115 uttryck inom 24 h efter sortera (PS) (figur 3B). Av 48 h PS, den fraktion som hade down-reglerade CD115 var 66% och 72 h, 70% av cellerna hade denna fenotyp. Denna fenotypiska sammansättning upprätthölls (~ 70-72% Ly6C - CD115-) även efter ytterligare dagar av kultur (inga data anges). När sorterade 5 dagar PH, ~ 75% av cellerna var Ly6C - CD115-, har snabbt ned-reglerade CD115 inom 24 h PS och ~ 80% var CD115 - efter endast 48 h. Denna fördelning kvarstod efter 72 h (figur 3 c). Slutligen, när sorterade 7 dagar PH, down-förordning av CD115 var också ganska snabbt. Inom 24 h PS, ~ 75% av cellerna hade down-reglerade CD115 uttryck, och denna trend upprätthölls efter 48 h (figur 3D). Intressant, när sorteras vid dag 7, var den totala nivån av CD115 uttryck lägre på cellerna inom CD115 + befolkningen.
Således visar dessa fynd att kineticsen av utveckling är något långsammare när sortering vid en tidig dag, exempelvis dag 3 sorterade celler jämfört med de snabbare utvecklingen och differentiering som observerats efter sortering på dag 5 eller 7. Baserat på dessa resultat, en användare som söker större antal moDC bör sannolikt sortera på dag 5 eller 7.
Mognaden svar DC är väl etablerad 6,7,12,14. När de behandlades med en mängd patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs), omogna DC uppreglera uttrycket av MHC, costimulatory molekyler och pro-inflammatoriska cytokiner, förbättra deras T-cell-aktiverande kapacitet 6. Det är dock mindre tydlig när utveckla celler få kapacitet att bemöta PAMP stimulering och som funktion av DC mognad kanske uppvisar de. För att avgöra vilka av de sorterade populationerna skulle reagera på mognaden stimuli, varje befolkning behandlades strax efter sortering med en cocktail av PAMPs inklusive Poly jag: C, lipopolysackarider (LPS), och CpG DNA att utlösa toll-liknande receptorer (TLR) 3 (TLR3), TLR4 och TLR9, respektive. Cellerna var behandlad (eller obehandlad) för 24 h och uttryck av CD86 och MHCII mättes genom flödescytometri (figur 4A-4B). Dessutom mättes IL-12p 40/70 och IL-6 produktion i supernatanterna av cytokin array ELISA (figur 4 c-4D).
CMPs och god tillverkningssed uttryckt mycket låga nivåer av MHC klass II och CD86 i en ostimulerade stat och dessa uttryck mönster inte förändrades betydligt vid exponering för cocktailen av PAMPs (figur 4A och 4B). Likaså var uttrycket av MHC klass II av monocyter också låg och ändrade lite efter PAMP exponering (figur 4A). Men uttrycket av CD86 var moderat på monocyter 24 h efter sortering och det ökade ytterligare efter 24 h stimulering. Högre basal uttryck av MHC klass II och CD86 i MoMacs och MoDCs observerades båda populationerna uppvisade en stark induktion av dessa molekyler vid PAMP stimulering. När det gäller MHC klass II uttryck efter stimulering, fanns det ingen statistisk skillnad mellan CMPs, god tillverkningssed och monocyter, medan de MoMacs och MoDCs bildade en distinkt grupp. Men när det gäller CD86 uttryck var CMPs och god tillverkningssed cellerna statistiskt annorlunda än MoMacs och MoDCs. Monocyter var dock inte annorlunda än MoMacs eller MoDCs.
Vi ville nästa bedöma var och en av de fem befolkningarna relativa förmåga att producera cytokiner som svar på TLR stimulering. Således utfört vi en cytokin-analysen på sorterade befolkningen efter kultur i närvaron eller frånvaron av den TLR agonist cocktail används ovan. Celler odlades med stimuli för 24 h och sedan supernatanterna samlades. Vi observerade mycket lite IL - 12 p 40/70 eller IL-6 produktion av CMPs vid TLR stimulering (figur 4 c-4D). Den andra befolkningen, god tillverkningssed, kunnat inte producera IL-12p 40/70 (figur 4 c), men dessa celler produceras en låg mängd av IL-6 vid stimulering av PAMPs (figur 4 d). De högsta nivåerna av cytokin produktion observerades i de sistnämnda tre populationerna. Monocyter och MoMacs hade mycket liknande mönster och magnituder av cytokin produktion. Både ökat kraftigt IL - 12 p 40/70 och blygsamt ökade IL-6 produktion upp stimulering (figur 4 c-4D). Intressant, ökade i närvaro av PAMPs MoDCs inte IL-12 p 40/70 sekretion; denna population ökade dock kraftigt IL-6 produktion (figur 4 c-4D). Dessa fynd tyder på att de sorterade populationerna underhålls deras immunfunktionerna efter isolering.
Figur 1: viabla celler inom framåt kontra Side Scatter gate. Mus benmärgen var odlade i GM-CSF och livskraft mättes med hjälp av 7-AAD (7-amino-actinomycin D) färgning efter skörd (PH) och 1, 3 och 5 dagar efter skörd. (A) viabla celler valdes genom att tillämpa en grind (Viable) som utelämnas små och extremt detaljerade händelser baserat på FSC och SSC. (B) histogrammen för 7-AAD färgning genereras från händelser inom Viable (FSC/SSC) gate. Händelserna positivt för 7-AAD visar celler som genomgår apoptos. Pilarna anger livskraftig cell gating. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: lymfocyter hos Ly6C-CD115-. Mus benmärgen var odlade i GM-CSF och lymfocyter markörer (CD3, CD145R och NK1.1) analyserades dagligen av flödescytometri. (A) Cell var målat med Ly6C-PE och CD115-APC att identifiera Ly6C-CD115-celler. Kvadrant gate tillämpades baserat på enfärgad kontroller. Falsk dot tomt genereras från dag 0 (B) CD3, CD45R och NK1.1 uttryck för Ly6C-CD115-celler analyserades på dagen för skörd (dag 0) till dag 6. Blodkroppar var normaliserade till läge med en mjukvara Flödesanalys flödescytometri. Pilen anger Ly6C-CD115 - gating. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: kinetik av utveckling av Ly6C-CD115 +-celler efter sortering på olika dagar. (A) mus benmärgen var skördas och odlade i GM-CSF. Alikvoter av 1 x 107 celler var skördade (B) 3, (C), 5, eller (D) 7 dagar efter skörd (PH). På de angivna dagarna PH, Ly6C-CD115 +-celler var sorteras från blandad kultur (före sortering) och analyseras omedelbart efter sortera (PS). Sorterade celler var åter odlade i GM-CSF och förändringar i Ly6C/CD115 uttryck analyserades dagligen av flödescytometri. Ruta och pil indikerar sortering gate. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: mognad och cytokin uttryck TLR stimulering. Cellerna var sorterade i 5 populationer på dag 3 av kultur i GM-CSF. De behandlades sedan med en cocktail av PAMPs (LPS, Poly jag: C och CpG DNA) för 24 h. menar fluorescerande intensitet (MFI) (A) MHC klass II och (B) CD86 analyserades omedelbart efter sortera (PS) och 24 h med och utan PAMPs av flödescytometri. Felstaplar representera standardavvikelsen för 3-5 replikera experiment. (C) IL - 12 p 40/70 och (D) IL-6 i supernatanterna 3 poolade prover mättes av cytokin array dot blot ELISA efter 24 h med och utan PAMPs. RLU; Relativa ljus enheter; -/ + indikerar närvaro av cell surface markören för utsedda befolkningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Dag 3 | Dag 5 | Dag 7 | |||||
| Fenotyp | Celltyp | Min | Max | Min | Max | Min | Max |
| Ly6C-CD115-CD11c - | CMP | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt |
| Ly6C + CD115 + | Mono | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | MoDC | Ej tillämpligt | Ej tillämpligt | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
Tabell 1: Förväntade lägsta och högsta antalet celler återhämtat sig efter sortera per 1 x 107 celler. CMP (gemensamma myeloida stamceller); GMP (granulocyt/makrofag stamceller) Mono (monocyter); MoMac (monocyt-derived makrofag); MoDC (monocyt-derived dendritiska cellen). Ej tillämpligt (inte tillgängligt); Min (minsta cell avkastning av 1 x 107 celler); Max (maximal cell avkastning av 1 x 107 celler).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll underlättar isolering av GM-CSF-driven stamceller och föregångaren celltyper i siffror räcker för flera typer av analyser inklusive biokemiska analyser, analyser av cellulär funktion in vitroeller instillation i vivo. Denna metod innebär ett betydande framsteg i fältet monocyt-derived dendritiska cellen utveckling, möjliggör tillförlitlig isolering och identifiering av celler tidigt i denna väg av utveckling samt de differentierade celltyper oftare isolerade i tidigare studier.
Tidigare protokoll för isolering av stamfäder och prekursorer som genereras från benmärgen i vitro har förlitat sig på CFSE-färgning att identifiera proliferativ progenitor celler 17 eller färgning med CD31 och Ly6C som markörer av myeloida celler 18 . Den CFSE färgning protokollet beskrivs av Naik var avsedd för användning i generation av Flt3L-driven DC stamfäder och prekursorer 17. När vi försökte detta tillvägagångssätt i GM-CSF kultur systemet, stött vi på två huvudfrågor. CFSE var något cytotoxiska för utvecklande cellerna och var så ljust (även i delade celler) som det gjorde ersättning svårt. Denna strategi visade sig vara olämplig för våra mål att isolera tidigt celltyper (progenitorceller), samt celler över utvecklingsmässiga spektrumet, från mycket proliferativ (CMPs/god tillverkningssed) att högt utvecklade (MoDC/MoMac). Vi försökte också sortering strategin för GM-CSF-driven celler beskrivs av Leenen's group som baserades på CD31 och Ly6C 18. Vi fann dock att CD31 var problematisk. Det uttrycktes på mycket låga nivåer (vilket gör det svårt att lösa befolkningarna för ren sortering) av en försvinnande liten delmängd av celler, och endast mycket tidigt under perioden kultur. I själva verket var CD31 uttryck inte detekterbar förbi dag 2 av kultur i GM-CSF 10.
Ly6C, var dock en mycket nyttig molekyl för att separera celler i olika stadier av utveckling på grund av dess övergående mönster av uttrycket 10. Tillägg av CD115 gjorde det möjligt att närmare urskilja celler på mellanliggande och senare stadier av utveckling som inte var möjligt med CD31. Vi undersökte även andra markörer för föräldraparets såsom CD34 och CD117 i hopp om att isolera stort antal av dessa tidiga celler 10. Men till skillnad från som rapporterats i Flt3L systemet, fann vi att CD34 och CD117 uttrycktes också en mycket liten delmängd av celler och var praktiskt taget frånvarande av dag 3 kultur 17. Dessa stamceller markörer kan vara användbart i framtida studier dock att skilja grupper inom CMP eller GMP befolkningarna.
I området i närheten finns det flera potentiella ändringar i protokollet som kan påverka avkastningen av önskad cellpopulationer. Först, kan användaren välja att tillämpa en livskraft fläck för att utesluta eventuella döda celler. Baserat på observationer, graden av döda celler inom en typisk framåt och side scatter gate är relativt låg i allmänhet, och utgör problem endast under de första dagarna av kultur, sammanfallande med minskningar härstamning positiva lymfocyter. För applikationer i vilken cell nummer måste vara exakt, kommer en livskraft fläck garanterar dock uteslutande av döda celler.
En andra potentiella ändring är utarmning av härstamning-positiva lymfocyter före kultur. Vi har försökt detta tillvägagångssätt för att hantera små befolkningen av härstamning positiva celler som observerades regelbundet inom Ly6C-CD115-cell befolkningen. Den övergripande cell avkastningen var något lägre på dag 5 och 6, och renhet var inte signifikant högre (inga data anges). Således, renhet inte motiverar minskade avkastningen. Jämväl, om användaren planerar att sortera på dag 5 eller efter, frekvensen av lymfocyter inom kulturen är långt under 1% och bör inte utgöra ett problem.
Slutligen, eftersom denna strategi är utformad för att isolera cellerna en stor utvecklingsmässiga spektrum användaren bör skräddarsy tidpunkten för deras sortera för att samla så många av önskad befolkningarna som möjligt. Denna sortering strategi ger troget de celltyper som anges oavsett dagen för kultur som cellerna sorteras. Till exempel celler med fenotypen Ly6C + CD115-CD11c-är trogen den GMP fenotyp och funktion på samma sätt oavsett om de är sorterade och isolerad på dag 3 eller 5 i kultur. Frekvensen av dessa celler är dock mycket större på dag 3 än 5, så om målet är isolering av denna celltyp, sortering på dag 3 skulle vara rekommenderat. Det är också anmärkningsvärt att celler sorterade på dag 3 framsteg genom de efterföljande utvecklingsstadierna med långsammare kinetik än om de var sorterade på dag 5 eller 7 (figur 3).
Medan denna metod möjliggör en tydlig avgränsning och isolering av 5 – 6 distinkta populationer längs utvecklingsmässiga spektrumet, finns det sannolikt många fler populationer eller övergångsperiod etapper längs denna väg. Inom var och en av de fem beskrivna befolkningarna kan det finnas flera delpopulationer på lite olika steg av utveckling. Exempelvis har vi observerat ”distinkta” populationer med mellanliggande nivåer av CD115 och Ly6C som genomgår något annorlunda mönster av utveckling, när det gäller hur många moMac och moDC som genereras (inga data anges). Det är också troligt att befolkningen tidigare observerats i vivo är närvarande i kultur och sorteringssystem, men dessa har varit svårt att identifiera på grund av deras mycket låg frekvens. Populationer som cMOP 19, MDP 20eller CDP 21 är sannolikt för närvarande, men kan skymmas inom de största populationerna. Framtida studier kommer att behövas för att ytterligare klargöra de talrika utvecklingsstadier som kan isoleras inom denna sortering ram med tillägg av specifika markörer för differentiering. Värdet av denna sortering strategi är att det tillåter konsekvent isolering av stora mängder utvecklingsstörda olika faser under DC Ontogeni.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga konflikter att avslöja.
Acknowledgments
Vi är tacksamma för tekniskt bistånd från Alison kyrkan fågel på Auburn University School av veterinärmedicin Flow flödescytometri anläggningen, för finansiering från NIH att EHS R15 R15 AI107773 och cellulär och molekylärbiologi Program vid Auburn University för sommaren forskningsfinansiering att PBR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
