Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generasjon av stort antall myelogen Progenitors og dendrittiske celle forløpere fra Murine benmarg bruker en roman celle sortering strategi

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57365
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Auburn University

Summary

Her gir vi en metode for å identifisere og isolere stort antall GM-CSF drevet myeloide celler ved hjelp av høyhastighets celle sortering. Fem forskjellige populasjoner (felles myelogen progenitors, granulocytt/macrophage progenitors, monocytter, monocytt-avledet makrofager og monocytt-avledet DCs) kan identifiseres basert på Ly6C og CD115.

Abstract

Kulturer av monocytt-avledet dendrittiske celler (moDC) fra musen benmarg bruker granulocytt-Macrophage koloni stimulerende faktor (GM-CSF) har nylig blitt anerkjent å være mer sammensatt gruppe enn tidligere verdsatt. Disse kulturene inneholder rutinemessig moDC samt monocytt-avledet makrofager (moMac), og noen mindre utviklede celler som monocytter. Målet med denne protokollen er å gi en konsistent måte for identifikasjon og separasjon av mange celletyper tilstede i disse kulturene som de utvikler, slik at deres spesifikke funksjoner kan utredes videre. Sortering strategien presenteres her skiller celler først i fire populasjonene basert på uttrykk for Ly6C og CD115, begge er uttrykt transiently av celler som de utvikler i GM-CSF drevet kultur. Disse fire populasjoner inkluderer felles myelogen progenitors eller CMP (Ly6C-, CD115-), granulocytt/macrophage progenitors eller GMP (Ly6C +, CD115-), monocytter (Ly6C +, CD115 +), og monocytt-avledet makrofager eller moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c legges også til sortering strategien å skille to bestander i Ly6C-, CD115-befolkningen: CMP (CD11c-) og moDC (CD11c +). Endelig, to bestander kan videre skilles i Ly6C-, CD115 + populasjon, basert på nivået av MHC, klasse II uttrykk. MoMacs express lavere nivåer av MHC, klasse II, mens en monocytt-avledet DC forløper (moDP) uttrykker høyere MHC, klasse II. Denne metoden gir pålitelige isolasjon av flere developmentally forskjellige populasjoner i antall tilstrekkelig for en rekke funksjonelle og utviklingsmessige analyser. Vi markere en slik funksjonelle avlesning, differensial svar disse celletyper stimulering med Pathogen-Associated molekylær mønster (PAMPs).

Introduction

Dyrking murine beinmargen celleområde med cytokin er granulocytt-Macrophage koloni stimulerende faktor (GM-CSF) mye brukt som en metode til å generere monocytt-avledet dendrittiske celler (moDC, også kjent som inflammatorisk DC) i store tall 1, 2,3,4,5. Disse cellene har vært svært nyttig i en rekke studier av dendrittiske celle (DC) funksjonen 6,7,8. Vanligvis disse murine benmarg cellene er kultivert for 6-8 dager og deretter brukes for studiet av dendrittiske celle funksjon 5. Disse kulturene hadde lenge vært ansett som hovedsakelig homogen, bestående av et flertall av forskjellige moDC. Flere nylig, har det blitt klart at på slutten av denne 6 – 8 dagersperioden kultur, det er faktisk mange moDC, i tillegg til store delsett med differensiert monocytt-avledet makrofager (moMacs) 9,10,11. Våre egne studier har ytterligere utvidet disse funnene viser at andre delsett av mindre utviklede celler, for eksempel moDC prekursorer (moDP) og monocytter, forblir i kulturer på lav frekvens selv etter 7 dager 10. Dermed kan studier dendrittiske celler (DC) funksjon med celler generert av dette systemet reflektere svarene på en bredere kohort celletyper enn tidligere verdsatt.

Vi har lært mye fra studiet av GM-CSF-generert moDC knyttet til funksjonen i disse cellene i sluttfasen av differensiering 12,13,14. Men vi forstår betydelig mindre om utviklingsmessige veien av disse cellene 2,15,16 og av hvordan og når de viser bestemte funksjoner som: respons til patogen-forbundet molekylær Mønster (PAMPs), fagocytose, antigen prosessering og presentasjon 13og antibakteriell aktivitet. En protokoll for isolering av store antall konvensjonelle Flt3L-drevet DC progenitors og prekursorer er rapportert 17. Isolasjon av disse forskjellige befolkningsgrupper var oppnådd, med carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-farget bein margtransplantasjon celler (for å spore dele celler) og kultur i Flt3L i 3 dager. Cellene ble deretter utarmet av linage positiv celler og sortert i stamfar og forløper populasjonene basert på CD11c uttrykk 17. En annen tilnærming av Leenens gruppe å identifisere tidlig progenitors av DC i GM-CSF drevet kultur var sortere cellene basert på CD31 og Ly6C 18. Det opprinnelige målet var å skape en lignende metode progenitors og forløpere for GM-CSF-drevet moDC. På grunn av de spesifikke celletyper generert av GM-CSF, tilpasset vi tilnærming og sortering strategi basert på uttrykk for molekyler som ble uttrykt i tidlig og senere stadier av utviklingen. Vi til slutt bestemte at Ly6C, CD115 (CSF-1 reseptor), og CD11c var den beste markører for skille disse cellen typer 10.

Her presenterer vi en metode for isolering av celler på flere forskjellige stadier av utviklingen langs veien av differensiering drevet av GM-CSF: felles Myeloid Progenitor (CMP), granulocytt-Macrophage stamfar (GMP), monocyte, monocytt-avledet Macrophage (MoMac) og monocytt-avledet DC (MoDC). MoMac befolkningen kan videre segregerte basert på nivå av MHC, klasse II uttrykk, får en moDC forløper befolkningen (moDP) 10. Vi benytter en høyhastighets fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) strategi for å isolere disse 5 populasjonene basert på uttrykk for Ly6C, CD115 og CD11c. Deretter viser vi undersøkelse av disse cellene i funksjonelle analyser avsløre sine svar til PAMP stimulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbeid ble godkjent av Auburn University institusjonelle Animal Care og bruk komiteen i henhold til anbefalingene beskrevet i veiledningen og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health.

1. forberedelse til benmargen samling

  1. Forberede 250 mL fullfører media ved å legge til en løsning av Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium med 10% fosterets kalv serum, 2 mM glutamin og 50 µM 2-mercaptoethanol til toppen av en 0.22 µm vakuum filter kolbe enhet, og bruke vakuum.
    Merk: Komplett medium kan lagres på 4 ° C for opptil 2 måneder.
  2. Forberede 70% etanol løsning ved å blande 350 mL av 100% etanol med 150 mL steril H2O i en 500 mL kolbe.
  3. Angi sentrifuge til 4 ° C.
  4. Sterilisere tang, skalpell og saks i 70% etanol.
  5. Bruker en serologisk pipette, legge til 5 mL av komplett tre 60 mm Petri retter.
  6. Bruker en serologisk pipette, legge til 30 mL av komplett slik konisk 50 mL.

2. samling Murine bein margtransplantasjon celler

  1. Euthanize C57BL/6 mus av CO2 narkose i henhold til regler fastsatt av 2013 amerikaneren Veterinary Legeundersøkelse Forening (AVMA) retningslinjene på Euthanasia.
  2. Fjerne og strimmel bakbena.
    1. Mette bakben ben og overkropp med 75% etanol, og gjøre grunne skjærer gjennom huden rundt hofteleddet med buet vev saks. Ved hjelp av pinsett, fast trekke huden fra hoften mot ankelen, avslørende muskelen. Bruk saks for å fjerne huden klaff.
    2. Fjerne hele bakben ben ved å skjære gjennom benet like over femur/hofteleddet.
      Merk: I tillegg til sterilisering området, vil etanol hjelp i å tilby rene kutt og forhindre at håret forurensende prøvene.
    3. Hvis beina overføres til en ny plassering for benmarg høsting, senke beina i komplett.
  3. Arbeid i et sterilt biosikkerhet skap, overføre bena til en av tidligere forberedt Petri retter.
  4. Bruk saks til å klippe bare under ankelen og nøye fjerne så mye av muskel og elastisk connective vev som mulig. Overføre renset benet til andre forberedt Petriskål.
    Merk: Selv om det ikke er nødvendig å fjerne alle muskler, mye gjenværende vev kan gjøre det vanskelig å skylle ut benmargen.
  5. Skille femur, kne og tibia.
    1. Ved hjelp av pinsett, holde beinet på kne og Finn margen.
      Merk: benmarg skal vises som en svak rød linje inne i bein hulrommet på toppen av femur og mot slutten av tibia.
      1. Bruke saks, lage tre kutt som følger.
        1. Kuttet tibia rett over der margen vises til slutt.
        2. Kuttet rett under kneleddet.
        3. Kuttet rett over kneleddet.
        4. Hvis hip joint fortsatt er koblet til femur, kuttet rett under hofteleddet.
      2. Gjenta denne prosessen på andre etappe tilbake tre fragmenter til Petriskål.
  6. Flush benmarg fra femur og tibia.
    1. Fyll en 10 mL sprøyte med komplett medier fra 50 mL konisk rør og lue med 23 G nål.
    2. Holde beinet med tang ovenfor tredje forberedt Petriskål, sette inn nålen inn i benet kanalen og presse media gjennom, skylle ut cellene (som kan dukke opp som en intakt "plugg" eller flere klynger). Gjenta til ingen mer farge kan ses gjennom benet. Fylle sprøyten med media etter behov.
  7. Knuse epiphyses.
    1. Mens du fremdeles er i andre Petriskål, hold kneet cap med tang, og bland knærne med spissen av sprøyten. Fortsett til epiphyses er ikke lenger rød.
  8. Bruker sprøyten, overføre cellene fra andre og tredje Petriskål til 50 mL røret. Bruddet opp klumper av pipettering forsiktig opp og ned. Prøv ikke å generere bobler. Sentrifuger 250 x g på 4 ° C i 10 min.
  9. Lyse røde blodlegemer
    1. Fjerne nedbryting med serologisk pipette, dislodge pellet ved å sveipe og lyse røde blod celler av incubating inne 1 mL av bekreftelser (Ammonium-klor-kalium) lyseringsbuffer i 1 min i romtemperatur.
    2. Bruker en serologisk pipette, Legg 40 mL HBSS (Hanks balansert saltløsning) buffer.
  10. Bruker en serologisk pipette, filtrere cellene om en 70 µm celle sil i en ny 50 mL konisk tube. Sentrifuger 250 x g på 4 ° C i 10 min.
  11. Bruker en serologisk pipette, Fjern supernatant og vask celler med 40 mL komplett. Sentrifuger 250 x g på 4 ° C i 10 min.
    Merk: På dette stadiet, avstamning positiv lymfocytter kan fjernes av FACS eller magnetiske kolonnen rensing. Lymfocytter beholdes imidlertid ikke lang sikt i kultur. Selv om et stort antall avstamning positiv celler finnes i Ly6C-CD115-befolkningen i benmargen ex vivo, nesten alle er fraværende av dag 5 (figur 2).
  12. Bruke en serologisk pipette, fjerne nedbryting og kultur benmarg cellene i komplett medier med 10 ng/mL rekombinant musen GM-CSF en tetthet på 1 x 106 celler/mL.
    Merk: Vanligvis 4 x 107 totalt celler kan høstes etter røde blodlegemer lysis. Imidlertid forvent så lite som 2 x 107 for nybegynnere og opptil 5 x 107 celler for erfarne harvesters.
  13. Bruker en serologisk pipette, overføre cellene til vev kultur plater og ruge på 37 ° C i 5% CO2. Hvis bruker en 24-vel plate, frø hver med 2 mL celle suspensjon.
  14. Hver 48 h, bruk en serologisk pipette å fjerne halvparten av media og erstatte med fersk komplett medier og GM-CSF.
    Merk: Kulturer kan holdes til 9 dager. Imidlertid endringer komposisjon over tid. Se avsnitt 3 for mer informasjon.

3. velge dag av slag

  1. Når celle befolkningen komposisjoner endres over tid, velger du en dag som gir flest ønsket celler.
  2. Se tabell 1 for celle avkastning innlegget sorteringen for hver av de etter 3, 5 og 7 dager av kultur i GM-CSF per 1 x 107 celler.

4. farging strategi

  1. Bruke små dele celler skal forberede kontroll prøver. Inkluderer en unstained kvinne kontroll, kompensasjon kontroll prøver med bare én fluorescerende antistoff hver, og fluorescens-minus-en kontroller som alle antistoffer legges unntatt en, kontroll til ikke-spesifikk fluorescens i den kanalen. Hvis bruker indirekte merking, inkluderer primære alene, sekundær alene, og både primære og sekundære.
    Merk: Phycoerythrin (PE) og allophycocyanin (APC) merket antistoffer gir forskjellige separasjon med minimal blø over når de brukes sammen. Men hvis fluorochrome er begrenset, uttrykkes CD115 på et relativt lavt nivå, mens Ly6C uttrykkes på svært høye nivåer. Derfor lysere fluorochromes er ønskelig for anti-CD115 og anti-Ly6C fluorochromes er valgt for å hindre blø over.
  2. Forberede 100 mL av FACS vask Buffer (FWB) ved å blande 97 mL kaldt Dulbecco fosfat bufret saltoppløsning (DPBS) med 3 mL fosterets kalv serum i et 50 mL konisk rør, og plasser i en isbadet.
  3. Bruke en pipette å forsiktig, men grundig, Pipetter celler opp og ned for å løsne løst tilhenger celler.
  4. Bruke en serologisk pipette, overføre celler slik konisk 50 mL. Sentrifuger 250 x g på 4 ° C i 10 min.
    1. Hvis cellen volumet overskrider 50 mL, overføre celler til nødvendig antall rør og kombinere ved farging trinn.
  5. Forsiktig hell av nedbryting og vaskes pelleted cellene ved å legge 30 mL av FWB med en serologisk pipette. Sentrifuge 250 x g ved 4 ° C i 10 min, og gjenta vask.
    Merk: Hvis forventet høy celledød celler kan vaskes med FWB med så lite som 0,5% fosterets kalv serum (FCS). Dette hindrer celle clumping.
  6. Suspendere og flekken celler per antistoff produsentens instruksjoner.
    1. Suspendere 5 x 107 celler i 1 mL av FWB og legge 2 µg hver av anti-Ly6C og anti-CD115 merket med fluorophores (av forskerens valg). Å fremme skille CMP fra moDC (begge er Ly6C- og CD115-), legge 2 µg av anti-CD11c antistoffer (CMP er CD11c-, moDC er CD11c+). Inkuber i 30 min på is.
      Merk: Figur 3 ble generert ved hjelp av Ly6C-PE og CD115-APC.
  7. Bruker en serologisk pipette, legge 10 mL av FWB og sentrifuger på 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
  8. Forsiktig hell av nedbryting og vaskes pelleted cellene ved å legge 30 mL av FWB med en serologisk pipette. Sentrifuge 250 x g ved 4 ° C i 10 min, og gjenta vask.
  9. Før frakobles celler, sveiper du rør grundig for å dislodge pellet. Bruk en serologisk pipette suspendere cellene på 1 x 107 cellen/mL av FWB, og filtrere gjennom 35-µm cellen. Bruk en serologisk pipette for å overføre filtrerte cellene til polypropylen rør og plassere på is helt klar til å sortere.
    Merk: Hvis polypropylen er tilgjengelig, protein belagt (tørr melk nonfat eller FCS) polystyren rør kan brukes til å redusere bindende.

5. sett Gates basert på kontroll prøver

Merk: For å hindre celle avbrudd på grunn av presset av høyhastighets strømmen strømmen, bruke en 100-130 µm dyse for cellen sortering.

  1. Kjør kontrollen unstained kvinne (se trinn 4.1) gjennom cellen sorter, og bruke en gate for å utelate små rusk (lav frem XY; FSC) og svært detaljerte (høy side XY; SSC) partikler.
    1. Analysere bare de senere stadiene (monocytter, moMac/MoDP og MoDC), kan du bruke gating bare med større celler (høy FSC).
    2. Hvis det brukes levedyktighet flekker, bruk disse utelate flekkete, ikke-levedyktige hendelser (et eksempel er illustrert i figur 1).
  2. Kjør enkelt fluorescerende kontroll eksemplene gjennom cellen sorter, og justere kompensasjon etter behov.
  3. Kjøre et utvalg av multi-merket prøven. Observere fire distinkte bestander: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monocytter), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), og Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Bruke en gate for å isolere hver av de fire store populasjonene.
    Merk: CMPs og moDC deler Ly6C-CD115-fenotypen. Men de kan være differensiert basert på CD11c uttrykk: CMP mangler CD11c, mens MoDCs express CD11c.

6. samling av isolerte bestander

  1. Forberede samling rør ved å legge til nok FCS for å oppnå minst 20% siste konsentrasjon når full. For eksempel hvis bruker 5 mL rør, Legg 1 mL av FCS før du sorterer, og fjerne røret når 5 mL totalt volum.
  2. For å hindre membran omsetning og antistoff opptak, Hold alle prøver (blandet og sortert) på 4 ° C hele sorteringen.
    1. Hvis dette ikke er mulig, holde røret som inneholder cellene sorteres på is som mulig og overføre dele til sorter etter behov.
    2. I tillegg overføre sorterte prøver for hvert 20-30 min.
  3. Når ønsket antall celler har blitt samlet inn, kan du bruke en serologisk pipette overføre cellene til en ny konisk tube. Sentrifuger 250 x g på 4 ° C i 10 min.
    1. Bekreft renhet etter slag analyse på små dele fra hver samlet befolkning.
  4. Fjern nedbryting, avbryte 10 mL av FWB og sentrifuge 250 x g på 4 ° C for 10 min. Gjenta totalt av to vasker.
    Merk: Det kan være vanskelig å fjerne alle nedbryting uten dislodging av pellets. Feste en pipette tips til en vakuum linje kan hjelpe med fjerning. Hvis dette ikke er tilgjengelig, er det foreslått at nedbryting samles i en fersk rør ved pellet dissosiasjon.
  5. Fjerne nedbryting etter andre vask.
  6. Hvis brukerens eksperimentell design dikterer cellene re kultivert, følger du fremgangsmåten 2.12-2.14. Ellers hvis cellene skal brukes for umiddelbar analyse, forberede celler i henhold til ønsket protokollen.
    Merk: Et eksempel på typiske funksjonsanalyse er inkludert i Figur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I et forsøk på å holde så mange kanaler tilgjengelig for analyse som mulig, levedyktig celler ble rutinemessig valgt basert på fremover og side scatter, unntatt veldig små og svært detaljert hendelser (en vanlig gate brukes på alle dot tomter i figur 1A). For å fastslå om denne gating strategien pålitelig utelukket døde celler, farget vi med 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (figur 1B). 7AAD flekker DNA i død og døende celler på grunn av membran permeabilitet og er utelukket av levedyktige cellers. Levedyktigheten til GM-CSF kulturperler bein margtransplantasjon celler ble analysert umiddelbart etter høsting (PH) og 1, 3 og 5 pH celle analysert umiddelbart PH hadde ca 10% av 7-AAD positiv celler når en typisk FSC/SSC gate ble brukt på fersk isolert celler fra benet marg (figur 1, post-Harvest). En tilsvarende andel av døde celler var også til stede på dag 1 (~ 12%) og dag 3 (~ 11%) av kultur (figur 1, 1 dag PH og 3 dager PH). Dag 5, ble antall døde celler innenfor porten redusert til ~ 5% (figur 1, 5 dager PH). Dermed er bruker slik levedyktighet gate generelt egnet for sortering på dag 5 og etter. Hvis brukere har begrenset deres tilgjengelige parametere, er FSC/SSC gating passer generelt. Men for mer følsomme analyser (spesielt hvis de er avhengige av nøyaktig cellen tallene), innlemme en levedyktighet flekk (forslag).

Mange protokoller for overføring av dendrittiske celler anbefaler uttømming av avstamning positiv celler, spesielt lymfocytter, fra benmargen før kultur 11,17. Denne fremgangsmåten er antatt å øke renheten av cellene gjenopprettet ved GM-CSF-mediert differensiering. Vanligvis celler uttrykke markører for T-celler (CD3), B celler (CD45R eller CD19), og NK celler (NK1.1) kan bli tømt av positiv utvalg med magnetiske perler eller cellen sortering 11,17,18. Men var basert på culturing system, lymfocytter sjelden gjenopprettet eller oppdaget i disse analyser. Derfor søkt vi å vurdere levetiden av lymfocytter vedlikeholdes i Ly6C-CD115-befolkningen blant GM-CSF-drevet cellene (figur 2A). GM-CSF kultivert bein margtransplantasjon celler (som ikke hadde vært avstamning utarmet) var farget med antistoffer mot CD3, CD45R og NK1.1 (i samme fluorophore) og målt daglig av flowcytometri (figur 2B). I Ly6C-CD115-befolkningen faste CD3/CD45R positive celler sterkt gjennom dager 0-3 (figur 2B). På dag 4, bare noen få CD3/CD45R positive celler forble og dag 5 og 6, var det ingen CD3/CD45R uttrykke celler. Dermed innen 4 dager etter kultur i GM-CSF, avstamning positiv celler var egentlig borte og ble ikke oppdaget på alle dager 5 og 6 kultur.

Sammensetningen av GM-CSF-drevet cellekultur endres daglig i systemet når cellene utvikle og skille (tabell 1; Figur 3). På tidlig tidspunkt, rikeste cellene er progenitors og forløpere, og i tider fleste cellene er senere mer differensiert 10. For å avgjøre hvordan sortering på ulike dager kultur kan påvirke den påfølgende utviklingsmessig bane eller kinetikk, ble sorterer utført 3, 5 og 7 dager PH (figur 3A). Utviklingen av befolkningen MoMac (Ly6C-CD115 +) ble deretter sporet 2-3 ytterligere dager i kultur (figur 3B-3D).

Når sortert 3 dager PH, bare 40% av Ly6C-CD115 + celler hadde redusert CD115 uttrykk innen 24 timer etter slag (PS) (figur 3B). Brøk som hadde ned-regulert CD115 var 66% 48t PS, og 72 h, 70% av cellene hadde denne fenotypen. Dette fenotypiske komposisjon ble opprettholdt (~ 70-72% Ly6C - CD115-) selv etter flere dager med kultur (data ikke vist). Når sortert 5 dager PH, ~ 75% av cellene var Ly6C - CD115-, har raskt ned-regulert CD115 24 h PS og ~ 80% var CD115 - etter bare 48 timer. Distribusjonen ble opprettholdt etter 72 h (Figur 3 c). Til slutt, da sortert 7 dager PH, ned-regulering av CD115 var også ganske rask. ~ 75% av cellene hadde ned-regulert CD115 uttrykk 24 h PS, og denne trenden ble opprettholdt etter 48 h (figur 3D). Interessant, da sortert på dag 7, var det generelle nivået av CD115 uttrykk lavere på cellene i befolkningen CD115 +.

Dermed tyder disse funnene på at the kinetics av utvikling er litt tregere når sortering i en tidlig dag, som 3 sortert celler i forhold til rask utvikling og differensiering observert etter sortering på dag 5 eller 7. Basert på disse resultatene, en bruker søker større antall moDC bør sannsynligvis Sorter på dag 5 eller 7.

Modning svaret FM er godt etablert 6,7,12,14. Når behandlet med en rekke patogen-forbundet molekylær mønster (PAMPs), umodne DC opp-regulere uttrykket av MHC, costimulatory molekyler og pro-inflammatoriske cytokiner, styrke deres T celle aktivering kapasitet 6. Men er det mindre klart når utvikle celler få kapasitet til å reagere PAMP stimulering og hvilken funksjon av DC modning kan de viser. For å avgjøre hvilke av sorterte befolkningen ville svare på modning stimuli, hver befolkningen ble behandlet etter sortering med en cocktail av PAMPs inkludert Poly jeg: C, lipopolysaccharides (LPS), og CpG DNA å utløse toll-like reseptor (TLR) 3 (TLR3), TLR4 og TLR9, henholdsvis. Cellene ble behandlet (eller ubehandlet) 24 h og uttrykk for CD86 og MHCII ble målt ved flowcytometri (figur 4A-4B). Videre ble IL-12p 40/70 og IL-6 målt i supernatants av cytokin utvalg ELISA (figur 4C-4D).

CMPs og GMPs uttrykt svært lave nivåer av MHC klasse II og CD86 i en unstimulated tilstand, og disse uttrykk mønstre ikke endret betydelig ved eksponering til cocktail av PAMPs (figur 4A og 4B). Likeledes, uttrykket av MHC, klasse II av monocytter var også lav og endret litt på PAMP eksponering (figur 4A). Imidlertid uttrykk for CD86 var moderat på monocytter 24 timer etter sortering og økte videre etter 24 h stimulering. Høyere basale uttrykk av MHC klasse II og CD86 i MoMacs og MoDCs ble observert, og populasjonene viste en sterk induksjon av disse molekylene ved PAMP stimulering. I form av MHC klasse II uttrykk etter stimulering, var det ingen statistisk forskjell mellom CMPs, GMPs og monocytter, mens den MoMacs og MoDCs dannet en distinkt gruppe. Likevel, i form av CD86 uttrykk, CMPs og GMPs cellene var statistisk annerledes enn MoMacs og MoDCs. Imidlertid var monocytter ikke annerledes enn MoMacs eller MoDCs.

Neste ønsket vi å vurdere relativ evne til hver av de fem populasjonene å produsere cytokiner svar TLR stimulering. Derfor utført vi en cytokin analysen på sorterte bestander etter kultur i tilstedeværelse eller fravær av TLR Agonistiske cocktail ovenfor. Cellene ble kultivert med stimuli 24 h, og supernatants ble samlet. Vi observerte lite IL - 12 p 40/70 eller IL-6 produksjon av CMPs ved TLR stimulering (figur 4C-4D). Andre befolkningen, GMPs, klarte ikke å produsere IL-12p 40/70 (figur 4C), men disse cellene produsert lite IL-6 ved stimulering av PAMPs (Figur 4 d). De høyeste nivåene av cytokiner produksjonen ble observert i de siste tre populasjonene. Monocytter og MoMacs hadde ligner mønstre og størrelsen av cytokiner produksjonen. Begge sterkt økte IL - 12 p 40/70 og beskjedent økt IL-6 produksjon opp stimulering (figur 4C-4D). Interessant, økte i nærvær av PAMPs MoDCs ikke IL-12 p 40/70 sekresjonen; men økt denne befolkningen sterkt IL-6 produksjon (figur 4C-4D). Disse funnene tyder på at de sorterte populasjonene opprettholdt deres immunologiske funksjoner etter isolasjon.

Figure 1
Figur 1: levedyktig celler i fremover mot siden Scatter gate. Musen benmarg ble kultivert i GM-CSF og levedyktighet ble målt ved hjelp av 7-AAD (7-amino-actinomycin D) flekker post-Harvest (PH) og 1, 3 og 5 dager etter høsting. (A) levedyktige cellers ble valgt ved å bruke en gate (levedyktig) som utelot små og svært detaljerte hendelser basert på FSC og SSC. (B) histogrammer for 7-AAD flekker generert fra hendelsene i levedyktig (FSC/SSC) gate. Hendelser positivt for 7-AAD angir cellene gjennomgår apoptose. Pilene angir levedyktig celle gating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: lymfocytter i Ly6C-CD115-befolkningen. Musen benmarg ble kultivert i GM-CSF og lymfocytt markører (CD3, CD145R og NK1.1) ble analysert daglig av flowcytometri. (A) cellen var farget med Ly6C-PE og CD115-APC for å identifisere Ly6C-CD115-celler. Kvadrant gate ble brukt basert på én farge kontroller. Pseudofarger, det vil dot plott generert fra dag 0 (B) CD3, CD45R og NK1.1 uttrykk for Ly6C-CD115-celler ble analysert på dagen av harvest (dag 0) til dag 6. Celletall var normalisert modus bruker en flyt cytometri analyseprogramvare. Pilen viser Ly6C-CD115 - gating. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Kinetics i utviklingen av Ly6C-CD115 + celler etter sortering på ulike dager. (A) musen benmargen ble høstet og kultivert i GM-CSF. Dele 1 x 107 celler ble høstet (B) 3, (C) 5 eller (D) 7 dager etter høsting (PH). De angitte dagene PH, Ly6C-CD115 + celler ble sortert fra blandet kultur (pre sort) og analysert umiddelbart etter slag (PS). Sorterte celler var re kulturperler på GM-CSF, og endringer i Ly6C/CD115 uttrykket ble analysert daglig av flowcytometri. Boksen og pilen viser sortering gate. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: modning og cytokin uttrykk etter TLR stimulering. Celler er sortert i 5 bestander på dag 3 av kultur i GM-CSF. De ble deretter behandlet med en cocktail av PAMPs (LPS, Poly jeg: C og CpG DNA) for 24 h. bety fluorescerende intensitet (MFI) (A) MHC, klasse II og (B) CD86 ble analysert umiddelbart etter sortering (PS) og 24 timer med og uten PAMPs av flow cytometri. Feilfelt representerer standardavviket for 3-5 Repliker eksperimenter. (C) IL - 12 p 40/70 og (D) IL-6 i supernatants fra 3 gruppert prøver ble målt ved cytokin matrise dot blot ELISA etter 24 timer med og uten PAMPs. RLU; Relativt lett enheter. -/ + indikere tilstedeværelse av cellen overflaten merket utpekt befolkningen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Dag 3 Dag 5 Dag 7
Fenotypen Celle type Min Max Min Max Min Max
Ly6C-CD115-CD11c - CMP 3 x 106 4 x 106 5 x 105 1 x 106 I/t I/t
Ly6C + CD115- GMP 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 I/t I/t
Ly6C + CD115 + Mono 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 5 x 105 1 x 106
Ly6C-CD115 + MoMac 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106 3 x 106 4 x 106
Ly6C-CD115-CD11c + MoDC I/t I/t 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106

Tabell 1: Forventet minimum og maksimum antall celler gjenopprettet etter slag per 1 x 107 celler. CMP (felles myeloid progenitor); GMP (granulocytt/macrophage stamfar) Mono (monocytter); MoMac (monocytt-avledet macrophage); MoDC (monocytt-avledet dendrittiske celler); I/t (ikke tilgjengelig); Min (minimum celle avkastning fra 1 x 107 cellene); Max (maksimale kapasitet fra 1 x 107 cellene).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokollen forenkler isolering av GM-CSF-drevet stamfar og forløper celletyper i antall tilstrekkelig for flere typer analyser inkludert biokjemiske analyser, analyser av cellulære funksjoner i vitroeller instillasjon i vivo. Denne metoden representerer en betydelig fordel innen monocytt-avledet dendrittiske celle utvikling, aktiverer pålitelige isolasjon og identifikasjon av celler tidlig i denne veien av utvikling, samt de forskjellige celletyper oftere isolert i tidligere studier.

Tidligere protokoller for isolering av progenitors og forløpere generert fra benmargen i vitro har stolt på CFSE flekker å identifisere proliferativ stamfar celler 17 eller flekker med CD31 og Ly6C som markører av myeloide celler 18 . CFSE flekker protokoll beskrevet av Naik ble utviklet for bruk i generasjon Flt3L-drevet DC progenitors og forløpere 17. Når vi forsøkte denne tilnærmingen i GM-CSF kultur systemet, møtte vi to viktigste spørsmålene. CFSE var noe cytotoksiske å utvikle cellene og var så lyse (selv i celler som er delt) som det gjorde kompensasjon vanskelig. Denne tilnærmingen viste seg for å være uegnet for våre mål av aisolering tidlig celletyper (progenitors), samt celler over utviklingsmessige spekteret, fra svært proliferativ (CMPs/GMPs) til høyt utviklet (MoDC/MoMac). Vi har også prøvd sortering strategien for GM-CSF-drevet celler beskrevet av Leenens gruppe som var basert på CD31 og Ly6C 18. Men fant vi at CD31 var problematisk. Det ble uttrykt på svært lave nivåer (gjør det vanskelig å løse de rene sortering) ved en vanishingly liten undergruppe av celler, og bare veldig tidlig i kultur perioden. Faktisk var CD31 uttrykk ikke synlig siste dag 2 av kultur i GM-CSF 10.

Ly6C, men var et svært nyttig molekyl for å skille celler på ulike stadier av utvikling på grunn av sin forbigående mønster uttrykk 10. Tillegg av CD115 gitt oss nærmere skjelne celler på middels og senere stadier av utviklingen som ikke var mulig med CD31. Vi har også undersøkt andre markører av progenitors som CD34 og CD117 i håp om å isolere stort antall disse tidlige celler 10. Men i motsetning til som rapportert i Flt3L systemet, vi fant at CD34 og CD117 ble også uttrykt på en svært liten gruppe celler og var nesten borte dag 3 av kultur 17. Stikkordmerker stilk cellen kan være nyttig i fremtiden studier imidlertid å skille mellom undergrupper innenfor CMP eller GMP befolkningen.

Det er flere mulige endringer protokollen som kan påvirke avkastningen av ønsket celle populasjoner. Først, brukeren kan velge å bruke en levedyktighet flekk å utelate døde celler. Basert på observasjoner, døde celler i en typisk fremover og siden scatter porten er relativt lav generelt, og utgjør problemer bare i de første dagene av kultur, samtidig med nedgang i avstamning positiv lymfocytter. Men for programmer i hvilken celle tall må være nøyaktig, sikrer en levedyktighet flekk utelukkelse av døde celler.

En andre potensielle endringer er nedbryting av avstamning-positive lymfocytter før kultur. Vi har forsøkt denne tilnærmingen for å løse små befolkningen avstamning positiv celler som ble ofte observert i Ly6C-CD115-celle befolkningen. Den overordnede celle avkastningen var noe lavere dager 5 og 6, og renheten var ikke signifikant høyere (data ikke vist). Dermed renheten ikke rettferdiggjøre redusert avkastningen. Likeledes, hvis du planlegger å sortere dag 5 eller senere, hyppigheten av lymfocytter i kulturen er godt under 1% og må ikke presentere et problem.

Til slutt, fordi denne strategien er utformet for å isolere celler over et stort utviklingsmessige spekter brukeren bør skreddersy tidspunktet for deres slag å samle så mange av de ønskede populasjonene som mulig. Denne sortering strategien gir trofast i celletyper angitt uansett dagen for kultur som cellene er sortert. For eksempel celler med fenotypen Ly6C + CD115-CD11c-er tro mot den GMP fenotypen og funksjon tilsvarende om de sorteres og isolert dag 3 eller 5 kultur. Hyppigheten av disse cellene er imidlertid mye større dag 3 enn 5, så hvis målet er isolering av denne celle type, sortering på dag 3 vil bli anbefalt. Det er også kjent at celler sortert på dag 3 utviklingen gjennom de påfølgende utviklingsstadier med tregere kinetics enn hvis de var sortert på dag 5 eller 7 (Figur 3).

Denne metoden gir den klare avmerkingen og isolasjon av 5-6 forskjellige befolkningsgrupper langs utviklingsmessige spekteret, finnes det trolig mange flere populasjoner eller overgangsreglene stadier langs denne veien. Innenfor hver av de fem beskrevne befolkningene kan det være flere Sub-populasjoner litt ulike trinn på utvikling. For eksempel har vi observert "tydelig" populasjoner med nivåene av CD115 og Ly6C som gjennomgår litt forskjellige mønstre av utvikling, i form av hvor mange moMac og moDC er generert (data ikke vist). Også er det sannsynlig at bestander tidligere observert i vivo finnes i kultur og sortering system, men disse har vært vanskelig å identifisere på grunn av deres svært lav frekvens. Populasjoner som cMOP 19, MDP 20eller CDP 21 er sannsynlig dag, men kan være skjult innenfor den større befolkningen. Fremtidige studier vil være nødvendig for videre avklare de mange utviklingsstadier som kan isoleres innenfor denne sortering rammen med tillegg av bestemte markører for differensiering. Verdien av denne sortering strategien er at det tillater konsekvent isolering av store antall developmentally forskjellige stadier i DC ontogeny.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen konflikter avsløre.

Acknowledgments

Vi er takknemlige for teknisk assistanse fra Alison kirken fugl på Auburn University skolen av Veterinary medisin Flow cytometri anlegget, om finansiering fra NIH EHS R15 R15 AI107773 og Cellular og molekylærbiologi programmet ved Auburn University for sommeren forskningsmidler til PBR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HBSS buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60 mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50 mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10 mL Syringe BD Biosciences 301604
23 G needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 138 dendrittiske celle utvikling GM-SCF vanlig myelogen stamfar granulocytt-macrophage stamfar Monocyte monocytt-avledet dendrittiske celler monocytt-avledet macrophage høyhastighets celle sortering
Generasjon av stort antall myelogen Progenitors og dendrittiske celle forløpere fra Murine benmarg bruker en roman celle sortering strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, P. B., Schwartz, E. H.… More

Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter