Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57365
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Auburn University

Summary

כאן אנו מספקים שיטה לזיהוי ובידוד מספר גדול של GM-CSF מונע התאים מיאלואידית באמצעות מיון תא במהירות גבוהה. ניתן לזהות חמש אוכלוסיות נפרדות (אבות מיאלואידית נפוצות גרנולוציט/מקרופאג אבות, ומונוציטים, נגזר מונוציט מקרופאגים, נגזר מונוציט DCs) מבוסס על הביטוי Ly6C ו- CD115.

Abstract

תרבויות נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC) המופקים מח עצם העכבר באמצעות גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) הוכרו לאחרונה להיות הטרוגניות יותר מאשר בעבר מוערך. תרבויות אלה מכילים באופן שגרתי moDC גם נגזר מונוציט מקרופאגים (moMac), ואפילו כמה תאים פחות מפותחת כמו ומונוציטים. המטרה של פרוטוקול זה נועד לספק שיטה עקבית עבור זיהוי והפרדה של סוגי תאים רבים נוכח בתרבויות אלו כפי שהם מפתחים, כך הפונקציות הספציפיות שלהם עשויים ייחקר בהמשך. האסטרטגיה מיון המוצגים כאן מפריד תאים תחילה לתוך ארבע אוכלוסיות בהתבסס על הביטוי של Ly6C ו CD115, אשר שניהם באים לידי ביטוי transiently על ידי תאים כפי שהם מפתחים בתרבות מונחה-GM-CSF. אוכלוסיות אלה ארבעה כוללות אבות מיאלואידית נפוצות או CMP (Ly6C-, CD115-.), אבות גרנולוציט/מקרופאג או GMP (Ly6C +, CD115-.), ומונוציטים (Ly6C +, CD115 +), ו מקרופאגים נגזר מונוציט או moMac (Ly6C-, CD115 +.). CD11c נוספה גם אסטרטגיית המיון כדי להבחין בין שתי האוכלוסיות בתוך ה Ly6C-, CD115-האוכלוסייה: CMP (CD11c-), moDC (CD11c +). לבסוף, שתי האוכלוסיות עשויים להבחין נוסף בתוך ה Ly6C-, CD115 + אוכלוסייה בהתבסס על הרמה של מחלקה MHC II הביטוי. MoMacs אקספרס רמות נמוכות יותר של מחלקה MHC II, בעוד הקדמה DC נגזר מונוציט (moDP) מבטא גבוה יותר מחלקה MHC II. שיטה זו מאפשרת בידוד אמין מספר אוכלוסיות שונות מבחינת במספרים מספיק עבור מגוון רחב של ניתוחים פונקציונליים וההתפתחותי. אנחנו מדגישים אחד כזה פונקציונלי את המחוון דיפרנציאלית התגובות אחד מסוגי התאים גירוי עם דפוסים מולקולרית של Pathogen-Associated (PAMPs).

Introduction

Culturing תאי מח עצם מאתר עם ציטוקינים גרנולוציט-מקרופאג המושבה מגרה פקטור (GM-CSF) נעשה שימוש נרחב ככל שיטה לייצר נגזר מונוציט תאים דנדריטים (moDC; ידוע גם בשם DC דלקתיות) מספרים גדולים 1, 2,3,4,5. תאים אלה היה שימושי ביותר במגוון רחב של מחקרים של תא דנדריטי (DC) פונקציה 6,7,8. בדרך כלל, אלו תאים במח העצם מאתר בתרבית למשך 6-8 ימים הינם ואז משמשים למחקר של הפונקציה תא דנדריטי 5. תרבויות אלה היו מזמן נחשב בעיקר הומוגנית, המורכב רוב moDC הבדיל. לאחרונה, כבר ברור כי בסוף תקופה זו תרבות 6-8 יום, ישנם רבים אכן moDC, כמו גם משנה גדולה מתוך הבדיל נגזר מונוציט מקרופאגים (moMacs) 9,10,11. מחקרים שלנו עוד יותר הרחיבו ממצאים אלה מדגימים כי קבוצות אחרות משנה של תאים פחות מפותח, כמו סימנים מקדימים moDC (moDP) ומונוציטים, יישארו בתרבויות בתדר נמוך גם לאחר 7 ימים 10. לכן, מחקרים של תאים דנדריטים (DC) פונקציה באמצעות תאים שנוצרו על-ידי מערכת זו יכול לשקף את התגובות של קבוצה רחבה יותר של סוגי תאים מאשר בעבר מוערך.

למדנו הרבה מאוד מן המחקר של GM-CSF-שנוצר moDC הנוגעים הפונקציה של תאים אלה בשלבים האחרונים של בידול 12,13,14. עם זאת, אנו מבינים באופן משמעותי פחות על מסלול התפתחותי אלה תאים15, 2,16 , של איך ומתי הם מציגים ספציפי פונקציות כגון: היענות הפתוגן הקשורים מולקולרית דפוסי (PAMPs), phagocytosis, עיבוד והצגת אנטיגן 13ועל פעילות אנטי בקטריאלי. פרוטוקול עבור בידוד של מספרים גדולים של אבות DC מבוססת Flt3L המקובלת, מבשרי כבר דווח על 17. בידוד של אוכלוסיות שונות אלה הושג באמצעות אסתר succinimidyl carboxyfluorescein (CFSE)-צבעונית תאים במח העצם (כדי לעקוב אחר תאים החלוקה) ותרבות Flt3L במשך 3 ימים. התאים היו אז דלה של תאים חיובית linage, מתמיינים קדמון לאוכלוסייה קודמן בהתבסס על הביטוי CD11c 17. גישה אחרת על ידי הקבוצה של Leenen כדי לזהות מוקדם המוצא לאגס התרבותי DC בתרבות מונחה-GM-CSF היה כדי למיין התאים בהתאם CD31 ו- Ly6C 18. המטרה הראשונית היתה ליצור שיטה דומה עבור קבלת אבות סימנים מקדימים של moDC מונחה-GM-CSF. בשל סוגי תאים מסוים שנוצר על ידי GM-CSF, שינינו את הגישה ומיון אסטרטגיה המבוססת על הביטוי של מולקולות שבאו לידי ביטוי מוקדם ומאוחר יותר שלבי ההתפתחות. בסופו של דבר קבענו את זה Ly6C, CD115 (קולטן CSF-1), CD11c היו הסמנים הטוב ביותר עבור הבחנה תא אלו סוגי 10.

כאן, אנו מציגים שיטה עבור בידוד של תאים-מספר שלבים של פיתוח לאורך מסלול של בידול מונע על ידי GM-CSF: נפוץ מיאלואידית קדמון (CMP), גרנולוציט-מקרופאג קדמון (GMP), מונוציט, נגזר מונוציט מקרופאג (MoMac), נגזר מונוציט DC (MoDC). האוכלוסייה moMac יכול להיות עוד יותר הפרדה המבוססת על רמה של מחלקה MHC II ביטוי, חשיפת האוכלוסייה (moDP) קודמן 10moDC. אנו מנצלים במהירות גבוהה תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) אסטרטגיה כדי לבודד אוכלוסיות אלה 5 מבוסס על הביטוי של Ly6C, CD115 ו- CD11c. ואז נדגים את הבדיקה של תאים אלה במבחני פונקציונלי חושף את התגובות שלהם PAMP גירוי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי אובורן אוניברסיטת אכפת חיה מוסדיים ועל שימוש הוועדה בהתאם להמלצות המפורטות במדריך על טיפוח ועל שימוש של חיות מעבדה של מכוני הבריאות הלאומיים.

1. הכנה איסוף מוח עצם.

  1. להכין 250 מ ל מדיה מלאה על-ידי הוספת פתרון של רוזוול פארק אנדרטת המכון (RPMI) 1640 בינוני עם סרום עגל עוברית 10%, 2 מ מ גלוטמין ו 50 מיקרומטר מרקפטואתנול לחלק העליון של יחידת 0.22 של הבקבוק מסנן ואקום מיקרומטר, ולהחיל על ואקום.
    הערה: בינוני מלא ניתן לאחסן ב 4 ° C עד 2 חודשים.
  2. הכן 70% אתנול פתרון על ידי ערבוב 350 מ ל 100% אתנול עם 150 מ סטרילי H2O בבקבוקון 500 מ"ל.
  3. צנטריפוגה set כדי 4 ° C.
  4. לחטא מלקחיים, אזמל, מספריים ב-70% אתנול.
  5. באמצעות פיפטה סרולוגית, הוסף 5 מ של מדיה מלאה שלוש צלחות פטרי 60 מ מ.
  6. שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 30 מ של התקשורת מלאה צינור חרוטי 50 מ.

2. אוסף של תאים במח העצם מאתר

  1. המתת חסד עכבר C57BL/6 על ידי הרדמה2 CO לפי הכללים שנקבעו על-ידי המנחים אמריקאי וטרינרי רפואי האגודה (AVMA) 2013 על המתת חסד.
  2. להסיר, להסיר את הרגליים האחוריות.
    1. להרוות את הרגליים האחוריות ואת הגוף עם 75% אתנול, ולבצע חתכים דרך העור סביב מפרק הירך עם מספריים רקמה מעוקל. באמצעות מלקחיים, בחוזקה לנתץ את העור מן הירך לכיוון הקרסול, חשיפת השריר. להשתמש במספריים כדי להסיר את תוספת העור.
    2. הסר את כל הרגל על ידי חיתוך דרך העצם מעל מפרק הירך/הירך.
      הערה: בנוסף חיטוי האזור, האתנול לסייע במתן חתכים נקיים, למנוע זיהום הדגימות שיער.
    3. אם הרגליים יועברו למיקום חדש עבור מח עצם קציר, להטביע את הרגליים בתקשורת מלאה.
  3. עובד אבטחה סטרילי ארון, להעביר את הרגליים לאחת המנות המוכנות בעבר פטרי.
  4. להשתמש במספריים לחתוך הצדיק מתחת לקרסול, ובזהירות להסיר כמה של רקמת חיבור שרירים ו אלסטית ככל האפשר. להעביר את העצם נקי הפטרי מוכן השני.
    הערה: למרות שזה לא הכרחי להסיר את כל השרירים, מדי רקמות הנותרים יכולים להקשות. להוריד את מח העצם.
  5. הפרד את עצם הירך, הברך, שוקה.
    1. באמצעות מלקחיים, החזק את הרגל בברך ואתר את מח העצם.
      הערה: מח עצם צריך להיות גלוי כמו קו אדום חלש בפנים חלל העצם בחלק העליון של עצם הירך, לקראת סוף עצם השוקה.
      1. בעזרת מספריים, לבצע שלושה חתכים כדלקמן.
        1. חותכים בשוקיים מעל בה מח העצם מופיע כדי לסיים.
        2. לחתוך מתחת הברך.
        3. לחתוך קצת מעל הברך.
        4. אם עדיין מקושר מפרק הירך עצם הירך, לחתוך מתחת מפרק הירך.
      2. להחזיר הרסיסים שלושה הפטרי וחזור על התהליך הזה על הרגל השנייה.
  6. ריקון מח עצם הירך, שוקה.
    1. ממלאים מזרק 10 מ"ל עם מדיה להשלים צינור חרוטי 50 מ ל, ואת המחט 23 גרם.
    2. מחזיק את העצם עם מלקחיים מעל הפטרי השלישי מוכן, להוסיף את המחט לתוך התעלה עצם ודחף מדיה דרך, לשטוף החוצה את התאים (אשר עשויות להתגלות ללא פגע "הכנס" או כמו מספר אשכולות). חזור עד אין יותר צבע ניתן לראות דרך העצם. מילוי מחדש את המזרק עם המדיה לפי הצורך.
  7. למחוץ את epiphyses.
    1. אמנם עדיין בצלוחית הפטרי השני, להחזיק את הכובע הברך בחוזקה עם מלקחיים, מועכים את הברכיים עם קצה המזרק. ממשיכים עד epiphyses כבר לא אדום.
  8. באמצעות המזרק, להעביר את התאים השני והשלישי הפטרי הצינור 50 מ. הפרידה את הגושים על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה. לא לנסות ליצור בועות. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  9. Lyse כדוריות דם אדומות
    1. להסיר את תגובת שיקוע עם פיפטה סרולוגית, לסלק צניפה על ידי מצליף, ואת lyse כדוריות דם אדומות על ידי המקננת ב 1 מ"ל ACK (אמוניום כלוריד-אשלגן) פירוק מאגר עבור 1 דקות בטמפרטורת החדר.
    2. בעזרת פיפטה סרולוגית, להוסיף 40 מ של מאגר HBSS (הנקס מאוזנת תמיסת מלח).
  10. שימוש של פיפטה סרולוגית, לסנן את התאים למרות מסננת תא מיקרומטר 70 לתוך צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  11. באמצעות פיפטה סרולוגית, להסיר תאים supernatant, תשטוף עם 40 מ"ל של התקשורת מלאה. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    הערה: בשלב זה, שושלת היוחסין לימפוציטים חיובי ניתן להסיר באמצעות FACS או עמודה מגנטית טיהור. עם זאת, לימפוציטים לא נשמרות לטווח ארוך בתרבות. למרות מספר רב של תאים חיוביים שושלת היוחסין נמצאים ב- Ly6C-CD115-האוכלוסייה מח העצם ex-vivo, כמעט כולם נעדרים ביום 5 (איור 2).
  12. באמצעות פיפטה סרולוגית, הסר את תגובת שיקוע ולאחר התרבות התאים במח העצם בתקשורת מלאה עם 10 ננוגרם למ"ל של העכבר רקומביננטי GM-CSF-צפיפות של עונה 1 פרק 106 תאים/מ ל....
    הערה: בדרך כלל, 4 x 107 תאים הכולל ניתן לקצור לאחר פירוק תאי הדם האדומים. עם זאת, לצפות רק 2 x 107 למתחילים עד 5 x 107 תאים עבור תבואות מנוסים.
  13. באמצעות פיפטה סרולוגית, להעביר את התאים תרביות רקמה צלחות, דגירה ב 37 ° C 5% CO2. אם באמצעות צלחת 24-ובכן, זרע אחד עם 2 מ"ל של התא השעיה.
  14. כל 48 שעות, להשתמש פיפטה סרולוגית להסיר חצי של המדיה ולהחליף עם מדיה שלם טרי ו- GM-CSF.
    הערה: תרבויות יכולה להישאר ערה עד 9 ימים. עם זאת, הרכב משתנה לאורך זמן. לקבלת מידע נוסף, ראה סעיף 3.

3. בחירת יום מיון

  1. כאשר תא האוכלוסייה יצירות להשתנות לאורך זמן, בחר ביום המניבה את המספר הגבוה ביותר של התאים הרצויים.
  2. עיין בטבלה 1 עבור המיון פוסט התשואה הצפויה תא לכל אחת האוכלוסיות לאחר 3, 5 ו- 7 ימים של התרבות ב- GM-CSF לכל עונה 1 פרק 107 תאים.

4. צביעת אסטרטגיה

  1. השתמש aliquots קטן של תאים כדי להכין דגימות הבקרה. כוללות פקד וללא רבב, דגימות הבקרה פיצוי מוכתם רק פלורסנט סוג נוגדן אחד כל אחת, ושולט זריחה-מינוס-אחד באילו נוגדנים כל נוספים. חוץ מאחד, כדי לשלוט על ידי קרינה פלואורסצנטית שאינם ספציפיים בערוץ זה. אם באמצעות תיוג עקיפה, כולל ראשי משני לבד, לבד, ואת שניהם ראשיים ומשניים.
    הערה: Phycoerythrin (PE) allophycocyanin (APC) מתויג נוגדנים לספק הפרדה ברורה עם דימום מינימלי מעל בעת השימוש בהן ביחד. עם זאת, אם fluorochrome האפשרויות מוגבלות, CD115 מתבטא ברמה נמוכה יחסית, בעוד Ly6C מתבטא ברמות גבוהות מאוד. לכן, fluorochromes בהיר רצוי עבור אנטי-CD115, fluorochromes אנטי-Ly6C הם נבחרו כדי למנוע דימום.
  2. הכן 100 מ של מאגר שטיפת FACS (FWB) על ידי ערבוב 97 מ ל תמיסת פוספט buffered צוננת של Dulbecco (DPBS) עם 3 מ"ל של עגל עוברית נסיוב צינור חרוטי 50 מ ל, ולמקם באמבט קרח.
  3. להשתמש על פיפטה פיפטה בעדינות, אך ביסודיות, תאים למעלה ולמטה כדי לסלק תאים חסיד באופן רופף.
  4. שימוש של פיפטה סרולוגית, העברת תאים צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    1. אם נפח התאים עולה 50 מ ל, להעביר המספר הדרוש של צינורות תאים ומשלבים בשלב מוכתמים.
  5. בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה.
    הערה: אם מוות תאים גבוה צפוי, תאים יכולים להישטף עם FWB עם המתחילים 0.5% עגל עוברית סרום (FCS). פעולה זו תמנע תא הצליעה.
  6. להשעות, כתם תאים לפי הוראות היצרן נוגדן.
    1. להשעות 5 x 107 תאים 1 מ"ל של FWB ולהוסיף 2 µg כל של אנטי-Ly6C, אנטי-CD115 המסומנת את fluorophores (של הבחירה של החוקר). לבידול נוסף CMP moDC (שתיהן Ly6C - ו CD115-), להוסיף 2 µg של נוגדנים אנטי-CD11c (CMP הם CD11c–; moDC הם CD11c+). תקופת דגירה של 30 דקות על קרח.
      הערה: איור 3 נוצר באמצעות Ly6C-PE ו- CD115-APC.
  7. שימוש של פיפטה סרולוגית, להוסיף 10 מ ל FWB, צנטריפוגה x 250 g ב- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
  8. בעדינות יוצקים את תגובת שיקוע, לשטוף את התאים pelleted על-ידי הוספת 30 מ של FWB עם פיפטה סרולוגית. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות וחזור בכביסה.
  9. לפני השעיית תאים, קפיצי צינור ביסודיות כדי לסלק את גלולה. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להשהות את תאי-עונה 1 פרק 107 תאים למ"ל של FWB, לסנן דרך מסנן תא 35-מיקרומטר. השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר תאים מסוננים לתוך צינור פוליפרופילן, ומניחים על הקרח עד מוכנים למיון.
    הערה: אם פוליפרופילן אינו זמין, צינורות פוליסטירן חלבון מצופה (ללא שומן חלב יבש או FCS) יכול לשמש כדי להפחית את הכריכה.

5. הגדרת שערים בהתבסס על דגימות הבקרה

הערה: כדי למנוע לשבירת תאים עקב הלחץ של הנחל זרימה מהיר, השתמש זרבובית מיקרומטר 100-130 למיון התא.

  1. להפעיל את פקד וללא רבב (ראה שלב 4.1) דרך סדרן התא, ולהחיל שער כדי לא לכלול את הריסות (פיזור קדמי נמוך; FSC) וגרגרים מאוד (פיזור גבוהים יחסית; חלקיקי האס).
    1. כדי לנתח רק בשלבים מאוחרים יותר (monocytes, moMac/MoDP ו- MoDC), החל gating רק לכלול תאים גדול יותר (FSC גבוהה).
    2. אם נעשה שימוש הכדאיות כתמים, השתמש ברשימות אלה כדי לא לכלול מוכתם, כלכלית אירועים (דוגמה מודגם באיור1).
  2. להריץ את דגימות הבקרה ניאון יחיד סדרן התא, והתאם פיצוי לפי הצורך.
  3. הפעל מדגם של המדגם התווית על-ידי ריבוי. להתבונן ארבע אוכלוסיות נפרדות: Ly6C + CD115-(Gmp), Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), ו- Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). החל שער כדי לבודד כל אחת מארבע הגדולות.
    הערה: CMPs ו- moDC לשתף את Ly6C-CD115-פנוטיפ. עם זאת, הם ניתן להבחין בהתבסס על הביטוי CD11c: CMP חוסר CD11c, ואילו MoDCs אקספרס CD11c.

6. אוסף של אוכלוסיות מבודדות

  1. להכין אוסף טורפדו על ידי הוספת FCS מספיק כדי להשיג לפחות 20% ריכוז סופי כשהם מתמלאים. לדוגמה, אם משתמש מ ל צינורות, להוסיף 1 מ"ל של FCS לפני מיון, להסיר את הצינור, כאשר הוא מגיע הנפח הכולל 5 מ.
  2. למניעת ספיגת מחזור ונוגדן ממברנה, שמור כל דוגמאות (מעורבב וממוינות) ב 4 ° C במהלך המיון.
    1. אם הדבר אינו אפשרי, לשמור על הצינור המכילות את התאים ניתן למיין על הקרח ככל האפשר ולהעביר aliquots בסדרן כנדרש.
    2. בנוסף, העברת ממוין דגימות קרח כל 20-30 דקות.
  3. לאחר שנאסף מספר התאים הרצוי, השתמש פיפטה סרולוגית כדי להעביר את התאים צינור חרוטי. צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    1. לאשר טוהר עם מיון שלאחר ניתוח על aliquots קטן מתוך כל אוכלוסיה שנאספו.
  4. הסר את תגובת שיקוע, להשעות ב 10 מ"ל של FWB, צנטריפוגה ב x 250 g ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות חוזר עבור סכום של שני מנקי.
    הערה: זה יכול להיות קשה להסיר את כל תגובת שיקוע ללא הם מוציאים בגדר. הצמדת טיפ פיפטה קו ואקום יכול לעזור עם הסרת. אם זו אינה זמינה, הוא הציע תגובת שיקוע ייאספו בשפופרת טריים במקרה של דיסוציאציה גלולה.
  5. הסר את תגובת שיקוע לאחר לשטוף את השני.
  6. אם עיצוב ניסיוני של המשתמש מכתיבה התאים להיות תרבותי מחדש, בצע את השלבים 2.12 – 2.14. אחרת, אם תאים ישמש לצורך בדיקה באופן מיידי, להכין תאים לפי הנוהל הרצוי.
    הערה: דוגמה אופיינית אנליזה פונקציונלית נכללת באיור 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

במאמץ לשמור על כמה שיותר ערוצים זמינים עבור ניתוח כתאי אפשרי, קיימא באופן שגרתי נבחרו על סמך פיזור קדימה ואת הצד, למעט אירועים קטנים מאוד, מאוד ממוקדת (שער טיפוסי מוחל על כל הנקודה מגרשים ב איור 1A). כדי לקבוע אם אסטרטגיה זו חסימה באופן אמין שלא ייכללו תאים מתים, אנחנו מוכתמים ואקטינומיצין 7-אמינו D (7-מ) (איור 1B). 7AAD כתמי DNA בתאים במתים בשל חדירות הממברנה, ו הוא נשלל על ידי התאים קיימא. הכדאיות של GM-CSF מח עצם בתרבית תאים נותחו מיד לאחר הקציר (PH) ותא תואר 1, 3 ו- 5 ניתח באופן מיידי PH היה כ- 10% של תאים חיוביים 7-מ כאשר שער FSC/האס טיפוסי היה המוחלים על תאים מבודדים טריים מן העצם מח (איור 1, שלאחר הקציר). שיעור דומה של תאים מתים היה גם נוכח ביום 1 (~ 12%) וביום 3 (~ 11%) של תרבות (איור 1, יום 1 PH ו- 3 ימים PH). ביום 5, צומצם מספר תאים מתים בתוך השער ~ 5% (איור 1, 5 ימים PH). לפיכך, שימוש כזה שער הכדאיות מתאימה בדרך כלל עבור מיון ביום 5 ואחרי. לכן, אם משתמשים מוגבלים בפרמטרים הזמינות שלהם, FSC/האס gating מתאימה בדרך כלל. עם זאת, עבור מבחני רגיש יותר (במיוחד אם הם מסתמכים על מספרי הטלפון הנייד מדויק), לשלב כתם הכדאיות (הצעה).

פרוטוקולים רבים על התפשטות של תאים דנדריטים ממליצים דלדול של שושלת היוחסין תאים חיוביים, בעיקר לימפוציטים, ממח העצם לפני תרבות 11,17. הליך זה נחשב כדי להגדיל את הטוהר של התאים החלים על בידול GM-CSF-מתווכת. בדרך כלל, תאים המבטאים סמנים של תאי T (CD3), B תאים (CD45R או CD19), תאי NK (NK1.1) עשוי להיות מרוקנים לפי בחירה חיובי באמצעות beads מגנטי או התא מיון 11,17,18. עם זאת, בהתבסס על מערכת culturing, לימפוציטים היו רחוקות התאושש או זוהה אלה מבחני. לפיכך, אנו ביקשו להעריך את תוחלת החיים של לימפוציטים בהשתתפות Ly6C-CD115-האוכלוסייה בין התאים מונחה-GM-CSF (איור 2 א). GM-CSF תרבותי מח עצם תאים (כי לא היו שושלת דלה), היו מוכתמים נוגדנים CD3, CD45R ו- NK1.1 (ב fluorophore זהה), מדי יום נמדדת cytometry זרימה (איור 2B). בתוך Ly6C-CD115-האוכלוסייה, תאים חיוביים CD3/CD45R שהתמידו בחוזקה דרך ימים 0 – 3 (איור 2B). ביום הרביעי, נשארו רק כמה CD3/CD45R חיובי תאים, עד היום 5 ו- 6, היו לא CD3/CD45R לבטא כדוריות. לפיכך, תוך 4 ימים של התרבות ב- GM-CSF, התאים חיובי שושלת היוחסין נעדרו בעיקרו של דבר, לא אותרו כל יום 5 ו-6 של תרבות.

ההרכב של התרבות תאים מונחה-GM-CSF משתנה מדי יום בבמערכת זו התאים ולפיתוח להבדיל (טבלה 1; איור 3). בנקודות זמן מוקדם, התאים הנפוץ ביותר אבות הינם סימנים מקדימים, ב מאוחר יותר פעמים רוב התאים יותר הבדיל 10. כדי לקבוע כיצד מיון בימים שונים של תרבות עשוי להשפיע על הנתיב התפתחותית עוקבות או קינטיקה, מיני בוצעו 3, 5 ו- 7 ימים PH (איור 3 א). התפתחות האוכלוסייה MoMac (Ly6C-CD115 +) ואז היה במעקב במשך 2 – 3 ימים נוספים בתרבות (איור 3B-3D).

בעת מיון 3 ימים PH, רק 40% Ly6C-CD115 + תאים ירדה CD115 ביטוי בתוך 24 שעות לאחר מיון (PS) (איור 3B). מאת 48 h PS, השבר זה היה למטה מוסדר CD115 היה 66%, והיה מאת 72 h, 70% של התאים זה פנוטיפ. היצירה פנוטיפי נשמר (~ 70-72% Ly6C - CD115-) גם לאחר עוד ימים של תרבות (נתונים לא מוצג). בעת מיון 5 ימים PH, ~ 75% של התאים היו Ly6C - CD115-, עובר במהירות למטה מוסדר CD115 בתוך 24 שעות PS, ~ 80% היו CD115 - אחרי 48 שעות בלבד. הפצה זו נשמר לאחר 72 h (איור 3C). לבסוף, כאשר הן ממוינות 7 ימים PH, למטה-רגולציה של CD115 היה גם די מהירה. בתוך 24 שעות PS, ~ 75% של תאים הייתה ביטוי CD115 ולמטה מוסדר, מגמה זו נשמר לאחר 48 שעות (דמות תלת-ממד). מעניין, כאשר מיון ביום 7, הרמה הכללית של הביטוי CD115 היה נמוך על התאים בתוך האוכלוסיה CD115 +.

לפיכך, ממצאים אלה מציינים כי קינטיקה של פיתוח הם איטיים יותר במידה מסוימת בעת מיון-יום מוקדם, כגון יום מיון 3 תאים לעומת ההתפתחות מהירה יותר ובידול נצפתה לאחר מיון ביום 5 או 7. בהתבסס על תוצאות אלו, משתמש מחפש מספר גדול של moDC צריך כנראה מיון ביום 5 או 7.

התגובה ההבשלה של DC היא מבוססת היטב 6,7,12,14. כאשר מטופלים עם מגוון רחב של פתוגן-הקשורים דפוסי מולקולרית (PAMPs), DC ילדותי למעלה-לווסת את הביטוי של MHC מולקולות costimulatory, ציטוקינים פרו-דלקתיים, שיפור שלהם קיבולת תא T-הפעלת 6. עם זאת, זה פחות ברור כאשר התאים המתפתח להשיג את היכולת להגיב גירוי PAMP, איזו תכונה של DC ההבשלה הם עשוי להפגין. כדי לקבוע אשר לאוכלוסיות ממוינים להגיב לגירויים ההבשלה, כל האוכלוסייה טופלה זמן קצר לאחר מיון עם קוקטייל של PAMPs כולל פוליפוני: C, lipopolysaccharides (LPS), ו- DNA CpG לעורר קולטן דמוי-אגרה (TLR) 3 (TLR3), TLR4, TLR9, בהתאמה. התאים היו מטופלים (או לא מטופל) במשך 24 שעות ביממה, ביטוי של CD86 ושל MHCII נמדדה על ידי cytometry זרימה (איור 4A-4B). יתר על כן, ייצור IL-12p 40/70, IL-6 נמדדה ב supernatants על ידי מערך ציטוקין אליסה (איור 4C-4D).

CMPs ו- Gmp הביעו רמות נמוכות מאוד של MHC מחלקה II ו- CD86 מצב unstimulated, ואת אלה ביטוי דפוסי לא השתנה באופן משמעותי עם חשיפה במסיבת הקוקטייל PAMPs (איור 4A , 4B). כמו כן, הביטוי של מחלקה MHC II על ידי ומונוציטים היה גם נמוך ושיניתי קצת עם חשיפה PAMP (איור 4A). עם זאת, הביטוי של CD86 הייתה מתונה על ומונוציטים 24 שעות לאחר מיון, גברה עוד יותר בעקבות גירוי h 24 שעות ביממה. הביטוי הבזליים גבוה יותר של MHC מחלקה II, CD86 MoMacs, MoDCs נצפתה ואת שתי האוכלוסיות הציג של אינדוקציה חזקה של מולקולות אלה על גירוי PAMP. במונחים של MHC class II ביטוי בעקבות גירוי, היה הבדל סטטיסטי בין CMPs, Gmp, ומונוציטים, ואילו MoMacs ואת MoDCs הקים קבוצה ברורים. ובכל זאת, מבחינת הביטוי CD86, התאים CMPs ו- Gmp היו שונים מבחינה סטטיסטית יותר MoMacs ו- MoDCs. עם זאת, ומונוציטים לא היו שונים מאשר MoMacs או MoDCs.

רצינו הבא להעריך את היכולת היחסית של כל אחת חמש לייצר ציטוקינים בתגובה TLR גירוי. לפיכך, אנו לבצע וזמינותו של ציטוקינים על האוכלוסיות ממוינים לאחר תרבות נוכחות או היעדרות של אגוניסט TLR קוקטייל בשימוש מעל. התאים היו תרבותי עם הגירויים במשך 24 שעות, ולאחר מכן נאספו supernatants. הבחנו מעט מאוד IL - 12 p 40/70 או ייצור IL-6 על ידי CMPs על גירוי TLR (איור 4C-4D). האוכלוסייה השנייה, Gmp, היו מסוגלים לייצר IL-12p 40/70 (איור 4C), אך תאים אלה הפיק כמות נמוכה של IL-6 על גירוי על-ידי PAMPs (איור 4D). הרמות הגבוהות ביותר של ייצור ציטוקינים נצפו על האוכלוסיות שלושה האחרונים. ומונוציטים ו MoMacs היה דומה מאוד דפוסי מגניטודות ייצור ציטוקינים. שניהם הגדיל במידה עצומה את IL - 12 p 40/70 והגדילה בצניעות IL-6 הפקה עד גירוי (איור 4C-4D). מעניין, בנוכחות PAMPs MoDCs לא להגביר הפרשת IL-12 p 40/70; עם זאת, אוכלוסייה זו הגדיל במידה עצומה את ייצור IL-6 (איור 4C-4D). ממצאים אלה מצביעים על כי האוכלוסיות ממוינים החזיקו הפונקציות אימונולוגי שלהם אחרי הבידוד.

Figure 1
איור 1: התאים קיימא בתוך קדימה לעומת שער לצד פיזור. מח עצם העכבר היה תרבותי ב- GM-CSF, הכדאיות נמדדה באמצעות 7-מ (7-אמינו-ואקטינומיצין D) צביעת שלאחר הקציר (PH), 1, 3 ו- 5 ימים שלאחר הקציר. התאים קיימא (A) נבחרו על-ידי החלת שער (Viable) אשר הושמט ואירועים קטנים מאוד ממוקדת, בהתבסס על FSC האס. (B) היסטוגרמות של 7-מ מכתים להפיק של אירועים בתוך שער Viable (FSC/האס). אירועים חיוביים עבור 7-מ לציין תאים עוברים אפופטוזיס. חיצים מציינים gating תא בר קיימא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: לימפוציטים בתוך האוכלוסיה Ly6C CD115. מח עצם העכבר היה תרבותי ב- GM-CSF, סמני לימפוציטים (CD3, CD145R ו NK1.1) נותחו מדי יום על ידי cytometry זרימה. (א) תא היו מוכתמים Ly6C-PE ו- CD115-APC לזיהוי תאי-CD115-Ly6C. רביע שער הוחל בהתבסס על פקדי צבע יחיד. מגרש נקודה מדומה שנוצר מיום 0 ביטוי CD3 (B), CD45R, NK1.1 Ly6C-CD115-תאים נותחו ביום הקציר (יום 0) עד ליום 6. תא ספירת היו מנורמל למצב באמצעות תוכנת ניתוח cytometry זרימה. החץ מצביע על Ly6C-CD115 - gating. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: קינטיקה של פיתוח של Ly6C-CD115 + תאים לאחר המיון בימים שונים. (א) העכבר מח קוצרים ותרבותית ב- GM-CSF. Aliquots של תאים7 עונה 1 פרק 10 היו שנקטפו (B) 3, (ג) 5, או (ד) 7 ימים שלאחר הקציר (PH). הימים המצוין PH, Ly6C-CD115 + התאים היו ממוין מתרבות מעורבת (טרום מיון) וניתח מיד לאחר מיון (PS). תאים ממוינים היו בתרבית מחדש ב- GM-CSF, שינויים בביטוי Ly6C/CD115 נותחו מדי יום על ידי cytometry זרימה. תיבת וחץ מצביעים על שער מיון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: התבגרות והביטוי ציטוקין בעקבות גירוי TLR. התאים היו מתמיינים אוכלוסיות 5 ביום השלישי של התרבות ב- GM-CSF. הם טופלו אז עם קוקטייל של PAMPs (LPS, פולי. אני: C, ו- CpG DNA) עבור ה 24 כלומר עוצמת פלורסנט (MFI) (A) MHC class II וניתח CD86 (B) היה מיד לאחר מיון (PS) ו- h 24 שעות ביממה עם ובלי PAMPs מאת flow cytometry. קווי שגיאה לייצג סטיית התקן של ניסויים שכפל 3-5. (ג) IL - 12 p 40/70 ו- IL-6 (ד) ב- supernatants מ 3 דגימות במאגר נמדדו על ידי ציטוקינים מערך נקודה חשופה ELISA לאחר 24 שעות עם ובלי PAMPs. RLU; יחידות קלות יחסית; -/ + את נוכחותם של סמן משטח תאים עבור האוכלוסייה המיועדת. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

יום 3 יום 5 יום 7
גן # מושגים בסיסיים סוג התא Min מקס Min מקס Min מקס
Ly6C-CD115-CD11c - CMP 3 x 106 4 x 106 5 x 105 עונה 1 פרק 106 N/a N/a
Ly6C + CD115- GMP 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 N/a N/a
Ly6C + CD115 + מונו 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 5 x 105 עונה 1 פרק 106
Ly6C-CD115 + MoMac 5 x 105 עונה 1 פרק 106 3 x 106 4 x 106 3 x 106 4 x 106
Ly6C-CD115-CD11c + MoDC N/a N/a 5 x 105 עונה 1 פרק 106 3 x 106 4 x 106

טבלה 1: צפוי את המספר המינימלי והמקסימלי של תאים התאושש לאחר מיון לכל התאים7 עונה 1 פרק 10- CMP (קדמון מיאלואידית משותפת); GMP (גרנולוציט/מקרופאג קדמון) מונו (monocytes); MoMac (נגזר מונוציט מקרופאג); MoDC (נגזר מונוציט תא דנדריטי); N/a (לא זמין); Min (yield התאים המיזערי מחוץ לתאים7 עונה 1 פרק 10); מקס (yield התאים המרבי מחוץ לתאים7 עונה 1 פרק 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

פרוטוקול זה מאפשר בידוד של מונחי-GM-CSF קדמון, קודמן סוגי תאים במספרים מספיק עבור מספר סוגי ניתוחים כולל מבחני הביוכימי, מבחני תפקוד התאים בתוך חוץ גופיתאו החדרה בתוך vivo. שיטה זו מייצגת התקדמות משמעותית בתחום של פיתוח נגזר מונוציט תא דנדריטי, המאפשר את אמין בידוד וזיהוי של תאים בתחילת מסלול זה של התפתחות, כמו גם סוגי תאים הבדיל האלה יותר נפוץ מבודדים במחקרים קודמים.

הפרוטוקולים הקודמים עבור בידוד של אבות ו מבשרי המופקים מח עצם במבחנה צריכים לסמוך על CFSE מכתים לזהות תאים proliferative קדמון 17 או על צביעת עם CD31 ו- Ly6C כסמנים של התאים מיאלואידית 18 . CFSE מכתים פרוטוקול שתואר על ידי Naik תוכנן לשימוש בדור של אבות ו מבשרי DC מבוססת Flt3L 17. כאשר ניסינו גישה זו במערכת התרבות GM-CSF, נתקלנו בשני נושאים עיקריים. CFSE היה ציטוטוקסיות במקצת על התאים המתפתח והיה כל כך בהיר (אפילו בתאים חצויות) שהוא גרם פיצוי קשה. גישה זו הוכיחה להיות מתאימים עבור המטרות שלנו של בידוד סוגי תאים מוקדמת (אבות), כמו גם תאים הקשת התפתחותית, מ מאוד המקדימות (CMPs/Gmp) כדי מפותחת (MoDC/MoMac). ניסינו גם את אסטרטגיית המיון עבור תאים מונחה-GM-CSF, שתואר על ידי הקבוצה של Leenen, אשר היה מבוסס על CD31 ו- Ly6C 18. עם זאת, מצאנו כי CD31 היה בעייתי. זה בא לידי ביטוי ברמות נמוכות מאוד (מה שהופך אותו קשה resolve האוכלוסיות למיון נקי) על ידי תת קבוצה קטנה vanishingly של תאים, ולא רק מוקדם מאוד במהלך תקופת תרבות. למעשה, ביטוי CD31 לא היה לזיהוי אחרי היום 2 של התרבות ב- GM-CSF 10.

Ly6C, לעומת זאת, היה מולקולה מאוד שימושי עבור הפרדת תאים בשלבים שונים של פיתוח בשל דפוס שלו ארעית של הביטוי 10. התוספת של CD115 אפשרה לנו להבחין באופן הדוק יותר תאים ביניים ולאחר מכן שלבי ההתפתחות היתה בלתי אפשרית עם CD31. בדקנו גם סמנים אחרים של אבות CD34 ו CD117 בתקווה לבודד מספר גדול של תאים מוקדמת אלה 10. עם זאת, בניגוד שדיווח במערכת Flt3L, מצאנו כי CD34 ו- CD117 באו לידי ביטוי גם על תת קבוצה קטנה מאוד של תאים, נעדרו כמעט על ידי יום 3 של תרבות 17. סמנים אלה תאי גזע עשוי להיות שימושי ב מחקרים עתידיים עם זאת, כדי להבחין בין קבוצות משנה בתוך האוכלוסיות CMP או GMP.

ישנם מספר פוטנציאלי שינויים בפרוטוקול שעשויים להשפיע על התשואה של אוכלוסיות התאים הרצויים. ראשית, המשתמש עשוי לבחור להחיל כתם הכדאיות כדי לא לכלול תאים מתים. על סמך התצפיות, הקצב של תאים מתים בתוך קדימה טיפוסי עם השער הצדדי פיזור נמוך יחסית באופן כללי, בעייתית רק במהלך הימים הראשונים של תרבות, חופפת ירידות לימפוציטים חיובי השושלת. עם זאת, עבור יישומים בתא שבו מספרים חייב להיות מדויק, כתם הכדאיות תבטיח אי-הכללה של תאים מתים.

שינוי פוטנציאליים השני הוא דלדול של לימפוציטים שושלת היוחסין-חיוביות לפני תרבות. ניסינו בגישה זו כדי לטפל באוכלוסייה קטן של תאים חיוביים שושלת היוחסין כי נצפו באופן קבוע בתוך האוכלוסיה Ly6C-CD115-תא. התשואה הכוללת של תא היה מעט נמוך יותר ימים 5 ו- 6, הטוהר לא היה גבוה משמעותית (נתונים לא מוצג). לפיכך, הטוהר אינו מצדיק את התשואה מופחת. באופן דומה, אם המשתמש מתכננת למיין ביום 5 או לאחר, התדירות של לימפוציטים בתוך התרבות נמצא מתחת 1%, לא צריך להציג את הבעיה.

בסופו של דבר, כי אסטרטגיה זו נועד לבודד תאים על-פני קשת התפתחותי גדול המשתמש צריך להתאים העיתוי של המיון שלהם כדי לאסוף כמה שיותר של אוכלוסיות הרצוי ככל האפשר. אסטרטגיה זו המיון התשואות בנאמנות את סוגי תאים שצוין ללא קשר היום של התרבות שבה התאים מסודרים. לדוגמה, תאים עם פנוטיפ Ly6C + CD115-CD11c-הם נאמנים פנוטיפ GMP ו- function באופן דומה אם הם ממוינים, מבודד ביום 3 או 5 של תרבות. עם זאת, התדירות של תאים אלה גדול בהרבה ביום 3 5, אז אם המטרה היא בידוד מסוג זה התא, מיון ביום 3 להיות מומלץ. זה גם ראוי לציון כי תאים ממוינים לפי יום 3 ההתקדמות בשלבים התפתחותיים הבאים עם קינטיקה איטי יותר מאשר אם הם היו מיון ביום 5 או 7 (איור 3).

אמנם שיטה זו מאפשרת בסימון ברור של בידוד של 5-6 אוכלוסיות שונות לאורך הקשת התפתחותית, ישנם סביר אוכלוסיות רבות יותר או שלבי המעבר לאורך מסלול זה. בתוך כל אחת חמש שתואר ייתכנו מספר אוכלוסיות תת-דרגות שונות במקצת של פיתוח. לדוגמה, הבחנו "ברורים" אוכלוסיות עם רמות בינוניות של CD115 ושל Ly6C אשר עוברים דפוסי שונה במקצת של פיתוח, מבחינת כמה moMac ו moDC הם שנוצר (נתונים לא מוצג). סביר גם כי אוכלוסיות שנצפו בעבר ויוו נמצאים תרבות ובמערכת המיון, אך אלה היה קשה לזהות עקב תדירות נמוכה מאוד שלהם. אוכלוסיות כגון cMOP 19, MDP 20או CDP 21 המתנה סביר, אך ייתכן יהיו מטושטשים בתוך האוכלוסיות גדול יותר. מחקרים עתידיים, יהיה צורך כמוסיף בשלבים התפתחותיים רבים שעשויים להיות מבודד במסגרת המיון עם התוספת של סמנים ספציפי של בידול. הערך של אסטרטגיה זו המיון הוא שהיא מאפשרת עקבי בידוד מספר גדול של אנשים. שלבים במהלך DC ontogeny.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים לך אין קונפליקטים לחשוף.

Acknowledgments

אנחנו אסירי תודה על הסיוע הטכני של אליסון הכנסייה ציפור-אובורן אוניברסיטת בית הספר של רפואה וטרינרית לזרום Cytometry המתקן, עבור מימון NIH EHS R15 R15 AI107773, סלולר וביולוגיה מולקולרית לתוכנית ב אוניברסיטת אובורן במשך הקיץ מחקר מימון PBR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HBSS buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60 mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50 mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10 mL Syringe BD Biosciences 301604
23 G needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 138 תא דנדריטי פיתוח GM-SCF נפוץ מיאלואידית קדמון גרנולוציט-מקרופאג קדמון מונוציט נגזר מונוציט תא דנדריטי נגזר מונוציט macrophage מיון תא במהירות גבוהה
דור מספר גדול של תאים מיאלואידים אבות ו מבשרי תא דנדריטי ממח העצם מאתר באמצעות תא הרומן מיון אסטרטגיה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, P. B., Schwartz, E. H.… More

Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter