Summary
Aqui nós fornecemos um método para identificar e isolar um grande número de GM-CSF dirigido pilhas myeloid usando a classificação de células de alta velocidade. Cinco populações distintas (comuns progenitores mieloides progenitoras granulócitos/macrófagos, monócitos, macrófagos derivados de monócitos e DCs derivados de monócitos) podem ser identificadas com base na expressão Ly6C e CD115.
Abstract
Culturas de derivados de monócitos células dendríticas (moDC) geradas a partir da medula óssea de rato usando colônia Granulócito-macrófago estimulando Factor (GM-CSF) têm sido reconhecidas recentemente para ser mais heterogêneo do que anteriormente apreciado. Essas culturas rotineiramente contêm moDC também derivados de monócitos macrófagos (moMac) e até mesmo alguns menos desenvolvidas células como monócitos. O objetivo do presente protocolo é fornecer um método consistente para identificação e separação dos diversos tipos de célula presentes nestas culturas como desenvolvem, para que suas funções específicas podem ser mais investigadas. A estratégia de classificação apresentada aqui separa células primeiro em quatro populações com base na expressão de Ly6C e CD115, ambos os quais são expressas transitoriamente pelas células desenvolvem-se na cultura de GM-CSF-driven. Essas quatro populações incluem comuns progenitores mieloides ou CMP (Ly6C, CD115), progenitores de granulócitos/macrófagos ou GMP (Ly6C +, CD115-), monócitos (Ly6C +, CD115 +) e macrófagos derivados de monócitos ou moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c também é adicionado para a estratégia de classificação para distinguir duas populações dentro da Ly6C-, CD115-população: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Finalmente, duas populações podem distinguir ainda mais dentro da Ly6C-, CD115 + população com base no nível de classe de MHC expressão II. MoMacs express níveis inferiores de MHC-classe II, enquanto um precursor de DC derivados de monócitos (moDP) expressa a maior classe de MHC II. Este método permite o isolamento confiável de várias populações distintas desenvolvente em números suficiente para uma variedade de análises funcionais e do desenvolvimento. Destaca-se uma tal leitura funcional, as diferenciais respostas estes tipos de células a estimulação com Pathogen-Associated padrões moleculares (PAMPs).
Introduction
Cultivo de células de medula murino com a citocina fator de estimular colônia granulócitos-macrófagos (GM-CSF) é amplamente utilizado como um método para gerar células dendríticas derivadas de monócitos (moDC; também conhecido como DC inflamatória) em grande número 1, 2,3,4,5. Estas células têm sido extremamente útil em uma variedade de estudos de células dendríticas (DC) função 6,7,8. Normalmente, estas células de medula murino são cultivadas por 6-8 dias e são então utilizadas para o estudo de células dendríticas função 5. Essas culturas tinham sido consideradas principalmente homogêneas, constituído por uma maioria de moDC diferenciada. Mais recentemente, tornou-se claro que no final deste período de cultura dia 6 – 8, há certamente muitas moDC, bem como um grande subconjunto de macrófagos derivados de monócitos diferenciadas (moMacs) 9,10,11. Nossos próprios estudos estenderam ainda mais estes resultados demonstrando que outros subconjuntos de menos células desenvolvidas, tais como precursores moDC (moDP) e monócitos, permaneçam nas culturas com pouca frequência, mesmo depois de 7 dias 10. Assim, estudos da função de células dendríticas (DC) usando células geradas por este sistema podem refletir as respostas de uma coorte mais ampla de tipos de células que anteriormente apreciado.
Temos aprendido muito com o estudo de GM-CSF-gerado moDC relacionadas com a função destas células em fase final de diferenciação 12,13,14. No entanto, compreendemos significativamente menos sobre o caminho do desenvolvimento destas células, 2,15,16 e de como e quando eles apresentam específicas funções, tais como: capacidade de resposta ao patógeno associado Molecular Padrões (PAMPs), fagocitose, 13, de processamento e apresentação do antígeno e atividade anti-bacteriana. Um protocolo para a isolação de um grande número de progenitores de orientado a Flt3L DC convencionais e precursores tem sido relatado 17. Isolamento dessas populações distintas foi conseguido usando carboxyfluorescein succinimidil éster (CFSE)-manchado de células da medula óssea (para controlar a divisão de células) e cultura em Flt3L por 3 dias. As células foram então depleção de células positivas de linhagem e classificadas em progenitoras e precursor das populações com base na expressão de CD11c 17. Outra abordagem pelo grupo do Leenen para identificar primeiros progenitores de DC na cultura de GM-CSF-driven foi classificar as células com base em CD31 e Ly6C 18. O objetivo inicial era criar um método semelhante para a obtenção de progenitores e precursores de GM-CSF-driven moDC. Devido os tipos de célula específica gerados pelo GM-CSF, adaptamos a abordagem e triagem de estratégia baseada na expressão de moléculas que foram expressas em fases iniciais e posteriores do desenvolvimento. Em última análise, determinámos que Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), e CD11c foram os melhores marcadores para distinguir estas células tipos 10.
Aqui, apresentamos um método para isolamento de células em várias fases distintas de desenvolvimento ao longo da via de diferenciação impulsionada pela GM-CSF: monócito Progenitor mieloide comum (CMP), Granulócito-macrófago Progenitor (GMP), macrófagos derivados de monócitos (MoMac) e monócitos-derivado DC (MoDC). A população de moMac pode ser ainda mais segregada com base no nível de classe de MHC expressão II, revelando um precursor de moDC população (moDP) 10. Nós utilizamos uma célula de alta velocidade de fluorescência-ativado classificação estratégia (FACS) para isolar esses 5 populações com base na expressão de Ly6C, CD115 e CD11c. Em seguida demonstramos o exame dessas células em ensaios funcionais, revelando suas respostas à estimulação PAMP.
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Protocol
Todo o trabalho animal foi aprovado pelo Comitê de uso e Auburn University institucional Cuidado Animal em conformidade com as recomendações descritas no guia para o cuidado e o uso de animais de laboratório do institutos nacionais da saúde.
1. preparação para coleta de medula óssea
- Preparar a mídia completa 250 mL pela adição de uma solução de meio de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com soro fetal bezerro de 10%, glutamina 2 mM e 50 µM 2-Mercaptoetanol ao topo de uma unidade de balão de vácuo filtro µm 0.22 e aplicar vácuo.
Nota: O meio completo pode ser armazenado a 4 ° C por até 2 meses. - Prepare a solução de etanol 70% misturando 350 mL de etanol a 100% com 150 mL estéril H2O em um balão de 500 mL.
- Conjunto de centrifugação a 4 ° C.
- Esterilize pinças, bisturi e tesouras em etanol a 70%.
- Usando uma pipeta sorológica, adicione 5 mL de mídia completa para três pratos de Petri 60mm.
- Usando uma pipeta sorológica, adicione 30 mL de mídia completa para um tubo cónico de 50 mL.
2. conjunto de células de medula murino
- Eutanásia em um rato C57BL/6 por narcose de CO2 em conformidade com as regras estabelecidas pelo 2013 americano veterinária Medical Association (AVMA) orientações sobre a eutanásia.
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Remover e tira as patas traseiras.
- Saturar as patas traseiras e o tronco com 75% de etanol e faça cortes superficiais através da pele ao redor da articulação do quadril com uma tesoura de tecido curvo. Usando a pinça, puxe com firmeza a pele do quadril para baixo em direção ao tornozelo, revelando o músculo. Use a tesoura para remover o retalho de pele.
- Remova a pata traseira inteira cortando o osso logo acima da articulação do fêmur/quadril.
Nota: Além de esterilizar a área, o etanol vai ajudar no fornecimento de cortes limpos e impedir a contaminando as amostras de cabelo. - Se as pernas vão ser transferidas para um novo local para a colheita de medula óssea, mergulhe os pés nos meios de comunicação completos.
- Trabalhando em uma armário de biossegurança estéril, transferi as pernas para um dos pratos de Petri previamente preparado.
- Use a tesoura para cortar a apenas abaixo do tornozelo e cuidadosamente Retire o máximo de tecido conjuntivo muscular e elástico quanto possível. Transferi o osso limpo para o segundo prato de Petri preparado.
Nota: Embora não seja necessário remover todos os músculos, muito tecido restante pode tornar difícil expulsar a medula óssea. -
Separe o fêmur, o joelho e a tíbia.
- Usando fórceps, segure a perna no joelho e localize a medula.
Nota: a medula óssea deve ser visível como uma ténue linha vermelha no interior da cavidade óssea na parte superior do fêmur e da tíbia no final.- Usando a tesoura, fazer três cortes como segue.
- Corte a tíbia logo acima onde a medula aparece acabar.
- Corte logo abaixo da articulação do joelho.
- Corte logo acima da articulação do joelho.
- Se a articulação do quadril ainda está conectada ao fêmur, corte logo abaixo da articulação do quadril.
- Retornar os três fragmentos para o prato de Petri e repita este processo na outra perna.
- Usando a tesoura, fazer três cortes como segue.
- Usando fórceps, segure a perna no joelho e localize a medula.
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Irrigue a medula óssea do fêmur e tíbia.
- Encha uma seringa de 10 mL com mídia completa do tubo cónico de 50 mL e tampa com agulha 23G.
- Segurando o osso com fórceps acima o terceiro prato de Petri preparada, inserir a agulha dentro do canal ósseo e empurre a mídia através de, expulsando as células (que podem surgir como um "plug" intacta ou como vários clusters). Repita até que não mais cor pode ser visto através do osso. Encha a seringa com a mídia, se necessário.
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Esmaga as epífises.
- Enquanto ainda na segunda placa de Petri, segure o joelho com fórceps e amasse os joelhos com a ponta da seringa. Continue até que as epífises não são mais vermelhos.
- Usando a seringa, transferi as células do segundo e terceiro prato de Petri para o tubo de 50 mL. Separação por touceiras suavemente pipetando acima e para baixo. Não tente gerar bolhas. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
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Lisar células vermelhas do sangue
- Remover o sobrenadante com pipeta sorológica, desalojar pelota por agredir e lyse pilhas de sangue vermelhas incubando em 1 mL de tampão de Lise ACK (amónio-cloreto-potássio) por 1 min à temperatura ambiente.
- Usando uma pipeta sorológica, adicione 40 mL de tampão HBSS (Hanks equilibrada solução salina).
- Usando uma pipeta sorológica, filtre as células embora um coador de célula 70 µm para um novo tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
- Usando uma pipeta sorológica, remova o sobrenadante e lavar as células com 40 mL de mídia completa. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
Nota: Nesta fase, linfócitos positivos de linhagem podem ser removidos por FACS ou purificação magnética da coluna. No entanto, linfócitos não são mantidos a longo prazo em cultura. Embora um grande número de células de linhagem positivas está presente na Ly6C-CD115-população em medula óssea ex vivo, quase todos estão ausentes por dia 5 (Figura 2). - Usando uma pipeta sorológica, remover o sobrenadante e cultura de células da medula óssea na mídia completa com 10 ng/mL de recombinação mouse GM-CSF em uma densidade de 1 x 106 células/mL.
Nota: Normalmente, 4 x 107 células total podem ser colhidas após a lise de células vermelhas do sangue. No entanto, esperar que tão pouco como 2 x 107 para iniciantes e até de 5 x 107 células para colheitadeiras experientes. - Usando uma pipeta sorológica, transferir as células para placas de cultura de tecidos e incubar a 37 ° C em 5% CO2. Se usando uma placa de 24, cada semente bem com 2 mL de suspensão de células.
- Todos os 48 h, use uma pipeta sorológica para remover metade dos meios de comunicação e substituir com mídia completa fresca e GM-CSF.
Nota: Culturas podem ser mantidas de 9 dias. No entanto, a composição muda ao longo do tempo. Obter mais informações, consulte a secção 3.
3. escolha o dia de sorte
- Como composições de população celular mudam ao longo do tempo, selecione um dia que produz o maior número de células desejados.
- Consulte a tabela 1 para o tipo de post de rendimento esperado de célula para cada uma das populações depois de 3, 5 e 7 dias de cultura em GM-CSF por 1 x 107 células.
4. estratégia de coloração
- Use pequenas alíquotas de células para preparar amostras de controle. Incluir um controle imaculado, amostras de controlo de compensação manchados com somente um anticorpo fluorescente cada, e fluorescência-menos-um controla no quais todos os anticorpos são adicionados exceto um, para controle de fluorescência específico em que canal. Se usando rotulagem indirecta, incluem primário secundário sozinho, sozinho e tanto primário e secundário.
Nota: Ficoeritrina (PE) e allophycocyanin (APC) com a tag anticorpos fornecem separação distinta com sangramento mínimo sobre de quando usados juntos. No entanto, se o fluorocromo opções são limitadas, CD115 é expresso em um nível relativamente baixo, enquanto Ly6C é expressa em níveis muito elevados. Portanto, fluorochromes mais brilhantes são desejáveis para anti-CD115 e anti-Ly6C fluorochromes são escolhidos para evitar sangramento. - Preparar 100 mL de tampão de lavagem FACS (FWB) misturando 97 mL de solução salina de tampão fosfato de Dulbecco refrigerados (DPBS) com 3 mL de soro de vitela fetal em um tubo cónico de 50 mL e coloque num banho de gelo.
- Use uma pipeta para suavemente, mas completamente, pipetar células acima e para baixo para desalojar qualquer células frouxamente aderentes.
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Usando uma pipeta sorológica, transferi as células para um tubo cónico de 50 mL. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
- Se o volume celular excede 50 mL, transferir células para o número necessário de tubos e combinar no passo coloração.
- Delicadamente decantar o sobrenadante e lavar as células peletizadas adicionando 30ml de FWB com uma pipeta sorológica. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min e repita a lavagem.
Nota: Se a morte celular alta é esperada, as células podem ser lavadas com FWB com tão baixo quanto 0,5% de soro de vitela fetal (FCS). Isso impedirá que a aglutinação de células. -
Suspender e mancha células as instruções do fabricante do anticorpo.
- Suspender a 5 x 107 células em 1 mL de FWB e adicionar 2 µ g cada de anti-Ly6C e anti-CD115 rotulado com o fluorophores (de escolha do pesquisador). Para distinguir CMP moDC (ambos são Ly6C - e CD115-), adicionar 2 µ g de anticorpos anti-CD11c (CMP são CD11c–; moDC são CD11c+). Incube durante 30 min no gelo.
Nota: Figura 3 foi gerado usando o Ly6C-PE e CD115-APC.
- Suspender a 5 x 107 células em 1 mL de FWB e adicionar 2 µ g cada de anti-Ly6C e anti-CD115 rotulado com o fluorophores (de escolha do pesquisador). Para distinguir CMP moDC (ambos são Ly6C - e CD115-), adicionar 2 µ g de anticorpos anti-CD11c (CMP são CD11c–; moDC são CD11c+). Incube durante 30 min no gelo.
- Usando uma pipeta sorológica, adicione 10 mL de FWB e centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
- Delicadamente decantar o sobrenadante e lavar as células peletizadas adicionando 30ml de FWB com uma pipeta sorológica. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min e repita a lavagem.
- Antes de suspender as células, agite o tubo cuidadosamente para desalojar a pelota. Use uma pipeta sorológica para suspender as células em 1 x 107 células/mL de FWB e filtrar através de filtro de célula de 35 µm. Use uma pipeta sorológica para transferir células filtradas em tubo de polipropileno e colocar no gelo até que esteja pronto para classificar.
Nota: Se não estiver disponível no polipropileno, tubos de poliestireno revestido de proteína (leite seco desnatado ou FCS) podem ser usados para reduzir a ligação.
5. definir portas com base em amostras de controlo de
Nota: Para evitar o rompimento da pilha devido à pressão do fluxo de alta velocidade de fluxo, use um 100 – 130 µm bocal para classificação de célula.
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Executar o controle imaculado (consulte a etapa 4.1) através do classificador da pilha e aplicar um portão para excluir pequenos detritos (baixa dispersão para a frente; FSC) e altamente granular (dispersão de lado de alta; Partículas de CCD).
- Para analisar apenas os estagios (monócitos, moMac/MoDP e MoDC), aplica gating para incluir apenas células maiores (FSC alta).
- Se as manchas de viabilidade estão sendo usadas, usá-los para excluir os eventos manchados, inviáveis (um exemplo é ilustrado na Figura 1).
- Executar os exemplos de controle único fluorescente através do classificador da pilha e ajuste a compensação conforme necessário.
- Execute uma amostra da amostra multi-rotulados. Observar quatro populações distintas: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monócitos), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) e Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Aplica um portão para isolar cada uma das quatro grandes populações.
Nota: CMPs e moDC compartilham o Ly6C-CD115-fenótipo. No entanto, eles podem ser diferenciados com base na expressão de CD11c: CMP falta CD11c, Considerando que MoDCs express CD11c.
6. coleção de populações isoladas
- Prepare os tubos para colheita, acrescentando bastante FCS para atingir pelo menos 20% concentração final quando estiver cheia. Por exemplo, se usar tubos de 5 mL, adicionar 1 mL de FCS antes de classificação e remover o tubo quando ele atinge o volume total de 5 mL.
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Para evitar a absorção de volume de negócios e anticorpo de membrana, manter todas as amostras (misturado e classificados) a 4 ° C em todo o tipo.
- Se isto não for possível, mantenha o tubo contendo as células para ser classificado no gelo, tanto quanto possível e transferir alíquotas para o classificador, conforme necessário.
- Além disso, amostras de transferência classificada a cada 20-30 minutos de gelo.
- Depois o número desejado de células foram recolhido, use uma pipeta sorológica para transferir as células para um novo tubo cónico. Centrifugar a 250 x g a 4 ° C por 10 min.
- Confirme a pureza com análise pós-tipo em pequenas alíquotas de cada população coletada.
- Remover o sobrenadante, suspensão em 10 mL de FWB e centrifugar 250 x g a 4 ° C por 10 min. repetir para um total de duas lavagens.
Nota: Pode ser difícil de remover todo o sobrenadante sem desalojar a pelota. Anexar uma ponta da pipeta para uma linha de vácuo pode ajudar com a remoção. Se este não estiver disponível, sugere-se que o sobrenadante ser coletado em um tubo fresco em caso de dissociação da pelota. - Remova o sobrenadante após a segunda lavagem.
- Se o desenho experimental do usuário dita as células re-ser cultivadas, siga os passos 2.12 – 2.14. Caso contrário, se as células serão utilizadas para análise imediata, prepare células de acordo com o protocolo desejado.
Nota: Um exemplo de análise funcional típico é incluído na Figura 4.
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Representative Results
Em um esforço para manter tantos canais disponíveis para análise como células viáveis, possíveis rotineiramente foram selecionados com base na dispersão para a frente e lateral, excluindo eventos muito pequenos e muito granulares (um portão típico é aplicado a todos o ponto parcelas na figura 1A). Para determinar se esta estratégia associada confiantemente excluído as células mortas, nós manchada com o 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (figura 1B). 7AAD manchas de ADN em células de mortos e moribundos devido à permeabilidade da membrana e é excluído por células viáveis. Viabilidade de GM-CSF células cultivadas da medula óssea foi analisado imediatamente após a colheita (PH) e célula de pH 1, 3 e 5 imediatamente analisaram PH tinha cerca de 10% de células positivas 7-AAD quando um portão típico do FSC/SSC foi aplicado a células recém isoladas do osso medula (Figura 1, após a colheita). Uma proporção similar de células mortas também esteve presente no dia 1 (~ 12%) e 3 (~ 11%) da cultura (Figura 1, PH de 1 dia e 3 dias de PH). No dia 5, o número de células mortas dentro do portão foi reduzido para ~ 5% (Figura 1, PH de 5 dias). Assim, usando tal um portão de viabilidade é geralmente apropriado para classificação no dia 5 e depois. Portanto, se os usuários são limitados em seus parâmetros disponíveis, FSC/SSC gating é geralmente apropriado. No entanto, para ensaios mais sensíveis (particularmente se eles contam com celulares precisos), incorporar uma mancha de viabilidade (sugestão).
Muitos protocolos de propagação de células dendríticas recomendam depleção de células positivas de linhagem, especialmente linfócitos, da medula óssea antes da cultura 11,17. Este procedimento é pensado para aumentar a pureza das células recuperados mediante diferenciação de GM-CSF-mediada. Normalmente, as células expressando marcadores de células T (CD3), B células (CD45R ou CD19) e células NK (NK1.1) podem ser empobrecidas pela selecção positiva usando esferas magnéticas ou célula classificação 11,17,18. No entanto, com base no sistema de cultivo, linfócitos foram raramente valorizados ou detectados nestes ensaios. Assim, procuramos avaliar a longevidade dos linfócitos mantido na Ly6C-CD115-população entre as células de GM-CSF-driven (Figura 2A). GM-CSF culta da medula óssea, células (que não tinham sido linhagem esgotada) foram coradas com anticorpos CD3, CD45R e NK1.1 (no mesmo fluoróforo) e medidos diariamente por citometria de fluxo (Figura 2B). Dentro da Ly6C-CD115-população, CD3/CD45R células positivas persistiram fortemente através de dias 0-3 (Figura 2B). No dia 4, permaneceram apenas alguns CD3/CD45R células positivas e por dia 5 e 6, não havia nenhum CD3/CD45R expressando células presentes. Assim, dentro de 4 dias de cultura em GM-CSF, células de linhagem positivas foram essencialmente ausentes e não foram detectadas em todos os dias 5 e 6 da cultura.
A composição da cultura de pilha de GM-CSF-driven muda diariamente neste sistema como as células se desenvolvem e diferenciam (tabela 1; A Figura 3). Primeiros pontos de tempo, as células mais abundantes são progenitores e precursores e no mais tarde vezes a maioria das células são diferenciadas mais 10. Para determinar como triagem em dias diferentes da cultura pode afetar o caminho do desenvolvimento subsequente ou cinética, os tipos foram realizados 3, 5 e 7 dias PH (Figura 3A). O desenvolvimento da população de MoMac (Ly6C-CD115 +) Então foi rastreado por 2 – 3 dias mais em cultura (Figura 3B-3D).
Quando classificado 3 dias PH, apenas 40% das Ly6C-CD115 + células tinham diminuído CD115 expressão dentro do post-tipo de 24h (PS) (Figura 3B). Por 48 h, PS, a fração que tinha para baixo-regulado CD115 foi de 66%, e por 72 h, 70% das células tinha este fenótipo. Esta composição fenotípica foi mantida (~ 70-72% Ly6C - CD115-) mesmo depois de mais dias de cultura (dados não mostrados). Quando classificado 5 dias PH, ~ 75% das células foram Ly6C - CD115-, tendo rapidamente para baixo-regulado CD115 dentro de 24 h PS e ~ 80% foram CD115 - depois de apenas 48 h. Essa distribuição foi mantida após 72 h (Figura 3). Finalmente, quando classificado o PH de 7 dias, para baixo-regulamento de CD115 também foi bastante rápida. Dentro de 24 h, PS, ~ 75% de células tinha para baixo-regulado CD115 expressão, e esta tendência foi mantida após 48 h (Figura 3D). Curiosamente, quando classificada no dia 7, o nível global de expressão CD115 foi menor nas células no seio da população CD115 +.
Assim, estes resultados indicam que a cinética de desenvolvimento são um pouco mais lento, ao classificar-se em um dia cedo, tais como dia 3 classificados em comparação com o desenvolvimento mais rápido de células e diferenciação observada após separação no dia 5 ou 7. Com base nestes resultados, um usuário buscando um número maior de moDC deve provavelmente tipo no dia 5 ou 7.
A resposta de maturação do DC é bem estabelecida 6,7,12,14. Quando tratados com uma variedade de padrões moleculares associados patógeno (PAMPs), DC imaturo acima-regulam a expressão de MHC moléculas de co-estimulação e citocinas pró-inflamatórias, aumentando sua capacidade de ativação de célula T 6. No entanto, é menos claro quando as células em desenvolvimento ganham a capacidade de responder a estimulação PAMP e cuja característica de maturação DC eles podem expor. Para determinar qual das populações classificadas iria responder a estímulos de maturação, cada população foi tratada logo após a classificação com um coquetel de PAMPs incluindo poli eu: C, lipopolissacarídeo (LPS) e o DNA de CpG para acionar os receptores do tipo toll (TLR) 3 (TLR3), TLR4 e TLR9, respectivamente. Células foram tratadas (ou não tratadas) por 24 h e expressão de CD86 e MHCII foi medida por citometria de fluxo (Figura 4A-4B). Além disso, a produção de IL-12p 40/70 e IL-6 foi medida nos sobrenadantes pela matriz de cytokine ELISA (Figura 4--4D).
CMPs e GMPs expressadas níveis muito baixos de MHC de classe II e CD86 em um estado unstimulated e estes expressão padrões não se alterou significativamente após a exposição ao coquetel de PAMPs (Figura 4A e 4B). Da mesma forma, a expressão de MHC-classe II pelos monócitos também era baixo e pouco mudou após a exposição PAMP (Figura 4A). No entanto, a expressão de CD86 foi moderada sobre os monócitos 24h depois da classificação, e aumentou ainda mais após 24 h de estimulação. Maior expressão basal de MHC de classe II e CD86 no MoMacs e MoDCs foi observada, e ambas as populações exibiram uma forte indução destas moléculas após estimulação PAMP. Em termos de MHC classe II expressão após estimulação não havia nenhuma diferença estatística entre o CMPs, GMPs e monócitos, enquanto os MoMacs e MoDCs formaram um grupo distinto. Ainda, em termos de expressão CD86, as células CMPs e PGM foram estatisticamente diferentes do que MoMacs e MoDCs. No entanto, monócitos não foram diferentes do que MoMacs ou MoDCs.
Em seguida queríamos avaliar a capacidade relativa de cada uma das cinco populações para a produção de citocinas em resposta à estimulação de TLR. Assim, realizamos um ensaio do cytokine sobre as populações classificadas após cultura na presença ou ausência do agonista TLR coquetel usado acima. As células foram cultivadas com os estímulos por 24 h e, em seguida, sobrenadantes foram coletados. Observou-se pouca IL - 12 p 40/70 ou produção de IL-6 por CMPs após estimulação TLR (Figura 4--4D). A segunda população, PGM, eram capaz de produzir IL-12p 40/70 (Figura 4), mas estas células produziram uma baixa quantidade de IL-6 após estimulação por PAMPs (Figura 4). Os mais altos níveis da produção de citocinas foram observados nas últimos três populações. Monócitos e MoMacs tinha muito semelhantes padrões e magnitudes da produção de citocinas. Ambos aumentaram consideravelmente a IL - 12 p 40/70 e modestamente aumentaram a produção de IL-6 por estimulação (Figura 4--4D). Curiosamente, na presença de MoDCs PAMPs não aumentar a secreção de IL-12 p 40/70; no entanto, esta população aumentou consideravelmente a produção de IL-6 (Figura 4--4D). Estes resultados indicam que as populações classificadas mantiveram suas funções imunológicas depois de isolamento.
Figura 1: células viáveis dentro de frente contra o portão lateral Scatter. Medula óssea de rato foi cultivada na GM-CSF, e viabilidade foi medida usando 7-AAD (7-amino-actinomicina D) coloração pós-colheita (PH) e 1, 3 e 5 dias após a colheita. (A) células viáveis foram Selecionadodas através da aplicação de um portão (viável) que omitido altamente granulares e pequenos eventos com base em FSC e SSC. (B) histogramas de 7-AAD coloração gerado a partir eventos no portão viável (FSC/SSC). Eventos positivos para 7-AAD indicam células passando por apoptose. As setas indicam a retenção de células viáveis. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: linfócitos no seio da população-CD115-Ly6C. Medula óssea de rato foi cultivada na GM-CSF e marcadores de linfócitos (CD3, CD145R e NK1.1) foram analisados diariamente por citometria de fluxo. Célula do (A) foram corados com Ly6C-PE e CD115-APC para identificar células-Ly6C-CD115. Portão do quadrante foi aplicada com base em controles de cor única. Enredo de ponto pseudocolorida gerado a partir do dia 0 (B) CD3, CD45R e NK1.1 expressão de Ly6C-CD115-células foi analisada no dia da colheita (dia 0) até o dia 6. Contagem de células foram normalizadas para o modo usando um software de análise de citometria de fluxo. A seta indica o Ly6C-CD115 - gating. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: cinética de desenvolvimento de Ly6C-células CD115 + depois da classificação em diferentes dias. (A) Mouse medula óssea foi colhida e cultivada em GM-CSF. Alíquotas de 1 x 107 células foram colhidos (B) 3, (C) 5, ou (D) 7 dias após a colheita (PH). Nos dias indicados PH, Ly6C-CD115 + células foram classificadas de cultura mista (pré-tipo) e analisadas imediatamente pós-tipo (PS). Classificada de células foram re-cultivadas em GM-CSF, e mudanças na expressão de Ly6C/CD115 foram analisadas diariamente por citometria de fluxo. Caixa e seta indicam classificação portão. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: expressão de maturação e citocinas após estimulação TLR. As células foram classificadas em 5 populações no dia 3 de cultura em GM-CSF. Eles então foram tratados com um coquetel de PAMPs (LPS, poli eu: C e o DNA de CpG) por 24 h. significa intensidade fluorescente (IFM) de classe II de MHC (A) e (B) CD86 foi analisada imediatamente pós-tipo (PS) e 24 h com e sem PAMPs por citometria de fluxo. Barras de erro representam o desvio padrão de 3-5 replicar experiências. (C) IL - 12 p 40/70 e (D) IL-6 em sobrenadantes de 3 amostras em pool foram medidos pelo Borrão de ponto de matriz de cytokine ELISA após 24 h com e sem PAMPs. RLU; Unidades relativas de luz; -/ + indicam a presença do marcador de superfície celular para a população designada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Dia 3 | Dia 5 | Dia 7 | |||||
| Fenótipo | Tipo de célula | Min | Max | Min | Max | Min | Max |
| Ly6C-CD115-CD11c - | CMP | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115 + | Mono | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | MoDC | N/a | N/a | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
Tabela 1: Espera-se um número mínimo e máximo das células recuperado pós-tipo por 1 x 107 células. CMP (progenitor mieloide comum); GMP (progenitoras granulócitos/macrófagos) Mono (monócitos); MoMac (macrófagos derivados de monócitos); MoDC (células dendríticas derivadas de monócitos); N/d (não disponível); Min (rendimento mínimo célula fora 1 x 107 células); Max (célula máximo rendimento fora 1 x 107 células).
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Discussion
Este protocolo facilita o isolamento de GM-CSF-driven progenitor e precursor tipos de células em número suficiente para vários tipos de análises, incluindo ensaios bioquímicos, ensaios de função celular em vitro, ou instilação em vivo. Este método representa um avanço significativo no campo do desenvolvimento de células dendríticas derivadas de monócitos, permitindo o isolamento confiável e identificação de células no início deste caminho do desenvolvimento, bem como os tipos de células diferenciadas, mais comumente isolada em estudos prévios.
Anteriores protocolos para isolamento dos progenitores e precursores gerados a partir da medula óssea em vitro têm confiado na CFSE de coloração para identificação de células progenitoras proliferativa 17 ou na coloração com CD31 e Ly6C como marcadores de células mieloides 18 . O CFSE mancha o protocolo descrito por neto foi projetado para uso em geração de orientado a Flt3L DC progenitores e precursores 17. Quando tentamos esta abordagem no sistema de cultura de GM-CSF, encontramos duas questões principais. O CFSE foi um pouco citotóxico para as células em desenvolvimento e tão brilhante (mesmo em células divididas) que isso dificultava a compensação. Esta abordagem se mostrou inadequado para nossos objetivos de isolar os primeiros tipos de células (progenitores), bem como as células em todo o espectro do desenvolvimento, de altamente proliferativas (CMPs/GMPs) para altamente desenvolvido (MoDC/MoMac). Também tentamos a estratégia de ordenação para células de GM-CSF-driven descrito pelo grupo do Leenen, que foi baseado no CD31 e Ly6C 18. No entanto, achamos que o CD31 era problemático. Ela foi expressa em níveis muito baixos (dificultando a resolver as populações para classificação limpa) por um subconjunto muito pequeno de células e só muito cedo durante o período de cultura. Na verdade, CD31 expressão não era detectável passado dia 2 de cultura em GM-CSF 10.
Ly6C, no entanto, era uma molécula muito útil para a separação de células em diferentes fases de desenvolvimento devido a seu padrão de transiente de expressão 10. A adição de CD115 permitiu discernir mais estreitamente as células em estágios intermediários e posteriores de desenvolvimento que não era possível com CD31. Também examinamos a outros marcadores de progenitores como CD34 e CD117 na esperança de isolar um grande número dessas primeiras células 10. No entanto, ao contrário do que o relatado no sistema Flt3L, descobrimos que CD34 e CD117 também foram expressos em um subconjunto muito pequeno de células e foram praticamente ausente até dia 3 de cultura 17. Estes marcadores de células-tronco podem ser útil em estudos futuros, no entanto, distinguir subconjuntos dentro das populações CMP ou GMP.
Existem várias potenciais modificações no protocolo que possa afetar o rendimento das populações de células desejado. Primeiro, o usuário pode optar por aplicar uma mancha de viabilidade para excluir qualquer células mortas. Com base em observações, a taxa de células mortas dentro de um típico para a frente e o portão da dispersão lateral são relativamente baixa, em geral e colocam problemas somente durante os primeiros dias da cultura, coincidente com diminuições em linfócitos positivos de linhagem. No entanto, para aplicações em qual célula números devem ser precisos, uma mancha de viabilidade garantirá a exclusão de células mortas.
Uma segunda modificação potencial é a depleção dos linfócitos da linhagem-positivo antes da cultura. Tentamos essa abordagem para lidar com a pequena população de células de linhagem positiva regularmente observados no seio da população Ly6C-CD115-célula. O rendimento total da célula foi ligeiramente inferior nos dias 5 e 6, e a pureza não foi significativamente maiores (dados não mostrados). Assim, a pureza não justificam o rendimento reduzido. Da mesma forma, se o usuário pretende classificar no dia 5, ou após, a frequência de linfócitos dentro da cultura é bem abaixo de 1% e não deve representar um problema.
Finalmente, porque esta estratégia é projetada para isolar células através de um grande espectro de desenvolvimento o usuário devem adaptar o calendário de seu tipo para coletar como muitas das populações desejadas quanto possível. Esta estratégia de classificação produz fielmente os tipos de célula indicados independentemente do dia da cultura na qual as células são classificadas. Por exemplo, células com o fenótipo Ly6C + CD115-CD11c-são fiel o fenótipo de GMP e a função da mesma forma se eles são classificados e isolados no dia 3 ou 5 de cultura. No entanto, a frequência dessas células é muito maior no dia 3 do 5, então se o objetivo é o isolamento deste tipo de célula, no dia 3 de classificação deve ser recomendável. É também notável que células classificado em progresso dia 3 através dos estágios do desenvolvimento subsequentes com cinética mais lenta do que se eles foram classificados no dia 5 ou 7 (Figura 3).
Enquanto este método permite a clara delimitação e isolamento de 5 – 6 populações distintas ao longo do espectro do desenvolvimento, provavelmente há muitas populações mais ou fases de transição ao longo deste percurso. Dentro de cada uma das cinco populações descritas, pode haver várias sub-populações em incrementos ligeiramente diferentes de desenvolvimento. Por exemplo, temos observado "" populações distintas com níveis intermediários de CD115 e de Ly6C que são ligeiramente diferentes padrões de desenvolvimento, em termos de quantos moMac e moDC são gerados (dados não mostrados). Também é provável que populações anteriormente observaram na vivo estão presentes na cultura e sistema de classificação, mas estes têm sido difíceis de identificar devido à sua muito pouca frequência. Populações como cMOP 19, MDP 20ou CDP 21 são provável presente, mas podem ser ocultadas dentro maiores populações. Estudos futuros serão necessários para esclarecer os inúmeros estádios de desenvolvimento que podem ser isolados dentro desta estrutura de classificação com a adição de marcadores específicos de diferenciação. O valor desta estratégia de classificação é que permite isolamento consistente de um grande número de estágios distintos mentalmente durante a ontogenia de DC.
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Disclosures
Os autores não têm nenhum conflito para divulgar.
Acknowledgments
Somos gratos pela assistência técnica da Alison Igreja pássaro em Auburn Universidade escola de medicina veterinária Flow Cytometry instalação de, para financiamento do NIH de EHS R15 R15 AI107773 e para o celular e o programa de Biologia Molecular na Universidade de Auburn para o verão de financiamento da investigação ao PBR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
