Summary
ここを識別し、分離 GM-CSF 駆動高速セルの並べ替えを使用して骨髄の細胞数が多いためメソッドを提供します。5 つの異なる集団 (一般的な骨髄前駆細胞、顆粒球/マクロファージ前駆細胞、単球、単球由来マクロファージおよび単球由来の Dc) は、Ly6C と CD115 の式に基づいて識別できます。
Abstract
単球由来樹状細胞の (研) 顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) を使用してマウスの骨髄から生成された文化は、前に認めよりコンピューターが混在する最近認識されています。これらの文化は、日常的に、研も単球由来マクロファージ (moMac)、および単球なども、いくつかの発展途上の細胞に含まれています。このプロトコルの目的は、固有の機能をさらに調査する場合がありますので、彼らが発展するにつれてこれらの文化内にある多くの細胞型の分離・同定のため一貫した方法を提供することです。ここに示す並べ替えの戦略は、どちらとして表され、一過性細胞によって彼らは GM 主導 CSF のカルチャーで開発の Ly6C と CD115、式に基づいて 4 つの集団にまず細胞を分離します。これらの 4 つの集団には、一般的な骨髄前駆細胞または CMP (Ly6C-、CD115-)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞または GMP (Ly6C +、CD115-)、(Ly6C +、CD115 +)、単球と単球由来マクロファージ moMac (Ly6C-、CD115 +) が含まれます。CD11c、Ly6C-、CD115-人口内の 2 つの集団を区別するために並べ替え方法も追加されます: CMP (CD11c-) と研 (CD11c +)。最後に、2 つの集団が内 Ly6C-、CD115 + 人口 MHC クラス II 式のレベルに基づいて更に区別されます。MoMacs 単球由来 DC 前駆体 (べき乗剰余 moDP) 表現上の MHC クラス II MHC のクラス II の低レベルを表現します。このメソッドは、様々 な機能と発達的分析のための十分な数字でいくつかの発達の異なる集団の信頼性の高い分離できます。我々 は 1 つのようなの機能読み出し、認識分子パターン (PAMPs) 刺激に対するこれらの細胞型の差動応答を強調表示します。
Introduction
サイトカインによるマウス骨髄細胞培養顆粒球マクロファージコロニー コロニー刺激因子 (GM-CSF) 広くメソッドとして生成される単球由来樹状細胞 (研; として知られている炎症性 DC) 多数1、 2,3,4,5。これらの細胞は、樹状細胞 (DC) 関数6,7,8の研究の様々 な非常に便利されています。通常、これらのマウス骨髄細胞培養は、6-8 日、樹状細胞機能5研究されます。これらの文化くらいと考えられていたほとんど均質な差別化研の大半から成る。最近では、この 6-8 日間の培養期間の終わりに、ある差別化された単球由来マクロファージ (moMacs) 9,10,11の大規模なサブセットと同様に、実際に多くの研が明らかになった。当社独自の調査はさらに研前駆体 (べき乗剰余 moDP)、単球などの以下の先進細胞の他のサブセットは、7 日間10後も低周波で文化に残ることを示すこれらの調査結果を拡張しています。したがって、このシステムによって生成された細胞を用いて樹状細胞 (DC) 機能の研究は感謝して以前よりも種類の細胞のより広範なコホートの応答を反映できます。
GM CSF 生成研分化12,13,14の最終段階でこれらの細胞の機能に関するの研究から多く学びました。しかし、我々 はこれらの発達の経路について以下は細胞の2,,1516と発揮する特定方法と時期のなどの機能大幅理解: 病原体関連分子に対する反応性パターン (PAMPs)、貪食能、抗原処理とプレゼンテーション13、および抗菌活性。従来 Flt3L 駆動 DC 前駆細胞および前駆物質の多数の隔離のためのプロトコルは、報告された17をなっています。Carboxyfluorescein サクシニミジルエステル (CFSE) を使用して、これらの異なる集団の分離が実現された-染色骨髄細胞 (分裂細胞を追跡) して 3 日間の Flt3L 文化。セルされ系統陽性細胞の枯渇、CD11c 式17に基づく前駆細胞および前駆体の個体群に分類します。GM 主導 CSF のカルチャーで DC の初期の前駆細胞を識別するために Leenen のグループによって別アプローチ CD31 と Ly6C 18に基づいてセルを並べ替えることでした。当初の目標は、前駆細胞と GM 主導 CSF 研の前駆体を得るための同様のメソッドを作成することでした。GM-CSF によって生成された特定の細胞の種類によるアプローチと戦略開発の序盤とそれ以降の段階で表現された分子の式に基づいてを並べ替えを適応しました。我々 は最終的にことを決定した Ly6C、CD115 (CSF 1 受容体)、CD11c 10型用のこれらのセルを区別するため最高のマーカー。
ここでは、GM-CSF による分化の経路に沿って開発のいくつかの異なる段階で細胞の分離法を提案する: 一般的な骨髄前駆細胞 (CMP)、顆粒球・ マクロファージ前駆細胞 (GMP)、単球、単球由来マクロファージ(MoMac) および単球由来 DC (研)。MoMac 人口さらに分離できますベース MHC クラス II 式のレベルで明らかに研前駆体人口 (べき乗剰余 moDP) 10。高速蛍光活性化セル (FACS) の Ly6C、CD115、および CD11c 表現に基づくこれらの 5 個体群を分離する戦略を並べ替えを利用します。そう、種緑化刺激への応答を明らかに機能アッセイにおけるこれらの細胞の検討を示します。
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Protocol
すべての動物の仕事は、ケアと国立衛生研究所の実験動物の使用のためのガイドに記載されている推奨事項に従ってオーバーン大学機関動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。
1. 骨髄コレクションのための準備
- ロズウェル パーク記念研究所 (RPMI) 1640 培 50 μ M 2-メルカプトエタノール、0.22 μ m フィルター真空フラスコ単位の先頭に、2 mM グルタミン 10% ウシ胎仔血清のソリューションを追加することによって 250 mL 完全なメディアを準備し、真空を適用します。
注: 完全培地は 4 ° C で最大 2 ヶ月間保存できます。 - 150 mL 滅菌 H2O の 500 mL フラスコ 100% エタノールの 350 mL を混ぜて 70% エタノール溶液を準備します。
- 4 ° C に設定する遠心
- 70% エタノールではさみ、メス、鉗子を滅菌します。
- 血清ピペットを使用して、3 つの 60 mm のペトリ皿に mL の完全培地 5 を追加します。
- 血清ピペットを使用して、50 mL の円錐管に完全なメディアの 30 mL を追加します。
2. マウス骨髄細胞のコレクション
- 安楽死に関する 2013 アメリカ獣医医学連合 (AVMA) ガイドラインの定める規則に従い CO2麻酔による c57bl/6 マウスを安楽死させます。
-
削除し、後ろ足をストリップします。
- 75% エタノール、後ろ足と胴体を飽和し、湾曲した組織用のハサミで股関節の周りの皮膚から浅いカットを作る。明らかに筋肉、足首に向かってヒップから皮膚を引っ張ってしっかりと鉗子を使用して。皮弁を削除するのにには、はさみを使用します。
- 大腿骨・股関節のすぐ上の骨を介して切断して後ろ足全体を削除します。
注: 滅菌領域、に加えてエタノールきれいな切口を提供する援助、サンプルを汚染から髪を防止します。 - 足は、骨髄採取のための新しい場所に転送されます、もし完全なメディアの足が水没します。
- 滅菌バイオ セーフティ キャビネットでの作業、事前に準備されたペトリ皿のいずれかに足を転送します。
- だけをカットするはさみを使用、足首から下の慎重にできるだけ筋肉や弾性結合組織の多くを削除します。洗浄の骨を 2 番目の準備されたペトリ皿に転送します。
注: すべての筋肉を削除する必要はありませんがあまりにも多くの残りの組織が難しく骨髄を洗い流す。 -
大腿骨、膝および脛骨を区切ります。
- 鉗子を使用して、膝で脚を保持し、骨髄を探します。
注: 骨髄は骨空洞は大腿骨と脛骨の端の方の上部の内側にかすかな赤い線として表示する必要があります。- 3 つのカットを次のようにするはさみを使用して、します。
- 脛骨骨髄が最後に表示される場所のすぐ上をカットします。
- ひざの関節のすぐ下をカットします。
- ちょうど膝上カットします。
- 股関節を大腿骨に接続したまま、股関節のすぐ下をカットします。
- ペトリ皿に 3 つの断片を返し、もう一方の足でこの手順を繰り返します。
- 3 つのカットを次のようにするはさみを使用して、します。
- 鉗子を使用して、膝で脚を保持し、骨髄を探します。
-
大腿骨と脛骨から骨髄をフラッシュします。
- 23 G 針を用いて 50 mL のコニカル チューブとキャップから完全なメディアは、10 mL シリンジを入力します。
- 第 3 準備ペトリ皿上鉗子で骨を持ち、骨運河に針を挿入、を通じて (そのままの「プラグイン」、またはいくつかのクラスターとして現れることがあります) 細胞をフラッシュ メディアをプッシュします。骨ないより多くの色を見ることができるまで繰り返します。必要に応じて、メディアで注射器を補充します。
-
骨端をつぶします。
- 2 番目のシャーレで鉗子を膝のキャップをしっかりし、注射器の先端で膝をマッシュ アップします。骨端が赤いされなくなるまで続けます。
- 注射器を使用して、50 mL のチューブに 2 番目と 3 番目のシャーレからセルを転送します。上下に軽くピペッティングして塊を解散。泡を生成しないようにします。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
-
赤い血液細胞を溶解させます。
- 血清ピペットで上澄みを取り外して、フリックすることでペレットを取り除く部屋の温度で 1 分の ACK (アンモニウム塩化カリウム) 換散バッファーの 1 つの mL での孵化によって赤血球を溶解させます。
- 血清ピペットを使用して、40 mL の HBSS (ハンクス平衡塩溶液) バッファーを追加します。
- 血清ピペットを使用して、フィルター処理セルが 70 μ m の細胞ストレーナー新しい 50 mL の円錐管に。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
- 血清ピペットを使用して、40 ml の完全なメディアの上澄みと洗浄のセルを削除します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
注: この段階で系統の肯定的なリンパ球は FACS または磁気コラムの浄化によって削除できます。しかし、リンパ球は文化の長期的を保持されません。欠席しているほぼすべての肯定的な細胞の数が多いが前のヴィヴォ骨髄における Ly6C CD115 個体群の存在が、日ごとに 5 (図 2)。 - 血清ピペットを使用して、上清を除去し、10 ng/ml の 1 x 106セル/ml の密度で遺伝子組換えマウス GM-CSF の完全なメディアの骨髄細胞の培養します。
注: 通常、4 x 107総細胞が赤血球溶解後収穫できます。しかし、期待 2 x 107として少し初心者のため、最大 5 x 107セル経験豊富な収穫のため。 - 血清ピペットを使用して、組織培養プレートにセルを転送し、, 5% CO2の 37 ° C で。各シード 24 ウェル プレートを用いた場合の細胞懸濁液 2 mL でも。
- すべての 48 時間は、メディアの半分を削除して置き換える新鮮な完全なメディアと GM-CSF 血清ピペットを使用します。
注: 文化を 9 日に維持できます。しかし、時間をかけて組成を変更します。詳細については、セクション 3 を参照してください。
3 種の日を選択します。
- セル人口の組成物は、時間をかけて変更、任意のセルの最大数を生成する日を選択します。
- 1 x 10 の7セルごと GM-CSF の文化の 3、5、および 7 日後各人口の期待されるセル収量記事並べ替えのテーブル 1を参照してください。
4. 戦略の染色
- セルの小さい因数を使用すると、コントロールのサンプルを準備できます。無染色調節、補正制御サンプルごとに、1 つだけの蛍光抗体で染色し、蛍光マイナス 1 を制御する全ての抗体は、そのチャンネルの非特異蛍光用のコントロールの 1 つを除いて追加。プライマリだけで、セカンダリだけで、間接的なラベリングを使用して含まれている場合、両方のプライマリとセカンダリです。
注: フィコエ リスリン (PE)、アロフィコシアニン (APC) タグ抗体、最小限の出血をはっきりと分離併用可能です。ただし、螢光色素のオプションが限られている場合 CD115 は、Ly6C は非常に高いレベルで表現しながら比較的低レベルで表されます。したがって、明るい螢は反 CD115、望ましい、反 Ly6C 螢で出血を防ぐために選択されます。 - 50 mL の円錐管に牛胎児血清の 3 ml チルド ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) 97 mL を混合することによって 100 mL の FACS 洗浄バッファー (FWB) を準備し、氷浴中で配置。
- やさしく、しかし徹底的にピペットの上下に緩く付着性のセルを除去するのに細胞にピペットを使用します。
-
血清ピペットを使用して、50 mL の円錐管にセルを転送します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
- セル容量は、50 mL を超える場合、チューブの必要な数のセルに転送し、染色の段階で結合します。
- 優しく、上澄みを離れて注ぎ、血清ピペットと FWB の 30 mL を追加することによって小球形にされた細胞を洗浄します。4 ° C 10 分で 250 × gで遠心分離し、洗浄を繰り返します。
注: 高い細胞死が予想される場合細胞による洗浄が可能で FWB 0.5% 牛胎児血清 (FCS) と低い。これは細胞の凝集を防ぐ。 -
中断し、抗体の製造元の指示に従って細胞を染色します。
- FWB の 1 mL に 5 x 10 の7セルの中断および反 Ly6C とアンチ CD115 (研究員の選択) の fluorophores が付いている分類の各 2 μ を追加します。さらに (両方とも Ly6C - と CD115-) 研から CMP を区別する抗 CD11c 抗体の 2 μ g を追加 (CMP は CD11c-; 研は CD11c+)。氷の上で 30 分間インキュベートします。
注:図 3は、Ly6C PE と CD115 APC を使用して生成されました。
- FWB の 1 mL に 5 x 10 の7セルの中断および反 Ly6C とアンチ CD115 (研究員の選択) の fluorophores が付いている分類の各 2 μ を追加します。さらに (両方とも Ly6C - と CD115-) 研から CMP を区別する抗 CD11c 抗体の 2 μ g を追加 (CMP は CD11c-; 研は CD11c+)。氷の上で 30 分間インキュベートします。
- 血清ピペットを使用すると、250 × g 10 分のための 4 ° c で、FWB と遠心分離機の 10 mL を追加します。
- 優しく、上澄みを離れて注ぎ、血清ピペットと FWB の 30 mL を追加することによって小球形にされた細胞を洗浄します。4 ° C 10 分で 250 × gで遠心分離し、洗浄を繰り返します。
- 細胞を中断する前に徹底的にペレットを取り除くためチューブをフリックします。血清ピペットを使用して、1 x 107セル/FWB、mL でセルを中断し、35 μ m の細胞のフィルターをフィルター処理します。血清ピペットを使用してポリプロピレン チューブにフィルターが適用されたセルを転送し、ソートする準備ができるまで氷の場所します。
注: ポリプロピレンを使用できない場合は、蛋白質のコーティング (脱脂乾燥したミルクまたは FCS) ポリスチレン管は結合を減らすために使用できます。
5. 設定コントロールのサンプルに基づいてゲート
注: 高速流れの圧力による細胞破壊を防ぐためには、細胞選別の 100-130 μ m ノズルを使用します。
-
無染色のコントロールを実行 (手順 4.1 参照)、セルソーターを小さな破片 (低前方散乱; を除外するゲートを適用し、FSC) と非常にきめ細かい (ハイサイド散布。SSC) 粒子。
- 後の段階の (単球、moMac/MoDP 研) を分析するには、だけより大きいセル (高 FSC) を含めるためのゲートを適用します。
- 生存の汚れを使用している場合 (図 1に例を示します) ステンド グラス、非実行可能なイベントを除外するこれらを使用します。
- 、セルソーターを単一蛍光コントロールのサンプルを実行し、必要に応じて補正を調整します。
- 多重ラベル サンプルのサンプルを実行します。4 つの異なる集団を観察: Ly6C + CD115-(適性)、Ly6C + CD115 + (球)、Ly6C-CD115 + べき乗剰余 (moMacs/moDP) と Ly6C-CD115 - (Cmp/moDCs)。4 つの主要な人口のそれぞれを分離するゲートを適用します。
注: Cmp と研 Ly6C CD115 表現型を共有します。しかし、彼らは CD11c 表現に基づいて区別することができる: MoDCs は CD11c 表現に対し、CMP は CD11c を欠いています。
6. 隔離集団のコレクション
- 採血管準備の少なくとも 20% を達成するために十分な FCS を追加最終濃度がいっぱい。たとえば、5 mL の管を使用している場合、並べ替えの前に FCS の 1 mL を追加し、5 mL の容量に達したときにチューブを削除します。
-
膜の売り上げ高および抗体の吸収を防ぐためには、並べ替えで 4 ° c (混合および並べ替え) すべてのサンプルを保持します。
- できない場合は、可能な限り氷に並べ替えられ、必要に応じてソーターに因数を転送するセルを含むチューブを保ちます。
- さらに、氷の 20-30 分ごとに並べ替えられたサンプルを転送します。
- 必要なセル数が収集された後は、新しい円錐管にセルを転送するのに血清ピペットを使用します。4 ° C で 250 x gで 10 分間遠心します。
- 各収集された人口からの小さい因数の並べ替え後解析と純度を確認します。
- 上澄みを除去、FWB 10 mL、4 ° C で 250 x gで 10 分繰り返し、合計 2 つの洗浄の間遠心で中断します。
注: それはペレットを外れなしすべての上澄みを除去することは困難することができます。真空ラインにピペット チップを取り付けると、除去に役立ちます。このオプションが利用できない場合は、ペレットの解離の場合新鮮なチューブに上清を収集することをお勧めします。 - 2 番目の洗浄後、上清を削除します。
- ユーザーの実験的なデザインは、セルは再培養する順序を決定する手順 2.12-2.14。それ以外の場合、セルは、即時の分析に使用される場合、は、目的のプロトコルに従ってセルを準備します。
注: 機能分析の典型的な例は、図 4に含まれます。
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Representative Results
可能であれば、実行可能な細胞として分析に利用できる多くのチャンネルを維持するために定期的にに基づいて選ばれた前方および側面の散布図、(典型的なゲート ドット プロット図 1 aのすべてに適用される) 非常に小さいと非常に細かいイベントは除きます。このゲートの戦略はを確実に死んだ細胞を除外されている場合を決定するには、我々 は 7 アミノ酸アクチノマイシン D (7 AAD) (図 1 b) と汚れます。7AAD 汚れの膜透過性による死者と死細胞の DNA と実行可能なセルは除外。典型的な FSC/SSC ゲートが骨から新鮮な隔離されたセルに適用されたとき、GM-CSF 培養骨髄細胞を収穫後 (PH) と 1、3、および 5 の博士セルをすぐに分析され PH すぐに行ったの 7 AAD 陽性細胞の約 10% を持っていた骨髄 (図 1、収穫後)。死んだ細胞のような割合も日 1 (12%) と (図 1PH 1 日と 3 日間 PH) の文化の日 3 (~ 11%) に存在していた。5 日で ~ 5% (図 1、5 日 PH) にゲート内の死んだ細胞の数が減った。したがって、このような生存率のゲートを使用して 5 日目前後の並べ替えは適切です。したがって、ユーザーが、使用可能なパラメーターの制限された場合が一般的に適切な FSC/SSC ゲートです。しかしより敏感な試金 (特に正確なセル番号に依存している) 場合のための生存の汚れ (提案) を組み込みます。
樹状細胞の伝播のための多くのプロトコルでは、リネージュ陽性細胞、文化11,17前に骨髄から、特にリンパ球の枯渇をお勧めします。この手順は、GM による CSF の分化時に回復細胞の純度を高めると考えられます。通常、T 細胞サブセット (CD3) のマーカーを発現する細胞、B 細胞 (CD45R または CD19) と NK 細胞 (NK1.1) が磁気ビーズまたはソーティング11,17,18を使用して肯定的な選択によって消耗されています。ただし、養殖システムに基づいて、リンパ球がほとんど回復またはこれらのアッセイの検出します。したがって、我々 は GM 主導脳脊髄液細胞 (図 2 a) の Ly6C CD115 人口の維持リンパ球の寿命を評価するために求めた。GM-CSF (血統の枯渇はされていなかった) のセルが (同じ fluorophore) で NK1.1、CD45R、CD3 抗体で染色した骨髄を培養し、毎日 (図 2 b) フローサイトメトリーにより測定します。Ly6C CD115 集団内で CD3/CD45R 陽性細胞は日 0-3 (図 2 b) を強く保持。4 日目にのみ数 CD45R/CD3 陽性細胞が残っているし、一日 5、6 では CD3/CD45R 発現細胞の存在はなかった。したがって、GM-CSF の文化の 4 日以内リネージュ陽性細胞は本質的に不在だった、5 と 6 の文化の日にはまったく認識されないが。
セルの開発し、(表 1;を区別するため、このシステムで毎日 GM 主導 CSF 培養の組成が変化します。図 3)。初期の時点で最も豊富な細胞前駆細胞および前駆物質で後で細胞の大半回より区別された10。以降の発達経路や速度において文化の別の日での並べ替えが与える影響を判断するには、種類は 3、5、および 7 日 PH (図 3 a) を行った。MoMac 人口の開発 (Ly6C-CD115 +)、上で追跡されていた 2-3 文化のそれ以上の日 (図 3 b-3 D)。
3 日間 PH、Ly6C の 40% だけを並べ替えたとき-CD115 + 細胞並べ替え後 24 h (PS) (図 3 b) 内での CD115 の発現が減少しました。48 h PS、いたダウン規制 CD115 率は 66%、72 h で細胞の 70% はこの表現型をしていた。この表現型の組成が維持された (70 〜 72 %ly6c - CD115-) (データは示されていない) の文化のそれ以上の日の後でさえも。~ 75% の細胞が Ly6C で 5 日間 PH を並べ替えられたとき、だけ 48 時間後 CD115 - - CD115 - 24 h PS と ~ 80% 内急速に調整される CD115 を持っていた。このディストリビューションは、72 h (図 3) 後維持されていた。最後に、7 日間 PH を並べ替えられたとき、CD115 のダウンレギュレーションをだったかなり急速なも。24 h PS、内細胞の ~ 75% あった調整される CD115 式、この傾向は、後 48 時間 (図 3 D) 維持しました。興味深いことに、7 日目で並べ替えられたとき、CD115 式の全体的なレベルは、CD115 + 人口内のセルの下でした。
したがって、開発の速度も若干遅い初期の日で並べ替えるとき、日など 3 ソートより迅速な開発と比較して細胞と分化 5 または 7 日ソート後に観察されたこれらの調査結果を示します。これらの結果に基づき、研の大きな数字を求めているユーザーが可能性があります並べ替え 5 または 7 日。
DC の成熟応答は十分に確立された6,7,12,14です。さまざまな病原体関連分子パターン (PAMPs) で処理する、未熟な DC を調整 MHC、共刺激分子およびプロ炎症性サイトカイン発現の T 細胞活性化能力6を強化します。ただし、それは、小さい明確な開発細胞種緑化刺激、それらの展示が DC の成熟の機能に対応する能力を得る。ポリを含む PAMPs のカクテルが並べ替え私直後後扱われた各人口成熟刺激に対応が並べ替えられた人口を決定する: C のリポ多糖 (LPS)、toll 様受容体 (TLR) 3 (TLR3) をトリガーする CpG DNATLR4、および TLR9、それぞれ。24 時間、細胞が扱われる (または未処理) と MHCII CD86 の発現をフローサイトメトリー (図 4 a・4 b) によって測定しました。さらに、イリノイ-12 p 40/70, il-6 の生産培養上清サイトカイン アレイ elisa 法 (図 4-4D) によって測定しました。
Cmp と MHC の適性を表明した非常に低レベルはクラス II CD86 安静時の状態、およびこれらの表現はパターンが PAMPs (図 4 aおよび4 b) のカクテルへの露出に大きく変わりませんでした。同様に、単球による MHC クラス II の式低され、また少し種緑化露出 (図 4 a) に変更されました。CD86 の発現は、並べ替え後 24 h 単球穏健だったし、それがさらに次の 24 h 刺激増加します。高い基底発現 MHC のクラス II と MoMacs と MoDCs で CD86 を観察し、両方の人口展示種緑化刺激時のこれらの分子の厳密な誘導。MHC クラス II 式刺激の面で MoMacs と MoDCs は、異なるグループを結成、Cmp、適性、単球の統計の違いはないです。しかし、CD86 表現の面で Cmp および適性の細胞だった MoMacs と MoDCs よりも統計学的に異なる。しかし、単球は MoMacs や MoDCs とは異なるでした。
我々 は次の TLR 刺激によるサイトカイン産個体のそれぞれの相対的な能力を評価したいです。したがって、サイトカインのアッセイに行った並べ替えられた集団後上記カクテル TLR アゴニストの有無でカルチャが使用されます。24 h の刺激で細胞を培養し、培養上清を採取します。ほとんどの IL-12 p 40/70 または TLR 刺激 (図 4-4D) Cmp による il-6 産生を見ました。2 番目の人口、適性は IL-12 p 40/70 (図 4) を生成することがなかったが、これらの細胞が PAMPs (図 4) による刺激に il-6 の低量を生産します。サイトカイン産生の最高レベルは、後者の 3 つの集団で観察されました。単球と MoMacs は、非常によく似たパターンとサイトカイン産生の大きさを持っていた。両方は IL-12 p 40/70 を大幅増加し、控えめな刺激 (図 4-4D) を il-6 産生を増加します。興味深いことに、PAMPs MoDCs の存在下で増加しなかった IL-12 p 40/70 分泌;しかし、この人口は、il-6 産生 (図 4-4D) を大幅増加。並べ替えられた集団が分離後の免疫学的機能を維持することが示唆されました。
図 1: 対側散布ゲート前方内生菌。マウス骨髄, GM-CSF、培養し、生存率は 7 AAD (7-アミノ アクチノマイシン D) 収穫後 (PH) と 1、3、および 5 日後収穫を染色を用いて測定しました。FSC と SSC に基づく小さくて細かいイベントを省略したゲート (実行可能な) を適用することによって (A) 実行可能なセルが選択されています。7 AAD 染色 (B) ヒストグラムは、実行可能な (FSC/SSC) ゲート内のイベントから生成されます。7 AAD の肯定的なイベントは、アポトーシス細胞を示しています。矢印は、実行可能な細胞のゲーティングを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: Ly6C CD115 集団内でリンパ球。GM 脳脊髄液で培養したマウス骨髄とフローサイトメトリーによるリンパ球のマーカー (CD3、CD145R、および NK1.1) を毎日行った。(A) セルと Ly6C PE CD115 APC Ly6C CD115 細胞を識別するために染色します。象限儀のゲートは単一カラー コントロールに基づいて適用されました。6 日目まで収穫 (0 日) の日に Ly6C CD115 セルの 0 (B) CD3、CD45R、NK1.1 式を行った日から生成された擬似カラー ドット プロット。細胞数は、フロー フローサイトメトリー解析ソフトウェアを使用してモードに正規化されました。矢印の Ly6C-CD115 ゲートします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: Ly6C の開発の速度-CD115 + 細胞別の日に並べ替え後。(A) マウス骨髄は収穫され、GM-CSF の培養します。1 x 10 の7セルの因数は収穫 (B) 3, 5 (C)、または (D) 7 日後収穫 (PH).指定された日の PH、Ly6C-CD115 + 細胞混合培養 (事前ソート) からソート, すぐに分析され並べ替え後 (PS)。GM-CSF、再培養細胞とフローサイトメトリーによる Ly6C/CD115 発現の変化を毎日行った。ボックスと矢印は、並べ替えのゲートを示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: TLR 刺激に続く成熟とサイトカインの式。セルは、GM-CSF の文化の 3 日目に 5 個体群に分類されました。PAMPs のカクテルが扱われた、(LP、ポリ私: C と CpG DNA) 24 時間の意味 (A) MHC のクラス II の蛍光強度 (MFI) と (B) CD86 を並べ替え後 (PS) と 24 h で PAMPs とフローサイトメトリーすぐに行った。誤差範囲は、3-5 複製実験標準偏差を表します。(C) IL-12 p 40/70 および (D) IL-6 3 プールされたサンプルから培養上清では、PAMPs と 24 h 後サイトカイン アレイ ドットしみ elisa 法により測定しました。RLU;相対光ユニットです。-/+ 指定人口の細胞表面マーカーの存在を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 日 3 | 日 5 | 日 7 | |||||
| 表現型 | セルの種類 | 分 | マックス | 分 | マックス | 分 | マックス |
| Ly6C-CD115-CD11c- | CMP | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 10 の5 | 1 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115 + | モノラル | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 10 の5 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 10 の5 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | 研 | N/a | N/a | 5 x 10 の5 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
表 1: 期待されるセルの最小値と最大数回復 1 x 10 の7セルごとの並べ替え後。CMP (一般的な骨髄前駆);GMP (顆粒球・ マクロファージ系前駆) モノラル (単球);MoMac (単球由来マクロファージ);研 (単球由来樹状細胞);N/a (利用できない);分 (1 x 10 の7セルからセルの最小イールド);Max (1 x 10 の7セルからセルの最大収量)。
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Discussion
このプロトコルは細胞機能体外、または注入の生体内の生化学的アッセイを含む分析のいくつかのタイプの十分な数の GM 主導 CSF 前駆細胞および前駆細胞型の分離を促進します。このメソッドより一般的に信頼性の高い分離とこの経路のそれらの分化細胞の種類と同様に、開発の早い段階で細胞の同定を可能にする単球由来樹状細胞の開発の分野で重要な進歩を表します先行研究で分離されました。
前駆細胞と骨髄体外から生成の前駆物質の分離以前のプロトコルは、増殖前駆細胞17を識別する CFSE 染色や18 骨髄系細胞のマーカーとして CD31 と Ly6C 染色上に依存しています。.君主によって記述されたプロトコルを汚す CFSE は Flt3L 駆動 DC 前駆細胞と前駆体17の世代で使用するために設計されました。GM-CSF 文化システムでこのアプローチを試みた、2 つの主要な問題が発生しました。CFSE やや発展途上の細胞に細胞毒性は、補正が難しく、(さらに分割されているセル) 明るいだった。このアプローチは、細胞から増殖性が高い (Cmp/適性 (研/MoMac) 高度に発達のスペクトル全体だけでなく、初期の細胞型 (前駆) を分離する我々 の目標には適さないことが分かった。また、CD31 と Ly6C 18に基づいていた Leenen のグループによって説明されている GM CSF 駆動セルの並べ替えの方法を試みた。ただし、CD31 は問題があったことがわかった。(難しくきれいな並べ替えの人口を解決する) 非常に低いレベルで表現された細胞の非常に小さなサブセットのみ培養期間中に非常に早いで。実際には、CD31 式は過去の GM-CSF 10文化の日 2 検出でした。
Ly6C、しかし、式10の一時的なパターンによる開発のさまざまな段階で細胞を分離するための非常に有用な分子であった。CD115 の追加では、CD31 と不可能だった開発の中間およびそれ以降の段階で細胞をより密接に識別することができました。また、これらの初期の細胞10の数が多いを隔離することを望んで CD34 など CD117 前駆細胞の他のマーカーを調べた。しかしとは違って、Flt3L システムで報告される、我々 は CD34 と CD117 細胞の非常に小さいサブセットに懸念も表明された、事実上不在だったことを発見文化17の 3 日目。これらの幹細胞のマーカー CMP または GMP の人口内のサブセットを区別するためにしかし、将来の研究に役に立つことがあります。
目的のセル人口の収量に影響を与える可能性がありますプロトコルをいくつかの潜在的な変更があります。まず、ユーザーは任意の死んだ細胞を除外する生存の汚れを適用できます。観測に基づく典型的な前方と側散布ゲート内にある死んだ細胞の率は一般的に、比較的低いと文化、リネージュの肯定的なリンパ球の減少と一致する最初の数日間だけの問題を提起します。ただし、セルの数値は正確でなければならないアプリケーション、生存の汚れは死んだ細胞の排除いたします。
2 番目の潜在的な変更は、文化の前にリネージュ陽性リンパ球の減少です。我々 は Ly6C-CD115-細胞集団内で定期的に観察された肯定的な細胞の小さい人口に対処するこの方法を試してみました。全体の細胞収率 5 と 6 日で若干低い、純度はなかった有意に高かった (データは表示されません)。したがって、純度は低収量を正当化しなかった。同様に、5 日目以降のソートすることを計画、文化の中でリンパ球の頻度は 1% を大きく下回っているし、問題を提示しないでください。
最後に、この戦略は分離のため大規模な発達スペクトル ユーザー間でセルはできるだけ目的の人口の多くを収集するために、並べ替えのタイミングを調整すべき。この並べ替え方法は忠実にセルが並べ替えは、文化の日に関係なく示された細胞の種類を生成します。たとえば、細胞表現型 Ly6C + CD115 CD11c は GMP の表現型と機能に忠実で同様に並べ替え、3 または 5 の文化の日に分離するかどうか。ただし、これらの細胞の頻度は 3 日目 5 よりもはるかに大きいので、目標は、この型のセルの分離場合、3 日目に並べ替えが推奨されるでしょう。また、彼らは 5 または 7 (図 3) の日にソートされた場合よりも遅い速度でその後の発達段階を経て 3 日目進行にセルが並べ替えられている注目すべきです。
このメソッドは、明確な描写と発達のスペクトルに沿って 5-6 異なる集団の分離があります可能性が高い多くのより多くの人口またはこの経路に沿っての過渡的段階。それぞれ 5 つ記載されている人口のわずかに異なる単位でいくつかのサブ集団開発の可能性があります。たとえば、我々 は「異なる」集団中間レベルと CD115 と Ly6C の開発、どのように多くの moMac と研の観点からのわずかに異なるパターンを受ける生成 (データは示されていない) を観察しました。また、人口は生体内で文化の分類のシステムはあるが、これらの超低周波が原因を特定することは困難されている以前観察したそうです。CMOP 19、民主党20、または CDP 21などの人口は可能性はあるより大きい人口の内で隠されることがあります。今後の研究をさらに差別化の特定のマーカーを追加してこの並べ替えのフレームワーク内で分離することが多数の発達段階を明らかにする必要になります。この並べ替え方法の値は、DC 個体中に発達段階の多数の一貫した分離できます。
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Disclosures
著者を開示するとの競合があります。
Acknowledgments
アリソン教会鳥で、オーバーン大学学校の獣医流れ Cytometry 施設は、オーバーン大学細胞分子生物学専攻する EHS R15 R15 AI107773 と NIH からの資金からの技術支援に感謝しております夏に PBR に研究資金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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