Summary
여기 우리는 식별 하 고 격리 GM-CSF 골수성 세포 고속 셀 정렬 사용 하 여 구동의 다 수에 대 한 메서드를 제공 합니다. Ly6C 및 CD115 식에 따라 5 가지 인구 (일반적인 골수성 창시자, granulocyte/macrophage 창시자, monocytes, monocyte 파생 된 대 식 세포 및 monocyte 파생 된 DCs)를 확인할 수 있습니다.
Abstract
문화 monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC) Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)를 사용 하 여 마우스 골 수에서 생성 된의 최근 이전 감사 보다 더 이질적인 것 인정 되었습니다. 이러한 문화는 정기적으로 뿐만 monocyte 파생 된 moDC 대 식 세포 (moMac), 및 monocytes 등도 일부 덜 개발 된 셀 포함. 이 프로토콜의 목표는 일관 된 방법을 제공 식별 및 분리는 많은 종류의 세포가이 문화에 대 한 개발로 서 그들은, 특정 기능 추가 조사 될 수 있도록. 여기에 제시 된 정렬 전략 4 인구 둘 다는 표현 정도 세포에 의해 그들은 GM-CSF 중심 문화에서 개발 Ly6C 및 CD115의 식을 기반으로 먼저 세포를 분리 합니다. 이 4 개의 인구는 일반적인 골수성 창시자 또는 CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyte/macrophage 창시자 또는 GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +), 및 monocyte 파생 된 세포 또는 moMac (Ly6C-, CD115 +)를 포함합니다. CD11c는 Ly6C-, CD115-인구 내에서 두 개의 인구를 구분 하는 정렬 전략에도 추가 됩니다: CMP (CD11c-) 및 moDC (CD11c +). 마지막으로, 두 개의 인구는 Ly6C-, CD115 + 인구 MHC 클래스 II 식의 수준에 따라 내 더 구별 될 수 있습니다. MoMacs 익스프레스 MHC 종류 II, 더 낮은 수준의 높은 MHC 종류 II를 표현 하는 monocyte 파생 된 DC 전조 (moDP) 하는 동안. 이 메서드는 여러 발달 고유 인구 숫자의 신뢰할 수 있는 격리에 대 한 다양 한 기능과 발달 분석에 대 한 충분 한 있습니다. 우리는 하나 같은 기능 판독, 이러한 종류의 세포 차동 응답 Pathogen-Associated 분자 패턴 (PAMPs) 자극을 강조.
Introduction
Murine 골 수 세포는 사이토카인의 경작 Granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF)은 널리 이용 방법으로 큰 숫자 1, monocyte 파생 된 모 수석 세포 (moDC;로 알려진 염증 DC)를 생성 하 2,3,,45. 이 세포의 수지상 세포 (DC) 함수 6,,78의 학문의 다양 한에서 매우 유용 되었습니다. 일반적으로, 이러한 murine 골 수 세포 교양 6-8 일 이며 수지상 세포 기능 5의 연구를 위해 사용 됩니다. 이러한 문화 오래 되어 고려 했다 주로 균질 성, 차별화 된 moDC의 대부분의 구성 된. 최근에, 그것은 분명이 6-8 일 문화 기간의 끝에, 차별화 된 monocyte 파생 된 세포 (moMacs) 9,,1011의 큰 하위 집합 뿐 아니라 실제로 많은 moDC 되었다. 우리 자신의 연구 더 적은 개발된 세포, monocytes, moDC 전 (moDP) 등의 다른 하위 집합 107 일 후에 낮은 주파수에서 문화에 남아 있는 것을 보여주는이 발견을 확대 했습니다. 따라서, 수지상 세포 (DC) 함수 사용 하 여이 시스템에 의해 생성 된 셀의 연구 이전 감사 보다 세포 유형의 광범위 한 코 호트의 응답을 반영 수 있습니다.
우리는 훌륭한 제의로 GM-CSF 생성 moDC 차별화 12,,1314의 마지막 단계에서 이러한 세포의 기능에 관련 된 연구에서 배웠습니다. 그러나, 우리가 이해 크게 이들의 발달 경로 대 한 세포 2,,1516 어떻게 그리고 언제 그들은 구체적인 전시의 같은 기능: 병원 체 관련 분자에 응답 패턴 (PAMPs), 식 균 작용, 항 원 처리 및 프레 젠 테이 션 13, 그리고 항균 활동. 기존의 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자의 많은 수의 격리 프로토콜 보고 17되었습니다. 이러한 고유한 인구의 격리 carboxyfluorescein succinimidyl 에스테 르 (CFSE)를 사용 하 여 달성 되었다-스테인드 골 수 세포 (세포를 분할 추적)와 3 일 동안 Flt3L에 문화. 셀은 비재귀 긍정적인 세포의 고갈 그리고 조상과 전조 인구 CD11c 식 17을 기반으로 정렬 했다. GM-CSF 중심 문화에서 DC의 이른 창시자를 식별 하기 위해 Leenen의 그룹에 의해 또 다른 방법은 CD31 Ly6C 18에 따라 셀을 정렬 했다. 초기 목표는 창시자 및 GM-CSF 기반 moDC의 선구자는 비슷한 방법을 만드는 것 이었다. GM-CSF에 의해 생성 된 특정 세포 유형으로 인해 우리는 접근 및 전략 개발의 초기 및 이후 단계에서 표현 했다 분자의 식에 따라 정렬 적응. 우리가 궁극적으로 결정 하는 Ly6C, CD115 (CSF-1 수용 체), CD11c 10종류 구별이 셀에 대 한 최고의 마커를 했다.
여기, 우리 GM-CSF에 의해 구동 하는 차별화의 통로 따라 개발의 일부의 단계에서 세포의 분리 방법 제시: 일반적인 골수성 조상 (CMP), Granulocyte Macrophage 조상 (GMP), monocyte, monocyte 파생 된 대 식 세포 (MoMac) 및 monocyte 파생 된 DC (MoDC). MoMac 인구 수 추가 분리 될 기반 MHC 클래스 II 식의 수준에 moDC 전조 인구 (moDP) 10공개. 우리가 활용 고속 형광 활성화 셀이 5 인구 Ly6C, CD115, 및 CD11c의 식에 따라 분리 (FACS) 전략을 정렬 합니다. PAMP 자극에 대 한 답변을 공개 하는 기능 분석에서 이러한 셀의 시험 다음 보여 줍니다.
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Protocol
모든 동물 작업 치료와 국립 보건원의 실험 동물의 사용에 대 한 가이드에 설명 된 권장 사항에 따라 어 번 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 되었다.
1입니다. 골 수 컬렉션에 대 한 준비
- 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 1640 매체 10% 태아 종 아리 혈 청, 2mm 글루타민과 0.22 μ m 진공 필터 플라스 크 단위의 상단에 50 µ M 2-mercaptoethanol 보충의 솔루션을 추가 하 여 250 mL 완전 한 미디어를 준비 하 고 진공을 적용.
참고: 완전 한 매체 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 최대 2 개월까지. - 150 mL 살 균 H2O 500 mL 플라스 크에 100% 에탄올의 350 mL를 혼합 하 여 70% 에탄올 솔루션을 준비 합니다.
- 4 ° c 설정된 원심 분리기
- 포 셉, 메스, 및 70% 에탄올에가 위를 소독.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세 60 mm 페 트리 접시에 완전 한 미디어의 5 mL를 추가 합니다.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브를 완전 한 미디어의 30 mL를 추가 합니다.
2입니다. Murine 골 수 세포 수집
- 안락사에 대 한 2013 미국 수의 의학 협회 (AVMA) 지침에 의해 설정 된 규칙에 따라 CO2 마 취 법에 의해 C57BL/6 마우스를 안락사.
-
제거 하 고 뒷 다리를 제거.
- 75% 에탄올, 뒷 다리와 몸통을 포화 곡선된 조직이 위 고관절 주위 피부를 통해 얕은 상처를 확인. 근육을 드러내는 발목 쪽으로 엉덩이에서 피부를 당겨 단단히 집게를 사용 하 여. 가 위를 사용 하 여 제거 피부 플랩.
- 전체 뒷 다리 대 퇴 골/고관절 보다 뼈를 통해 서 절단 하 여 제거 합니다.
참고: 살 균 그 지역을, 뿐만 아니라 에탄올 제공 하 고 깨끗 한 상처에 도움이 되며 샘플을 오염에서 머리카락을 방지. - 다리 골 수확에 대 한 새 위치로 전송 됩니다, 경우 완전 한 미디어에 다리 잠수함.
- 살 균 biosafety 내각에서 working 전송 다리 접시는 이전 준비 중.
- 그냥 잘라가 위를 사용 하 여 발목 아래 신중 하 게 최대한 근육과 탄성 결합 조직 제거. 두 번째 준비 페 트리 접시를 청소 뼈를 전송 합니다.
참고: 모든 근육을 제거 하지 않아도 됩니다, 하지만 너무 많은 나머지 조직이 어려울 수 있습니다 그것은 골 수 밖으로 플러시. -
대 퇴 골, 무릎 및 경골을 구분 합니다.
- 집게를 사용 하 여 무릎에서 다리를 개최 하 고 골 수를 찾습니다.
참고: 골 캐비티 내부에 뼈는 대 퇴 골 및 경골의 끝으로 상단에 희미 한 붉은 선으로 표시 됩니다.- 가 위를 사용 하 여 다음과 같이 3 개의 상처를 확인 합니다.
- 바로 골 수 끝에 나타나는 위에 경골을 잘라.
- 무릎 관절 아래 그냥 잘라.
- 무릎 관절 위에 그냥 잘라.
- 고관절 대 퇴 골에 여전히 연결 되어, 바로 고관절 아래 컷.
- 페 트리 접시에 3 개의 파편을 반환 하 고 다른 다리에이 과정을 반복.
- 가 위를 사용 하 여 다음과 같이 3 개의 상처를 확인 합니다.
- 집게를 사용 하 여 무릎에서 다리를 개최 하 고 골 수를 찾습니다.
-
대 퇴 골과 경골에서 골을 플러시.
- 23 G 바늘으로 50 mL 원뿔 튜브, 및 모자에서 완전 한 미디어 10 mL 주사기를 채우십시오.
- 세 번째 준비 페 트리 접시 위에 집게와 뼈를 잡고, 뼈 운하에 바늘을 삽입 하 고, (또는 여러 클러스터는 그대로 "플러그"로 나타날 수 있습니다) 세포 밖으로 홍 조를 통해 미디어를 밀어. 뼈를 통해 서 더 많은 색깔을 볼 수 있다 때까지 반복 합니다. 필요에 따라 미디어와 주사기를 다시 채우십시오.
-
epiphyses 호감.
- 두 번째 페 트리 접시에 무릎 모자 집게, 단단히 잡고 하 고 주사기의 팁과 무릎을 매쉬. epiphyses 빨간색 이상 될 때까지 계속 합니다.
- 주사기를 사용 하 여 전송 셀에서 두 번째 및 세 번째 페 트리 접시 50 mL 튜브. 부드럽게 위아래로 pipetting으로 덩어리를 해체. 거품을 생성 하지 마세요. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
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붉은 혈액 세포를 lyse
- 혈 청 학적인 피 펫과 상쾌한을 제거 하 고, 터치 하 여 펠 릿을 꺼내 실 온에서 1 분에 대 한 ACK (염화 염화 칼륨) 세포의 용 해 버퍼의 1 mL에 배양 하 여 붉은 혈액 세포를 lyse.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, HBSS (행 크 스 균형 소금 솔루션) 버퍼의 40 mL를 추가 합니다.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 필터링 셀 비록 70 µ m 셀 거르는 새로운 50 mL 원뿔 관으로. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 완전 한 미디어의 40 mL로 세척 하 고 표면에 뜨는 셀을 제거 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
참고:이 단계에서 계보 긍정적인 세포 FACS 또는 자기 열 정화에 의해 제거할 수 있습니다. 그러나, 림프 톨 문화에 긴 기간을 유지 하지 됩니다. 거의 모든 결 석 하는 혈통 긍정적인 세포의 많은 수는 Ly6C-CD115-인구 비보 전골 수에에서 존재, 하루 5 (그림 2). - 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 상쾌한, 제거 하 고 골 셀 1 x 106 셀/mL의 조밀도에 재조합 마우스 GM-CSF의 10 ng/mL와 함께 완전 한 미디어 문화.
참고: 일반적으로, 4 x 107 총 세포 수 수 수확 붉은 혈액 세포 세포의 용 해 후. 그러나, 기대 2 x 107 조금 초보자를 위한 최대 5 x 107 셀 경험된 수확기에 대 한. - 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 세포 조직 문화 접시에 전송 하 고 37 ° c 5% CO2에서 품 어. 각 씨앗 24-잘 접시를 사용 하 여 경우 세포 현 탁 액 2 mL와 잘.
- 모든 48 h 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 미디어의 절반을 제거 하 고 신선한 완전 한 미디어와 GM-CSF 대체.
참고: 문화 수 유지 9 일. 그러나, 구성 시간이 지남에 변경 됩니다. 자세한 내용은 섹션 3을 참조 하십시오.
3. 선택 정렬의 하루
- 시간이 지남에 셀 인구 구성 변화로 원하는 셀의 가장 높은 번호를 생성 하는 일을 선택 합니다.
- 1 x 107 셀 당 GM-CSF에 문화의 3, 5, 및 7 일 후 각 인구의 예상된 셀 항복 게시물 정렬 표 1을 참조 하십시오.
4. 얼룩이 전략
- 셀의 작은 aliquots를 사용 하 여 제어 샘플을 준비 하. 흠 없는 컨트롤, 보상 제어 샘플 하나만 형광 항 체 각, 물 포함 고 형광-마이너스-1 제어 하나, 일반적인 형광 해당 채널에 대 한 제어를 제외 하 고는 모든 항 체에 추가 합니다. 기본, 보조, 포함 간접적인 라벨을 사용 하 고 모두 기본 및 보조.
참고: Phycoerythrin (PE) 및 allophycocyanin (APC) 태그 항 체 제공 최소한의 출혈과 뚜렷한 분리에 함께 사용 될 때. 그러나, 형광 색소 옵션이 제한 됩니다, 경우 CD115는 표현 상대적으로 낮은 수준에서 Ly6C은 매우 높은 수준에서 표현 하는 동안. 따라서, 밝은 형광은 필요한 안티-CD115, 그리고 안티-Ly6C 형광 이상의 출혈을 방지 하기 위해 선택 됩니다. - 3 mL 50 mL 원뿔 튜브, 혈 청 태아 종 아리와 함께 냉장된 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 97 mL를 혼합 하 여 100 mL FACS 워시 버퍼 (FWB)의 준비 하 고 얼음 목욕에.
- 한 피 펫을 사용 하 여 부드럽게, 그러나 철저 하 게, 플라스틱 셀 아래로 느슨하게 부착 셀을 꺼내 려.
-
혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여, 50 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송 합니다. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
- 셀 볼륨 50 mL를 초과 하는 경우 튜브의 필요한 수를 셀을 전송 하 고 착 단계에서 결합.
- 부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다.
참고: 높은 세포 죽음을 예상 하는 경우 셀 세척 될 수 있다와 FWB와 낮은 0.5% 태아 종 아리 혈 청 (FCS). 이 세포 응집 되지 것입니다. -
일시 중지 하 고 항 체 제조 업체의 지시 당 세포 얼룩.
- 5 x 107 셀 FWB의 1 mL를 일시 중단 하 고 2 µ g 각 안티-Ly6C 및 안티-CD115 (의 연구자의 선택) fluorophores 표시를 추가 합니다. 더 CMP 구별 moDC (둘 다은 Ly6C-CD115-), 추가 안티-CD11c 항 체의 2 µ g (CMP는 CD11c-; moDC는 CD11c+). 얼음에 30 분 동안 품 어.
참고: 그림 3 Ly6C-PE와 CD115 APC를 사용 하 여 생성 되었습니다.
- 5 x 107 셀 FWB의 1 mL를 일시 중단 하 고 2 µ g 각 안티-Ly6C 및 안티-CD115 (의 연구자의 선택) fluorophores 표시를 추가 합니다. 더 CMP 구별 moDC (둘 다은 Ly6C-CD115-), 추가 안티-CD11c 항 체의 2 µ g (CMP는 CD11c-; moDC는 CD11c+). 얼음에 30 분 동안 품 어.
- 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 10 분 동안 4 ° C에서 250 x g 에서 FWB, 그리고 원심 분리기의 10 mL를 추가 합니다.
- 부드럽게 부는 상쾌한 어 하 고 혈 청 학적인 피 펫으로 FWB의 30 mL를 추가 하 여 수송과 세포를 씻어. 10 분, 4 ° C에서 250 x g 에서 centrifuge 고 세척을 반복 합니다.
- 셀을 중단 하기 전에 철저 하 게 펠 릿을 꺼내 려 튜브를 터치 합니다. 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 1 x 107 셀/mL FWB의 세포를 중단 하 고 35 µ m 셀 필터를 통해 필터링. 폴 리 프로필 렌 튜브에 필터링 된 셀 전송 정렬 준비가 될 때까지 얼음에 배치 하는 혈 청 학적인 피 펫을 사용 합니다.
참고: 지금까지 폴 리 프로필 렌, 사용할 수 없는 경우에 단백질 코팅 (무 지방 건조 우유 또는 FCS) 폴리스 티 렌 튜브 바인딩을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다.
5. 설정 제어 샘플에 따라 게이츠
참고: 고속 흐름 스트림의 압력 때문에 세포 파쇄를 방지 하려면 셀 정렬에 대 한 100-130 µ m 노즐을 사용 합니다.
-
흠 없는 컨트롤 실행 (단계 4.1 참조) 셀 정렬 통해 작은 파편 (낮은 앞으로 분산형;를 제외 하려면 게이트를 적용 하 고 FSC) 및 매우 세분화 된 (높은 쪽 분산형; SSC) 입자입니다.
- 분석에 후기 (monocytes, moMac/MoDP, 및 MoDC), 더 큰 셀 (높은 FSC)만 포함 하도록 게이팅 적용 됩니다.
- 생존 얼룩 사용 중인 경우 사용 하 여 이러한 스테인드, 비-가능한 이벤트 (예를 들어 그림 1에 설명 된다)를 제외 하.
- 셀 정렬 통해 단일 형광 제어 샘플을 실행 하 고 필요에 따라 보상을 조정 합니다.
- 다중 표시 된 샘플의 샘플을 실행 합니다. 4 개의 명료한 인구를 관찰: Ly6C + CD115-(GMPs) Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), 및 Ly6C-CD115-(CMPs/moDCs). 각 4 개의 주요 인구를 분리 하는 게이트를 적용 합니다.
참고: CMPs와 moDC Ly6C-CD115-표현 형을 공유합니다. 그러나, 그들은 분화 될 수 있다 CD11c 식에 따라: CMP 부족 CD11c, MoDCs 익스프레스 CD11c 반면.
6입니다. 고립 된 인구의 수집
- 적어도 20%를 달성 하기 위해 충분 한 FCS를 추가 하 여 컬렉션 튜브를 준비 최종 농도 전체. 예를 들어 5 mL 튜브를 사용 하는 경우 정렬, 전에 FCS의 1 mL을 추가 하 고 5 mL 전체 볼륨에 도달할 때 튜브를 제거.
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막 회전율과 항 체 이해를 방지 하기 위해, 일종에 걸쳐 4 ° C에서 모든 샘플 (혼합 및 정렬)을 유지 합니다.
- 만약 이것이 가능 하지, 유지 가능한 얼음에 정렬 하 고 필요에 따라 정렬에 aliquots를 전송 하는 셀을 포함 하는 관.
- 또한, 모든 20-30 분 얼음 정렬된 샘플 전송.
- 원하는 셀 수를 수집한 후에 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 새로운 원뿔 튜브에 세포를 전송. 10 분 동안 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기.
- 각 수집 된 인구에서 작은 aliquots에 정렬 후 분석 순도 확인 합니다.
- 제거는 상쾌한, FWB 및 두 세척의 총 10 분 반복에 대 한 250 x g 4 ° c에서 원심 분리기의 10 mL에 일시 중지.
참고: 그것은 펠 릿을 dislodging 없이 모든 상쾌한을 제거 하려면 어려울 수 있습니다. 피 펫 팁 진공 라인을 연결 제거 도울 수 있습니다. 사용할 수 없는 경우는 상쾌한 펠 릿 분리의 경우 신선한 튜브에 수집 될이 좋습니다. - 두 번째 세척 후에 상쾌한을 제거 합니다.
- 경우 사용자의 실험 디자인 셀 다시 경작 될 지시, 단계 2.12-2.14. 그렇지 않으면, 셀 즉각적인 분석을 위해 사용 될 경우 원하는 프로토콜에 따라 셀을 준비 합니다.
참고: 일반적인 기능 분석의 예는 그림 4에 포함 됩니다.
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Representative Results
가능 하 고, 실행 가능한 세포로 분석을 위해 사용할 수 있는 많은 채널을 유지 하기 위해에서 매우 작고 매우 세부적인 이벤트 (일반 게이트 모든 적용 됩니다 도트 그림 1A에플롯)를 제외 하 고 측면 분산형에 따라 선택 일상적으로 했다. 이 제어 전략은 안정적으로 죽은 세포를 제외 하는 경우를 확인 하려면 우리는 7-아미노 악티노마이신 d (7-AAD) (그림 1B) 스테인드. 7AAD는 DNA 죽음과 죽어가는 세포 막 침투성 때문에 얼룩 그리고 가능한 세포에 의해 제외 됩니다. GM-CSF 배양된 골 수 세포 수확 후 (PH)와 1, 3, 그리고 5 박사 셀 분석 PH 즉시 즉시 분석의 일반 FSC/SSC 게이트 뼈에서 갓 격리 된 셀에 적용 된 7 AAD 긍정적인 세포의 약 10%를 했다 수 (그림 1, 수확 후). 죽은 세포의 비슷한 비율 또한 하루 1 (~ 12%)과 문화 (그림 1, 1 일 PH 및 PH 3 일)를 하루 3 (~ 11%)에 존재 했다. 하루 5, 게이트 내에서 죽은 세포의 수는 ~ 5% (그림 1, 5 일 산도)로 감소 되었다. 따라서, 이러한 생존 게이트를 사용 하 여는 일반적으로 정렬 후 5 일에 적합 합니다. 따라서, 사용자는 그들의 사용 가능한 매개 변수에서 제한 됩니다, FSC/SSC 게이팅 경우 일반적으로 적절 한. 그러나, 더 민감한 분석 실험 (특히 만약 그들이 정확한 핸드폰 번호에 의존)에 대 한 생존 얼룩 (제안)를 통합.
수지상 세포의 전파에 대 한 많은 프로토콜 혈통 긍정적인 세포, 특히 세포 문화 11,17전에 골 수에서 고갈을 것이 좋습니다. 이 절차는 GM-CSF 중재 차별화 시 복구 하는 세포의 순도 높이기 위해 생각 됩니다. 일반적으로, T 세포 (CD3)의 마커를 표현 하는 세포 B 세포 (CD45R 또는 CD19), 그리고 NK 세포 (NK1.1) 자석 구슬 또는 11,17,18정렬 셀을 사용 하 여 긍정적인 선택에 의해 고갈 될 수 있습니다. 그러나, 자란 시스템을 바탕으로, 림프 톨은 거의 복구 또는 이러한 분석 실험에서 발견. 따라서, 우리는 Ly6C-CD115-사이 인구 GM-CSF 기반 셀 (그림 2A)에서 유지 관리 하는 림프 톨의 장 수를 평가 하고자 했다. GM-CSF 배양 골 수 세포 (그 계보 고갈 되지 않았다) (동일한 fluorophore)에서 CD3, CD45R, 및 NK1.1 항 체와 스테인드 했다 고 매일 cytometry (그림 2B)에 의해 측정. Ly6C-CD115-인구, 내 CD3/CD45R 긍정적인 세포 일 0-3 (그림 2B)을 통해 강력 하 게 유지 됩니다. 4 일 몇 CD3/CD45R 긍정적인 셀만 남아, 고 하루 5, 6에 의해 아무 CD3/CD45R 현재 셀을 표현 했다. 따라서, GM-CSF에 문화 4 일 이내 혈통 긍정적인 세포 기본적으로 결 석 했다 고 일 5와 6의 문화에서 전혀 검색 되지 했다.
GM-CSF 기반 세포 배양 매일 변경 셀이이 시스템에서 개발 하 고 (표 1; 차별화의 구성 그림 3)입니다. 초기 시간 지점에서 가장 풍부한 셀 창시자와 선구자, 있으며 나중 시간 셀의 대부분은 더 차별화 된 10. 확인 하려면 어떻게 정렬 문화의 다른 일에 영향을 미칠 수 후속 발달 경로 또는 속도 론, 종류 3, 5, 7 일 산 (그림 3A)도 수행 했다. MoMac 인구의 개발 (Ly6C-CD115 +) 다음에 추적 되었다 문화에 더 일을 2-3 (그림 3B-3D).
3 일 PH, Ly6C의 40%만을 정렬 하는 경우-CD115 + 셀 정렬 후 24 h (PS) (그림 3B) 안에 CD115 식 감소 했다. 48 h PS, 했다 다운-규제 CD115 분수 66% 이었고 72 h에 의해 세포의 70%가 표현이 형을 했다. 이 phenotypic 구성 유지 되었다 (70 ~ 72 %Ly6C-CD115-) 문화 (데이터 표시 되지 않음)의 추가 일 후에. 5 일 PH, 정렬 ~ 75% 했다 Ly6C-CD115-CD115-48 h 후 했다 24 h PS, ~ 80% 내에서 빠르게 다운 규제 CD115 데. 이 배포 후 72 h (그림 3C) 유지 되었다. 마지막으로, 7 일 PH, 정렬 때 다운 레 귤 레이 션 CD115의 매우 빠른도 했다. 24 h PS, 이내 셀 ~ 75% 아래로 CD115 식, 졌고이 추세 후 48 h (그림 3D) 유지 되었다. 흥미롭게도, 7 일에 정렬 하는 경우 CD115 식의 전반적인 수준 있던 CD115 + 인구 내의 셀에.
따라서 이러한 연구 결과 개발의 속도 다소 느린 초기 하루에 정렬할 때, 하루 등 3 정렬 더 급속 한 발전에 비해 전지와 차별화 5 또는 7에 정렬 한 후 관찰을 나타냅니다. 이러한 결과 바탕으로, 사용자가 moDC의 더 큰 숫자를 추구 한다 가능성이 하루 5 또는 7에 정렬.
DC의 성숙 응답 잘 설립된 6,7,,1214이다. 다양 한 병원 체 관련 된 분자 패턴 (PAMPs)로 치료 하면 미 숙 DC 최대-규제 MHC와 costimulatory 분자 프로 염증 성 cytokines의 식을 그들의 T 세포 활성화 용량 6강화. 그러나, 그것은 덜 분명 개발 셀 PAMP 자극 하 고 그들은 전시 수도 DC 성숙의 어떤 기능에 대응 하는 능력을 얻을. 정렬 된 인구 중 성숙 자극에 반응할 것을 확인 하려면 각 인구 나 PAMPs 폴 리 등의 칵테일 정렬 후 치료: C, lipopolysaccharides (LPS), 및 포장 소비재 DNA 수용 체 통행세 같이 (TLR) 3 (TLR3), 방 아 쇠를 TLR4 및 TLR9, 각각. 셀은 치료 (치료) 24 h에 대 한 그리고 CD86 및 MHCII의 표현을 cytometry (그림 4A-4B)에 의해 측정 되었다. 또한, 일리노이-12 p 40/70과 일리노이-6 생산 cytokine 배열 (그림 4C-4D) ELISA는 supernatants에서 측정 했다.
CMPs와 MHC 표현 GMPs 매우 낮은 수준의 클래스 II 그리고 CD86 unstimulated 상태에 이러한 표현 패턴 PAMPs (그림 4A 및 4B)의 칵테일에 노출 시 크게 변화 하지 않았다. 마찬가지로, MHC 종류 II는 monocytes에 의해 표현 되었고 또한 낮은 PAMP 노출 (그림 4A)에 따라 약간 변경. 그러나, CD86 표현 monocytes 24 h에 중간 정렬 후 이었고 더 다음 24 h 자극 증가. 높은 기저 식의 MHC 종류 II와 CD86 MoMacs와 MoDCs에서 관찰 되었다, 고 두 인구 전시 PAMP 자극 시 이러한 분자의 강한 유도. MHC 클래스 II 식 자극 다음에서 MoMacs와 MoDCs는 별개의 그룹을 형성 하는 동안 CMPs, GMPs, 및 monocytes, 통계 차이 했다. 그러나, CD86 식 점에서 CMPs GMPs 세포 했다 통계적으로 다른 MoMacs 및 MoDCs. 그러나, monocytes MoMacs 또는 MoDCs에 차이가 없었습니다.
우리는 다음 상대 5 인구의 각각의 생산 능력을 cytokines TLR 자극에 대 한 응답에서을 평가 하 고 싶었다. 따라서, 우리가 수행 cytokine 분석 결과 정렬 된 인구에 TLR 길 항 제 칵테일의 유무에서 문화 위에 사용 후. 셀 24 h에 대 한 자극으로 경작 했다 다음 supernatants 수집 했다. 우리는 아주 작은 IL-12 p 40/70 또는 일리노이-6 생산 CMPs TLR 자극 (그림 4C-4D) 시 관찰. 두 번째 인구 GMPs, IL-12 p 40/70 (그림 4C)을 생산 하지 못했습니다 하지만 이러한 세포 자극 PAMPs (그림 4D)에 의해 따라 일리노이-6의 낮은 금액을 생산. Cytokine 생산의 상부는 후자 3 개의 인구에서 관찰 되었다. Monocytes 그리고 MoMacs는 매우 비슷한 패턴 및 cytokine 생산의 규모를 했다. 둘 다 크게 증가 하는 IL-12 p 40/70 하 고 겸손 하 게 일리노이-6 생산 자극 (그림 4C-4D)를 증가. 흥미롭게도, PAMPs MoDCs 존재 증가 하지 않았다 IL-12 p 40/70 분 비; 그러나,이 인구는 크게 생산 일리노이-6 (그림 4C-4D) 증가 했다. 이러한 결과 정렬 된 인구 격리 후 그들의 면역 기능을 유지 나타냅니다.
그림 1: 사이드 흩어 게이트 대 앞으로 내 가능한 셀. 마우스 골 수에서 GM-CSF, 경작 했다 그리고 생존 7-AAD (7-아미노-악티노마이신 D) 수확 후 (PH)와 1, 3, 5 일 수확 후 얼룩을 사용 하 여 측정 했다. (A) 가능한 셀 생략 FSC 그리고 SSC에 기반 하는 작고 고도로 세분화 된 이벤트 게이트 (실용적)을 적용 하 여 선정 됐다. (B) 히스토그램 7 AAD 얼룩의 실용적 (FSC/SSC) 게이트 내의 이벤트에서 생성. 이벤트 7-AAD에 대 한 긍정적인 세포 apoptosis를 받은 나타냅니다. 화살표는 가능한 셀 게이팅 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Ly6C-CD115-인구 내의 림프 톨. GM-CSF에 마우스 골 수 배양 했다 그리고 림프 구 마커 (CD3, CD145R, 및 NK1.1) 매일 cytometry에 의해 분석 되었다. (A) 셀 Ly6C-CD115-셀을 식별 하는 Ly6C PE와 CD115 APC 물 했다. 사분면 게이트 단색 컨트롤에 따라 적용 됩니다. 모조 색상 도트 줄거리 하루 하루 6까지 수확 (0 일)의 하루에 Ly6C-CD115-셀의 0 (B) CD3, CD45R, 및 NK1.1 식 분석에서 생성 된. 셀 계산 흐름 cytometry 분석 소프트웨어를 사용 하 여 모드를 정상화 했다. 화살표 표시 Ly6C-CD115-게이팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: Ly6C의 개발의 활동-CD115 + 셀 다른 일에 정렬 후. (A) 마우스 골 수확 되었고 GM-CSF에서 경작. Aliquots 1 x 107 셀의 수확된 (B) (C) 5, 3, 또는 (D) 7 일 후 수확 (PH) 했다. 지정 일 PH, Ly6C-CD115 + 셀 혼합 문화 (사전 정렬) 정렬 되었고 즉시 분석 후 정렬 (PS). 정렬된 셀 GM-CSF에 다시 경작 그리고 Ly6C/CD115 식에서 변화 했다 cytometry 매일 분석. 상자와 화살표 정렬 게이트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: TLR 자극에 따라 성숙과 cytokine 식. 셀 5 인구로 GM-CSF에서 3 일에 정렬 했다. 그들은 다음 PAMPs의 칵테일으로 치료 했다 (LPS, 폴 리 나: C, 및 포장 소비재 DNA) 24 h. 의미 (A) MHC 종류 II의 형광 강도 (MFI)와 (B) CD86 정렬 후 (PS) 및 24 시간 여 PAMPs 없이 흐름 cytometry 즉시 분석 했다. 오차 막대는 3-5 복제 실험의 표준 편차를 나타냅니다. (C) IL-12 p 40/70과 supernatants 3 풀링된 샘플에서에서 (D) 일리노이-6와 PAMPs 없이 24 시간 후 cytokine 배열 점 오 애 란에 의해 측정 되었다. RLU; 상대 빛 단위; -/ + 지정 된 인구에 대 한 세포 표면 감 적의 존재를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 3 일 | 5 일째 | 7 일 | |||||
| 표현 형 | 셀 유형 | 분 | 최대 | 분 | 최대 | 분 | 최대 |
| Ly6C-CD115-CD11c- | CMP | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115 + | 모노 | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | MoDC | N/a | N/a | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
표 1: 최소 및 최대 셀 개수 당 1 x 107 셀 정렬 후 회복 예상. CMP (일반적인 골수성 原); GMP (granulocyte/macrophage 原) 모노 (monocytes); MoMac (monocyte 파생 된 대 식 세포); MoDC (monocyte 파생 된 모 수석 세포); N/a (사용할 수 없음); 최소 (1 x 107 세포에서 최소 셀 수확량); 최대 (1 x 107 세포에서 최대 셀 수확량).
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Discussion
이 프로토콜 GM-CSF 구동 시 조 및 전조 세포 유형 분석 생 화 확 적인 분석 실험, 세포 기능 시험관또는 주입 비보의 분석 실험 등의 여러 종류에 대 한 충분 한 숫자의 분리를 촉진 한다. 이 메서드는 신뢰할 수 있는 격리 및 식별이이 통로 그 차별화 된 셀 형식으로 개발의 초기에 셀의 더 일반적으로 사용 하는 monocyte 파생 된 모 수석 세포 개발의 분야에서 상당한 사전을 나타냅니다. 이전 연구에 격리.
창시자 및 생체 외에서 골 수에서 생성 하는 선구자의 격리에 대 한 이전 프로토콜 골수성 세포 18의 마커로 CD31와 Ly6C 얼룩 또는 증식 조상 세포 17 식별 CFSE 얼룩에 의존 . CFSE Naik에 의해 설명 하는 프로토콜을 얼룩이 지는 Flt3L 기반 DC 창시자와 선구자 17세대에 사용 하기 위해 설계 되었습니다. 우리 GM-CSF 문화 시스템에이 접근을 시도 했을 때 우리는 두 가지 주요 문제가 발생 했습니다. CFSE는 다소 개발 세포에 세포 독성 고 했다 그래서 밝은 (분할된 셀)에 보상을 어려운 만든 그것. 이 접근 방식은 높은 증식 (CMPs/GMPs) 고도로 발달된 (MoDC/MoMac) 하에서 발달 스펙트럼 셀 뿐만 아니라 초기 세포 유형 (창시자), 격리의 우리의 목표에 적합 하지 않을을 입증 했다. 우리는 또한 GM-CSF 기반 셀 CD31 Ly6C 18에 근거 했다 Leenen의 그룹에 의해 설명 된에 대 한 정렬 전략을 시도 했다. 그러나, 우리가 발견 CD31 문제가. 그것은 매우 낮은 수준 (인구 깨끗 한 정렬에 대 한 해결 하기 어려운 만들기)에서 표현 되었다 셀, 그리고 문화 기간 동안 초기만 vanishingly 작은 하위 집합으로. 사실, CD31 식 하루 2 GM-CSF 10문화의 과거 발견할 수 아니었다.
그러나 Ly6C,, 식 10의 변이 패턴으로 인해 개발의 다른 단계에서 세포를 분리 하기 위한 매우 유용한 분자 이었다. CD115의 추가 CD31 가능 했다 개발의 중간 및 저장 단계에서 세포를 더 밀접 하 게 분별을 사용할 수 있습니다. 우리는 또한 이러한 초기 셀 10의 큰 숫자를 분리의 희망 CD117, CD34 등 창시자의 다른 마커를 검사 합니다. 그러나, 달리 Flt3L 시스템에 보고, 우리는 발견 CD117, CD34 세포의 아주 작은 부분 집합에도 표현 되었다 거의 결 석 했다 문화 17의 3 일에 의해. 그러나 이러한 줄기 세포 마커 미래 연구에 유용한, CMP 또는 GMP 인구 내에서 하위 집합을 구별할 수 있습니다.
몇 가지 잠재적인 수정 원하는 세포 인구의 수익률에 영향을 미칠 수 있습니다 프로토콜을 확인 하 고 있습니다. 첫째, 사용자는 어떤 죽은 세포를 제외 하는 생존 얼룩에 적용할 선택할 수 있습니다. 관측을 바탕으로, 전형적인 앞으로 및 사이드 분산형 게이트 내에서 죽은 세포의 상대적으로 낮은 일반적 이며 문화, 혈통 긍정적인 세포 감소와 일치의 처음 몇 일 동안에 문제를 제기. 그러나, 어느 셀에 숫자 정확 해야 응용 프로그램에 대 한 생존 얼룩 죽은 세포의 배제를 보장 합니다.
두 번째 잠재적인 수정 문화 전에 리니지 양성 세포의 고갈 이다. 우리는 정기적으로 Ly6C-CD115-세포 인구에서 관찰 된 혈통 긍정적인 세포의 작은 인구를 해결 하기 위해이 방법을 시도 했다. 전체 셀 항복 했다 5, 6, 일에서 약간 낮은 고 순도 상당히 높은 (데이터 표시 되지 않음). 따라서, 순도 감소 된 수확량을 정당화 하지 않았다. 마찬가지로, 사용자, 정렬 5 일에 또는 후에 계획 하는 경우 문화 내에서 세포의 주파수 1% 아래 이며 문제를 선물 하지 해야 합니다.
마지막으로,이 전략은 분리 하도록 설계 되었습니다 때문에 큰 발달 스펙트럼 사용자 셀 최대한 원하는 인구의 많은 수집에 그들의 정렬의 타이밍에 맞게 한다. 이 정렬 전략 충실 하 게 문화의 셀 정렬 됩니다 하루에 표시 된 셀 형식을 생성 합니다. 여부 그들은 정렬 하 고 하루 3 또는 5의 문화에 고립 된 마찬가지로 GMP 표현 형 및 기능 사실 Ly6C + CD115-CD11c-는 표현 형으로 세포 예를 들어. 그러나,이 세포의 주파수 이므로 보다 훨씬 날 3에 5, 3 일에 정렬을 권장 것 이다 목표 고립이 셀 형식의 경우. 그것은 또한 주목할 만한 셀 경우 그들은 5 또는 7 (그림 3)에 정렬 했다 보다 느린 속도와 연속적인 발달 단계를 통해 3 일 진행에 정렬.
이 메서드는 명확한 묘사 그리고 발달 스펙트럼을 따라 5-6 가지 인구의 고립에 대 한 수 있습니다, 하는 동안 많은 더 많은 인구 또는이 통로 따라 과도 적인 단계 가능성이 있다. 각 5 개의 설명된 인구 개발의 약간 다른 단위에서 여러 하위 인구 수 있습니다. 예를 들어 우리는 "고유" 중간 수준으로 CD115와 Ly6C는 인구 얼마나 많은 moMac와 moDC는 측면에서 개발의 약간 다른 패턴을 받아야 생성 (데이터 표시 되지 않음) 관찰. 그것은 또한 인구를 이전 vivo에서 문화 및 분류 시스템에 존재 하지만 이들은 그들의 매우 낮은 주파수 때문에 식별 하기 어려운 되었습니다 관찰 가능성이. CMOP 19, 민주당 20또는 CDP 21 등 인구 가능성이 현재, 하지만 더 큰 인구 이내 가려질 수 있습니다. 미래 연구 차별화의 특정 마커를 추가이 정렬 프레임 워크 내에서 고립 될 수 있는 수많은 발달 단계를 더 명확 하 게 필요 합니다. 이 정렬 전략의 값은 DC 그렇습니다 동안 발달 단계로의 큰 숫자의 일관 된 절연을 허용 한다.
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Disclosures
저자는 공개 충돌이 있다.
Acknowledgments
우리는 앨리슨 교회 새에 어 번 대학교 학교의 수의학 흐름 Cytometry 시설, 오 번 대학에서 분자 생물학 프로그램 및 휴대 하는 NIH에서 EHS R15 R15 AI107773 하 고 자금에 대 한 기술 지원에 대 한 감사 여름 연구 자금 PBR을에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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