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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Erzeugung einer großen Zahl von myeloischen Vorläuferzellen und dendritischen Zellen Vorstufen aus murinen Knochenmark mit einer neuartigen Zelle Sortieren Strategie

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57365
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Auburn University

Summary

Hier bieten wir eine Methode zum Identifizieren und isolieren große Zahlen von GM-CSF myeloische Zellen unter Verwendung von high-Speed Zellsortierung angetrieben. Fünf verschiedene Populationen (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen, Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen, Monozyten, Monocyte abgeleitet Makrophagen und Monocyte abgeleitet DCs) können identifiziert werden, basierend auf Ly6C und CD115 Ausdruck.

Abstract

Kulturen der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC) generiert aus Maus Knochenmark mit Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) haben vor kurzem erkannt worden, heterogener als zuvor geschätzt werden. Diese Kulturen enthalten routinemäßig MoDC sowie Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und sogar einige weniger entwickelten Zellen wie Monozyten. Das Ziel dieses Protokolls ist es, bieten eine einheitliche Methode zur Identifizierung und Trennung von den vielen Zelltypen in diesen Kulturen, wie sie sich entwickeln, so dass ihre spezifischen Funktionen weiter untersucht werden können. Die hier vorgestellten sortierungsstrategie trennt Zellen zuerst in vier Populationen basierend auf Ausdruck der Ly6C und CD115, die vorübergehend von Zellen exprimiert werden, wie sie in der GM-CSF-orientierte Kultur zu entwickeln. Diese vier Populationen gehören gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen CMP (Ly6C, CD115), Granulozyten/Makrophagen Stammväter oder GMP (Ly6C +, CD115), Monozyten (Ly6C +, CD115 +), und Monocyte-abgeleiteten Makrophagen oder MoMac (Ly6C, CD115 +). CD11c ist auch hinzugefügt, um die Sortierung Strategie, zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115-Bevölkerung zu unterscheiden: CMP (CD11c-) und MoDC (CD11c +). Zu guter Letzt können zwei Populationen innerhalb der Ly6C-CD115 + Bevölkerung basierend auf der Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck weiter unterschieden werden. MoMacs express untere Ebenen der MHC-Klasse II, während ein Monocyte abgeleitet-DC-Vorläufer (MoDP) höheren MHC Klasse II drückt. Diese Methode ermöglicht die sichere Trennung von mehreren Entwicklungsgeschichtlich verschiedene Populationen in Zahlen für eine Vielzahl von Funktions- und Entwicklungsstörungen Analysen ausreichend. Wir zeigen eine solche funktionelle auslesen, die differenzierten Antworten dieser Zelltypen auf Stimulation mit Pathogen-Associated molekulare Muster (PAMPs).

Introduction

Kultivierung der murinen Knochenmarkzellen mit dem Zytokin ist Granulozyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF) als eine Methode verbreitet Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen (MoDC; auch bekannt als entzündliche DC) in großer Zahl 1zu generieren, 2,3,4,5. Diese Zellen sind sehr nützlich in einer Vielzahl von Studien von dendritischen Zellen (DC) Funktion 6,7,8gewesen. In der Regel diese murinen Knochenmarkzellen für 6-8 Tage kultiviert werden und dienen dann zur Studie von dendritischen Zellen Funktion 5. Diese Kulturen war lange vor allem homogen, bestehend aus einer Mehrheit von differenzierten MoDC betrachtet worden. Vor kurzem, ist deutlich geworden, dass am Ende dieser 6 – 8 Tage Kultur gibt es in der Tat viele MoDC, sowie einen großen Teil der differenzierten Monocyte abgeleiteten Makrophagen (MoMacs) 9,10,11. Unsere eigenen Studien haben diese Ergebnisse zeigen, dass andere Teilmengen von weniger entwickelten Zellen, wie MoDC Vorstufen (MoDP) und Monozyten, in den Kulturen bei niedriger Frequenz auch nach 7 Tagen 10 bleibenweiter ausgebaut. Somit konnten Studien von dendritischen Zellen (DC)-Funktion, die mit Zellen, die durch dieses System erzeugt die Antworten einer größeren Kohorte von Zelltypen reflektieren, als bisher angenommen.

Wir haben sehr viel gelernt aus der Studie von GM-CSF-generierte MoDC in Bezug auf die Funktion dieser Zellen in der Endphase der Differenzierung 12,13,14. Wir verstehen jedoch deutlich weniger über der Entwicklung weg von diesen Zellen 2,15,16 und des wie und wann sie spezifische weisen Funktionen wie: Reaktionsfähigkeit auf Pathogen Associated Molecular Muster (PAMPs), Phagozytose, Antigen Verarbeitung und Präsentation 13und antibakterielle Aktivität. Ein Protokoll für die Isolierung einer großen Zahl von konventionellen Flt3L angetrieben DC Stammväter und Vorläufer wurde gemeldeten 17. Isolierung von diesen unterschiedlichen Populationen wurde erreicht mit Carboxyfluorescein Succinimidyl Ester (CFSE-)-gebeizt Knochenmarkzellen (um teilenden Zellen zu verfolgen) und Kultur in Flt3L für 3 Tage. Zellen wurden aus positiven Zellen erschöpft und in Vorläufer und Wegbereiter Populationen basierend auf CD11c Ausdruck 17sortiert. Ein anderer Ansatz von Leenen Gruppe, frühen Vorfahren der DC in der GM-CSF-orientierte Kultur zu identifizieren war, basierte auf CD31 und Ly6C 18Zellen Sortieren. Das ursprüngliche Ziel war die Schaffung eine ähnliche Methode für den Erhalt der Stammväter und Vorstufen von GM-CSF-orientierte MoDC. Aufgrund der spezifischen Zelltypen von GM-CSF generiert passten wir das Konzept und Sortierung Strategie basierend auf Ausdruck der Moleküle, die in frühen und späteren Phasen der Entwicklung zum Ausdruck gebracht wurden. Wir bestimmt letztlich, Ly6C, CD115 (CSF-1-Rezeptor), und CD11c wurden die besten Marker für diese Zelle Unterscheidung 10Typen.

Hier präsentieren wir eine Methode zur Isolierung von Zellen auf mehrere Phasen der Entwicklung den Weg der Differenzierung, angetrieben von GM-CSF: gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen (CMP), Granulozyten-Makrophagen Vorläuferzellen (GMP), Monocyte, Monocyte-abgeleiteten Makrophagen (MoMac) und DC (MoDC) Monocyte-abgeleitet. Die MoMac Bevölkerung kann weitere basierend auf Ebene der MHC-Klasse II Ausdruck getrennt werden enthüllt eine MoDC Vorläufer Bevölkerung (MoDP) 10. Wir nutzen eine High-Speed-Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS) Strategie um diese 5 Populationen anhand der Ausdruck Ly6C, CD115 und CD11c zu isolieren. Wir zeigen dann die Prüfung dieser Zellen im funktionellen Assays enthüllt ihre Reaktionen auf PAMP Stimulation.

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Protocol

Alle tierische Arbeit wurde von der Auburn University institutionelle Animal Care und Nutzung hat in Übereinstimmung mit den Empfehlungen für die Pflege und Verwendung von Labortieren von den National Institutes of Health in der Anleitung aufgeführten genehmigt.

1. Vorbereitung für Knochenmark-Sammlung

  1. Bereiten Sie 250 mL komplette Medien durch Zugabe einer Lösung von Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Medium mit 10 % fetalen Kälberserum, 2 mM Glutamin und 50 µM 2-Mercaptoethanol an die Spitze einer 0,22 µm Vakuumfilter Kolben Einheit ergänzt, und gelten Sie Vakuum.
    Hinweis: Komplette Medium kann bei 4 ° C bis zu 2 Monaten aufbewahrt werden.
  2. Bereiten Sie 70 % Ethanol Lösung durch Mischen von 350 mL 100 % Ethanol mit 150 mL sterile H2O in eine 500 mL-Flasche.
  3. Set Zentrifuge bis 4 ° C.
  4. Sterilisieren Sie, Pinzette, Skalpell und Schere in 70 % igem Ethanol.
  5. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 5 mL komplette Medien zu drei 60 mm Petrischalen.
  6. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 30 mL komplette Medien in ein 50 mL konische Röhrchen.

2. Sammlung von murinen Knochenmarkzellen

  1. Einschläfern Sie eine C57BL/6-Maus von CO2 Narkose gemäß der Regeln, die 2013 American Veterinary Medical Association (AVMA) Leitlinien zur Euthanasie.
  2. Entfernen Sie und Streifen Sie Hinterbeine.
    1. Sättigen Sie die Hinterbeine und Torso mit 75 % Ethanol und machen Sie flachen Schnitt durch die Haut rund um das Hüftgelenk mit gebogenen Gewebe Schere. Mit Pinzette, fest ziehen Sie die Haut aus der Hüfte nach unten in Richtung Knöchel, offenbart des Muskels. Mit einer Schere um die Hautlappen zu entfernen.
    2. Entfernen Sie das gesamte Hinterbein durch Durchtrennung des Knochens oberhalb des Femur/Hüftgelenks.
      Hinweis: Neben der Sterilisation der Gegend, das Ethanol wird Hilfe bei der Bereitstellung sauberer Schnitten und verhindert, dass Haare Kontamination der Proben.
    3. Wenn die Beine an einen neuen Speicherort für die Knochenmarkentnahme übertragen werden, Tauchen Sie die Beine in komplette Medien.
  3. Arbeiten in einem sterilen Biosafety Schrank, die Beine auf eines der zuvor vorbereiteten Petrischalen übertragen.
  4. Mit einer Schere schneiden Sie die gerade unterhalb des Knöchels und vorsichtig so viel Muskeln und elastische Bindegewebe wie möglich entfernen. Übertragen Sie die gereinigten Knochen auf der zweiten vorbereiteten Petrischale.
    Hinweis: Obwohl es nicht notwendig, den Muskel zu entfernen, kann zu viel verbleibende Gewebe zu spülen, das Knochenmark erschweren.
  5. Trennen Sie die Oberschenkel, Knie und Schienbein.
    1. Mit Pinzette, halten Sie das Bein am Knie und suchen Sie das Knochenmark.
      Hinweis: Knochenmark sollte als eine schwache rote Linie in den Knochenhohlraum an der Spitze des Oberschenkelknochens und gegen Ende des Schienbeins sichtbar sein.
      1. Mit Schere, machen Sie drei Schnitten wie folgt.
        1. Schneiden Sie die Tibia oberhalb wo das Knochenmark zu enden scheint.
        2. Schneiden Sie direkt unterhalb des Kniegelenks.
        3. Schneiden Sie oberhalb des Kniegelenks.
        4. Wenn das Hüftgelenk noch in den Oberschenkelknochen verbunden ist, schneiden Sie direkt unterhalb des Hüftgelenks.
      2. Die drei Fragmente, die Petrischale zurück und wiederholen Sie diesen Vorgang am anderen Bein.
  6. Spülen Sie Knochenmark von Femur und Tibia.
    1. Komplette Medien aus dem 50 mL konische Rohr und Verschluss eine 10 mL Spritze mit Nadel 23 G einfüllen.
    2. Halten Sie die Knochen mit der Pinzette oberhalb der dritten vorbereiteten Petrischale, Stechen Sie die Nadel in den knochenkanal und schieben Sie Medien durch ausspülen der Zellen (die als eine intakte "Stecker" oder als mehrere Cluster auftreten könnten). Wiederholen Sie, bis keine mehr Farbe durch den Knochen gesehen werden kann. Füllen Sie die Spritze mit Medien wie nötig.
  7. Zerdrücken Sie die Epiphysen.
    1. Während noch in der zweiten Petrischale die Kniescheibe mit Zange festhalten, und die Knie mit der Spitze der Spritze Maische. Fortgesetzt, bis die Epiphysen nicht mehr rot sind.
  8. Mit der Spritze, die Zellen aus der zweiten und dritten Petrischale auf der 50 mL Tube übertragen. Trennung von Klumpen durch sanft auf und ab pipettieren. Versuchen Sie nicht, die Bläschen zu erzeugen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
  9. Lyse der roten Blutkörperchen
    1. Überstand mit serologischen Pipette entfernen, vertreiben Pellets durch streichen und lyse der roten Blutkörperchen durch Inkubation in 1 mL der ACK (Ammonium-Chlorid-Kalium) Lysis Puffer für 1 min bei Raumtemperatur.
    2. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 40 mL HBSS (Hanks ausgewogen Salzlösung) Puffer.
  10. Mit einer serologischen Pipette, Filtern Sie die Zellen zwar ein 70 µm Zelle Sieb in ein neues 50 mL konische Röhrchen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
  11. Mit einer serologischen Pipette entfernen Sie überstand und waschen Zellen mit 40 mL komplette Medien. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
    Hinweis: In diesem Stadium können Linie positive Lymphozyten durch FACS oder magnetische Spalte Reinigung entfernt werden. Lymphozyten werden jedoch nicht langfristig in Kultur beibehalten. Obwohl eine große Anzahl von Linie positive Zellen in der Ly6C-CD115-Bevölkerung im Knochenmark ex Vivovorhanden sind, fehlen fast alle bis zum Tag 5 (Abbildung 2).
  12. Mit einer serologischen Pipette, Entfernen des Überstands und Kultur die Knochenmarkzellen in komplette Medien mit 10 ng/mL rekombinanter Maus GM-CSF bei einer Dichte von 1 x 106 Zellen/mL.
    Hinweis: In der Regel 4 x 107 total Zellen nach Lyse der roten Blutkörperchen geerntet werden können. Jedoch erwarten, dass so wenig wie 2 x 107 für Anfänger und bis zu 5 x 107 Zellen für erfahrene Erntehelfer.
  13. Mit einer serologischen Pipette, die Zellen auf Gewebekultur Platten übertragen und Inkubation bei 37 ° C in 5 % CO2. Wenn jeder Samen mit einer 24-Well-Platte mit 2 mL Zellsuspension.
  14. Alle 48 h, verwenden einer serologischen Pipette, um Hälfte der Medien zu entfernen und ersetzen Sie durch frische komplette Medien- und GM-CSF.
    Hinweis: Kulturen können bis 9 Tage gehalten werden. Zusammensetzung ändert sich jedoch im Laufe der Zeit. Weitere Informationen finden Sie unter Abschnitt 3.

3. Wahl der Tag Art

  1. Wenn Zelle Bevölkerung Kompositionen im Laufe der Zeit ändern, wählen Sie einen Tag, der die höchste Anzahl der gewünschten Zellen ergibt.
  2. Siehe Tabelle 1 für die erwartete Zelle Ausbeute Post Art für jede der Bevölkerung nach 3, 5 und 7 Tage der Kultur in GM-CSF pro 1 x 107 Zellen.

(4) Färbung Strategie

  1. Verwenden Sie kleine aliquoten Zellen Kontrollproben vorzubereiten. Gehören eine ungefärbte Steuerung, Entschädigung Kontrollproben gebeizt mit jeweils nur eine fluoreszierende Antikörper und Fluoreszenz-Minus-eins steuert, in welcher alle Antikörper mit einer Ausnahme, Steuern für unspezifische Fluoreszenz in diesem Kanal hinzugefügt werden. Wenn mit indirekten Kennzeichnung umfassen primär allein, allein, Sekundär und sowohl primäre als auch sekundäre.
    Hinweis: Phycoerythrin (PE) und Allophycocyanin (APC) getaggt Antikörper bieten klare Trennung mit minimal bluten über, wenn Sie zusammen verwendet. Jedoch wenn Fluorochrom Möglichkeiten begrenzt sind, wird CD115 auf einem relativ niedrigen Niveau ausgedrückt, während Ly6C auf sehr hohem Niveau zum Ausdruck kommt. Daher sind wünschenswert für Anti-CD115, heller Fluorochromes und Anti-Ly6C Fluorochromes werden ausgewählt, um bluten zu verhindern.
  2. Bereiten Sie 100 mL von FACS Wash Buffer (FWB) durch Mischen 97 mL gekühlten Dulbecco Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) mit 3 mL fetalen Kälberserum in einem 50 mL konische Röhrchen, und legen Sie in ein Eisbad.
  3. Verwenden Sie eine Pipette, um sanft, aber gründlich, pipette Zellen nach oben und unten, um alle Lose adhärenten Zellen verdrängen.
  4. Mit einer serologischen Pipette, Zellen auf eine 50 mL konische Rohr übertragen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
    1. Wenn Zelle Volumen 50 mL übersteigt, übertragen Sie Zellen zu, um die notwendige Anzahl von Rohren und bei der Färbung Schritt kombinieren.
  5. Vorsichtig den überstand Gießen Sie ab und waschen Sie die gebeizte Zellen durch Zugabe von 30 mL der FWB mit einer serologischen Pipette. Bei 250 X g bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren Sie, und wiederholen Sie die Wäsche.
    Hinweis: Bei hohen Zelltod zu erwarten ist, Zellen können gewaschen mit FWB mit so niedrig wie 0.5 % fetalen Kälberserum (FCS). Dies verhindert Verklumpung der Zelle.
  6. Aussetzen Sie und beflecken Sie Zellen pro Antikörper des Herstellers.
    1. Auszusetzen Sie 5 x 107 Zellen in 1 mL der FWB und fügen Sie 2 µg Anti-Ly6C und Anti-CD115 mit Fluorophore (nach Wahl des Forschers) gekennzeichnet. Um weitere CMP von MoDC unterscheiden (beide sind Ly6C- und CD115-), fügen Sie 2 µg Anti-CD11c Antikörper (CMP sind CD11c-; MoDC sind CD11c+). Inkubieren Sie für 30 min auf Eis.
      Hinweis: Abbildung 3 wurde mit Ly6C-PE und CD115-APC erstellt.
  7. Fügen Sie mithilfe einer serologischen Pipette 10 mL der FWB und Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
  8. Vorsichtig den überstand Gießen Sie ab und waschen Sie die gebeizte Zellen durch Zugabe von 30 mL der FWB mit einer serologischen Pipette. Bei 250 X g bei 4 ° C für 10 min zentrifugieren Sie, und wiederholen Sie die Wäsche.
  9. Vor der Aussetzung der Zellen, flick Rohr gründlich, um die Pellets zu verdrängen. Verwenden Sie eine serologische Pipette Zellen 1 x 107 Zellen/ml der FWB auszusetzen, und durch 35 µm Zelle Filter filtern. Verwenden Sie eine serologische Pipette gefilterten Zellen in Polypropylen-Rohr übertragen und auf Eis legen, bis bereit zu sortieren.
    Hinweis: Polypropylen nicht verfügbar ist, können verbindliche reduzieren Protein beschichtet (fettfreie Trockenmilch oder FCS) Polystyrol Rohre verwendet werden.

5. Stellen Sie anhand der Kontrollproben Tore

Hinweis: Um Zellaufschluss durch den Druck des High-Speed-Durchfluss zu verhindern, verwenden Sie eine 100-130 µm Düse für Zellsortierung.

  1. Führen Sie die ungefärbte Kontrolle (siehe Punkt 4.1) durch die Zelle Sorter, und wenden Sie ein Tor um kleine Trümmer (niedrige forward Scatter; auszuschließen FSC) und sehr körnig (high-Side Scatter; SSC) Teilchen.
    1. Um nur den späteren Stadien (Monozyten, MoMac/MoDP und MoDC) zu analysieren, gelten Sie gating um nur größere Zellen (hohe FSC) erweitert.
    2. Wenn Lebensfähigkeit Flecken verwendet werden, verwenden Sie diese gefärbt, nicht lebensfähige Ereignisse ausschließen (ein Beispiel ist in Abbildung 1dargestellt).
  2. Der Cell Sorter einzelne fluoreszierende Kontrollproben durchlaufen, und Entschädigung nach Bedarf anpassen.
  3. Einen Probelauf der Multi-Label-Probe. Vier verschiedene Populationen zu beobachten: Ly6C + CD115-(GVP), Ly6C + CD115 + (Monozyten), Ly6C-CD115 + (MoMacs/MoDP), und Ly6C-CD115 - (CMPs/MoDCs). Wenden Sie ein Tor um jeden der vier großen Populationen zu isolieren.
    Hinweis: CMPs und MoDC teilen den Ly6C-CD115-Phänotyp. Jedoch können sie basierend auf CD11c Ausdruck differenziert werden: CMP fehlt CD11c, während MoDCs CD11c auszudrücken.

6. Erhebung von isolierten Populationen

  1. Bereiten Sie Röhrchen durch Zugabe von genügend FCS um mindestens 20 % zu erreichen Endkonzentration Wenn Sie voll. Beispielsweise wenn Sie 5 mL Röhrchen verwenden, fügen Sie 1 mL FCS vor dem Sortieren und entfernen Sie das Rohr zu, wenn es 5 mL Gesamtvolumen erreicht.
  2. Zur Vermeidung von Membran-Umsatz und Antikörper-Aufnahme halten Sie alle Proben (gemischt und sortiert) bei 4 ° C in der Art.
    1. Wenn dies nicht möglich ist, halten Sie das Rohr mit der Zellen, um Aliquote auf dem Sorter übertragen, je nach Bedarf und auf Eis so viel wie möglich sortiert werden.
    2. Darüber hinaus übertragen Sie sortierte Proben alle 20-30 Minuten zu Eis.
  3. Nachdem die gewünschte Anzahl von Zellen gesammelt wurden, verwenden einer serologischen Pipette, die Zellen auf eine neue konische Rohr übertragen. Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 Minuten.
    1. Reinheit mit Post-Art Analyse auf kleine Aliquote aus jedem erfassten Bevölkerung zu bestätigen.
  4. Den überstand zu entfernen, in 10 mL der FWB und Zentrifuge bei 250 X g bei 4 ° C für 10 min. wiederholen für eine Gesamtmenge von zwei Wäschen auszusetzen.
    Hinweis: Es ist schwierig, den überstand zu entfernen, ohne die Pellets verdrängen. Anbringen einer PIPETTENSPITZE zu einer Vakuumleitung kann mit der Entfernung helfen. Wenn diese nicht verfügbar ist, wird vorgeschlagen, dass der Überstand in einem frischen Rohr bei Pellet Dissoziation gesammelt werden.
  5. Entfernen Sie den überstand nach der zweiten Wäsche.
  6. Wenn der Benutzer experimentelles Design die Zellen wieder kultiviert werden diktiert, Schritte 2.12 – 2.14. Andernfalls, wenn Zellen zur sofortigen Untersuchung verwendet werden, bereiten Sie Zellen nach gewünschten Protokoll.
    Hinweis: Ein Beispiel für typische Funktionsanalyse ist in Abbildung 4enthalten.

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Representative Results

In dem Bemühen, so viele Kanäle wie möglich, lebensfähigen Zellen zur Analyse zur Verfügung zu halten wurden routinemäßig basierend auf vorderen und seitlichen streuen, ohne sehr klein und sehr granular Ereignisse (ein typisches Tor gilt für alles, was der Punkt in Abbildung 1AGrundstücke) ausgewählt. Um festzustellen, ob diese gating Strategie zuverlässig abgestorbene Zellen ausgeschlossen, gebeizt wir mit 7-Amino Actinomycin D (7-AAD) (Abbildung 1 b). 7AAD Flecken DNA in Tote und sterbende Zellen aufgrund Membranpermeabilität und durch lebensfähige Zellen ist ausgeschlossen. Lebensfähigkeit des GM-CSF kultivierten knochenmarkszellen analysiert wurde, sofort nach der Ernte (PH) und 1, 3 und 5 Tel. Zelle PH sofort analysiert hatte etwa 10 % der 7-AAD positive Zellen als eine typische FSC/SSC-Tor aus dem Knochen auf frisch isolierte Zellen angewendet wurde Knochenmark (Abbildung 1, nach der Ernte). Ein ähnlicher hoher Anteil der abgestorbenen Zellen war auch bei Tag 1 (~ 12 %) und 3 (~ 11 %) Kultur (Abbildung 1, 1 Tag PH und 3 Tage PH). Bis zum Tag 5 verringerte sich die Zahl der toten Zellen innerhalb des Gates auf ~ 5 % (Abbildung 1, 5 Tage PH). So eignet sich mit solch einem Lebensfähigkeit Tor in der Regel für die Sortierung am 5. Tag und nach. Wenn Benutzer in ihrem verfügbaren Parameter begrenzt sind, deshalb FSC/SSC Anspritzung in der Regel geeignet. Jedoch für empfindlichere Assays (insbesondere, wenn sie sich auf präzise Zellzahlen verlassen) einen Lebensfähigkeit Fleck (Vorschlag) zu integrieren.

Viele Protokolle für die Vermehrung von dendritischen Zellen empfehlen Erschöpfung der Linie positive Zellen, vor allem Lymphozyten aus dem Knochenmark vor Kultur 11,17. Dieses Verfahren wird gedacht, um die Reinheit der Zellen wiederhergestellt auf GM-CSF-vermittelten Differenzierung zu erhöhen. In der Regel Zellen mit dem Ausdruck Markierungen von T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD45R oder CD19) und NK-Zellen (NK1.1) können durch positive Selektion mit magnetischen Beads oder Zelle Sortieren 11,17,18erschöpft sein. Jedoch wurden basierend auf der Kultivierung System, Lymphozyten selten wiederhergestellt oder in diesen Tests nachgewiesen. So haben wir versucht, die Langlebigkeit der Lymphozyten gepflegt in der Ly6C-CD115-Bevölkerung unter der GM-CSF-orientierte Zellen (Abbildung 2A) zu beurteilen. GM-CSF kultiviert des Knochenmarks, die Zellen (die nicht Linie erschöpft gewesen war) mit Antikörpern CD3, CD45R und NK1.1 (in der gleichen Fluorophor) gefärbt waren und täglich durch Durchflusszytometrie (Abbildung 2 b) gemessen. Innerhalb der Ly6C-CD115-Bevölkerung beibehalten CD3/CD45R positive Zellen stark durch Tage 0-3 (Abb. 2 b). Am 4. Tag nur ein paar positive Zellen CD3/CD45R blieb und bis zum Tag 5 und 6, gab es keine CD3/CD45R mit dem Ausdruck Zellen vorhanden. So, innerhalb von 4 Tagen der Kultur in GM-CSF, Linie positive Zellen im wesentlichen fehlten und wurden nicht an Tag 5 und 6 der Kultur überhaupt erkannt.

Die Zusammensetzung der GM-CSF-orientierte Zellkultur ändert sich täglich in diesem System als die Zellen entwickeln und differenzieren (Tabelle 1; ( Abbildung 3). Zu frühen Zeitpunkten die am häufigsten vorkommenden Zellen sind Vorläufer und Vorstufen, und später mal der Großteil der Zellen sind differenzierter 10. Um festzustellen, wie Sortierung an verschiedenen Tagen der Kultur der späteren Entwicklungsstörungen Pfad oder Kinetik auswirken wird, wurden die möglichen 3, 5 und 7 Tagen PH (Abbildung 3A) durchgeführt. Die Entwicklung der MoMac Bevölkerung (Ly6C-CD115 +) wurde dann verfolgt über 2 – 3 weitere Tage in Kultur (Abb. 3 b-3D).

Wenn 3 Tage PH, nur 40 % der Ly6C sortiert-CD115 + Zellen CD115 Ausdruck innerhalb von 24 h nach Art (PS) (Abb. 3 b) abgenommen hatte. 48 h PS der Bruch, der nach unten-CD115 reguliert hatte lag bei 66 % und 72 h, 70 % der Zellen hatte diesen Phänotyp. Diese phänotypischen Komposition wurde beibehalten (~ 70-72 % Ly6C - CD115-) auch nach weiteren Tagen Kultur (Daten nicht gezeigt). Wenn 5 Tage PH sortiert, ~ 75 % der Zellen wurden Ly6C - CD115 - waren, die schnell nach unten reguliert CD115 innerhalb 24 h PS und ca. 80 % CD115 - nach nur 48 h. Diese Verteilung wurde nach 72 h (Abbildung 3) beibehalten. Schließlich wurde bei 7 Tagen PH sortiert, Down-Regulierung des CD115 auch ziemlich schnell. Innerhalb von 24 h PS ~ 75 % der Zellen hatte nach unten reguliert CD115 Ausdruck, und dieser Trend hielt nach 48 h (Abbildung 3D). Interessanterweise war, als am 7. Tag sortiert, das Gesamtniveau der CD115 Ausdruck niedriger auf die Zellen innerhalb der CD115 + Bevölkerung.

So, diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Kinetik der Entwicklung etwas langsamer sind, wenn an einem frühen Tag sortieren, z. B. Tag sortiert 3 Zellen im Vergleich zu der Entwicklung und Differenzierung nach Sortierung am Tag 5 oder 7 beobachtet. Basierend auf diesen Ergebnissen, sollten Benutzer, die größere Anzahlen von MoDC suchen wahrscheinlich Art am Tag 5 oder 7.

Die Reifung Reaktion der DC ist gut etabliert, 6,7,12,14. Wenn Sie mit einer Vielzahl von Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) behandelt, unreifen DC bis-Regeln den Ausdruck des MHC, costimulatory Moleküle und Pro-inflammatorischen Zytokinen, Verbesserung ihrer T-Zell-Aktivierung Kapazität 6. Es ist jedoch weniger klar, wenn entwickelnde Zellen gewinnen die Kapazitäten zur Reaktion auf PAMP Stimulation und welche Funktion von DC Reifung sie ausstellen könnte. Um festzustellen, welche der sortierten Populationen auf Reifung Reize reagieren würde, wurde kurz nach der Sortierung mit einem Cocktail von PAMPs einschließlich Poly ich jeder Bevölkerung behandelt: C, Lipopolysacchariden (LPS) und CpG-DNA, Toll-Like-Rezeptor (TLR) 3 (TLR3) auszulösen TLR4 und TLR9, beziehungsweise. Zellen wurden 24 h behandelt (oder unbehandelt) und Ausdruck der CD86 und ARBEITSPLATZAUSSTATTUNG wurde durch Durchflusszytometrie (Abbildung 4A-4 b) gemessen. Darüber hinaus wurde IL-12 p-40/70 und IL-6-Produktion in die Überstände von Zytokin-Array ELISA (Abbildung 4-4D) gemessen.

CMPs und GVP ausgedrückt sehr niedrige Niveaus von MHC-Klasse II und CD86 in eine unstimulierte Staat, und dieser Ausdruck Muster bei Kontakt mit der Cocktail aus PAMPs (Abb. 4A und 4 b) nicht wesentlich ändern. Ebenso war die Expression von MHC-Klasse II durch die Monozyten auch niedrig und geänderte wenig bei PAMP Exposition (Abb. 4A). Jedoch der Ausdruck der CD86 war mäßig auf die Monozyten 24 h nach dem Sortieren, und es weiter nach 24 h Stimulation erhöht. Höheren basalen Expression von MHC Klasse II und CD86 in den MoMacs und MoDCs wurde beobachtet, und beider Völker stellte eine starke Induktion dieser Moleküle nach PAMP Stimulation. In Bezug auf die MHC-Klasse II Expression nach Stimulation gab es kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den CMPs GVP und Monozyten, während die MoMacs und MoDCs eine eigenständige Gruppe bildete. Doch in Bezug auf die CD86 Expression wurden die Zellen CMPs und GVP statistisch anders als MoMacs und MoDCs. Monozyten unterschieden sich jedoch nicht als MoMacs oder MoDCs.

Als nächstes wollten wir die relative Fähigkeit einer jeden der fünf Populationen zu produzieren Zytokine in Reaktion auf die TLR Stimulation zu beurteilen. So führten wir einen Zytokin-Assay auf die sortierten Bevölkerung nach Kultur in das Vorhandensein oder Fehlen der TLR-Agonisten cocktail oben verwendet. Zellen mit den Reizen für 24 h kultiviert wurden, dann Überstände wurden gesammelt. Wir beobachteten sehr wenig IL - 12 p 40/70 oder IL-6-Produktion von CMPs nach TLR Stimulation (Abbildung 4-4D). Die zweite Population, GVP, waren nicht in der Lage, IL-12 p-40/70 (Abbildung 4) zu produzieren, aber diese Zellen produziert eine geringe Menge an IL-6 nach Stimulation durch PAMPs (Abbildung 4). Produktion von Zytokinen auf höchstem Niveau wurden in den letzten drei Populationen beobachtet. Monozyten und MoMacs hatten sehr ähnliche Muster und Größen der Produktion von Zytokinen. Beide stark erhöhte IL - 12 p 40/70 und bescheiden erhöhte IL-6 Produktion bis Stimulation (Abbildung 4-4D). Interessant ist, erhöhen in Anwesenheit von PAMPs MoDCs nicht, Sekretion von IL-12 p-40/70; Allerdings erhöht diese Population stark IL-6-Produktion (Abbildung 4-4D). Diese Ergebnisse zeigen, dass sortierte Populationen nach Isolierung ihrer immunologischen Funktionen beibehalten.

Figure 1
Abbildung 1: lebensfähige Zellen innerhalb vorwärts im Vergleich zu Side Scatter Tor. Maus Knochenmark wurde im GM-CSF kultiviert und Rentabilität wurde mit 7-AAD (7-amino-Actinomycin D) Färbung nach der Ernte (PH) und 1, 3 und 5 Tage nach der Ernte gemessen. (A) lebensfähige Zellen wurden durch die Anwendung ein Tor (brauchbar), das kleine und sehr körnig Ereignisse basierend auf FSC und SSC weggelassen. (B) die Histogramme der 7-AAD Färbung erzeugt Ereignisse innerhalb lebensfähig (FSC/SSC) Tor. Für 7-AAD positive Ereignisse zeigen Zellen Apoptose. Pfeile zeigen lebensfähigen Zelle gating. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Lymphozyten in der Bevölkerung-CD115-Ly6C. Maus Knochenmark wurde im GM-CSF kultiviert und Lymphozyten Marker (CD3, CD145R und NK1.1) wurden täglich durch Durchflusszytometrie analysiert. (A) Zelle waren voller Flecken mit Ly6C-PE und CD115-APC Ly6C-CD115-Zellen zu identifizieren. Quadrant Tor wurde basierend auf Einfarbige Steuerelemente angewendet. Pseudofarben Dot-Plot erzeugt vom Tag, an dem am Tag der Ernte (Tag 0) bis zum 6. Tag 0 (B) CD3, CD45R und NK1.1 Ausdruck des Ly6C-CD115-Zellen analysiert wurde. Zellzahlen wurden in den Modus mit einem Flow Cytometry Analysesoftware normalisiert. Pfeil zeigt Ly6C-CD115 - gating. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Kinetik der Entwicklung des Ly6C-CD115 +-Zellen nach der Sortierung an verschiedenen Tagen. (A) Maus Knochenmark wurde geerntet und in GM-CSF kultiviert. Aliquote von 1 x 107 Zellen wurden geerntet (B) 3, (C) 5, oder (D) 7 Tage nach der Ernte (PH). An den angegebenen Tagen PH, Ly6C-CD115 +-Zellen wurden von Mischkultur (vorsortieren) sortiert und analysiert sofort nach Art (PS). Sortierte Zellen wurden neu kultivierten in GM-CSF und Änderungen in Ly6C/CD115 Ausdruck wurden täglich durch Durchflusszytometrie analysiert. Box und Pfeil zeigen sortierschleuse. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Reifung und Cytokine Ausdruck nach Stimulation TLR. Zellen wurden in 5 Populationen am 3. Tag der Kultur in GM-CSF sortiert. Sie wurden dann mit einem Cocktail von PAMPs behandelt (LPS, Poly ich: C und CpG-DNA) für 24 h bedeuten Fluoreszenz Intensität (MFI) (A) MHC-Klasse II und CD86 (B) wurde sofort nach Art (PS) und 24 h mit und ohne PAMPs durch Cytometry Flow analysiert. Fehlerbalken darzustellen Standardabweichung von 3-5 wiederholte Experimente. (C) IL - 12 p 40/70 und (D) IL-6 in Überstände von 3 Mischproben wurden nach 24 h mit und ohne PAMPs durch Cytokine Array Dot Blot ELISA gemessen. RLU; Relativ leichte Einheiten; -/ + deuten auf das Vorhandensein von der Zelle Oberfläche Marker für die ausgewiesenen Bevölkerung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Tag3 Tag 5 Tag 7
Phänotyp Zelltyp Min Max Min Max Min Max
Ly6C-CD115-CD11c - CMP 3 x 106 4 x 106 5 x 105 1 x 106 N/a N/a
Ly6C + CD115- GMP 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 N/a N/a
Ly6C + CD115 + Mono 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 5 x 105 1 x 106
Ly6C-CD115 + MoMac 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106 3 x 106 4 x 106
Ly6C-CD115-CD11c + MoDC N/a N/a 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106

Tabelle 1: Minimale und maximale Anzahl von Zellen erholt nach Art pro 1 x 107 Zellen erwartet. CMP (gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen); GMP (Vorläuferzellen der Granulozyten/Makrophagen) Mono (Monozyten); MoMac (Monocyte-abgeleiteten Makrophagen); MoDC (Monocyte-abgeleitete Dendritische Zelle); N/a (nicht verfügbar); Min (minimale Zellausbeute aus 1 x 107 Zellen); Max (maximale Zellausbeute aus 1 x 107 Zellen).

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Discussion

Dieses Protokoll ermöglicht Isolation der GM-CSF-orientierte Vorläufer und Wegbereiter Zelltypen in Zahlen für verschiedene Arten von Analysen einschließlich der biochemischen Tests, Tests der Zellfunktion in Vitrooder Instillation in Vivoausreichend. Diese Methode stellt einen bedeutenden Fortschritt auf dem Gebiet der Monocyte-abgeleitete Dendritische Zelle Entwicklung, ermöglichen die zuverlässige Isolierung und Identifizierung von Zellen in dieser Weg der Entwicklung als auch die differenzierte Zelltypen häufiger in früheren Studien isoliert.

Frühere Protokolle zur Isolierung der Stammväter und Vorläufer aus dem Knochenmark in Vitro erzeugt Vertrauen auf CFSE--Färbung, Stammvater der proliferativen Zellen 17 zu identifizieren oder Färbung mit CD31 und Ly6C als Marker für myeloische Zellen 18 . Die CFSE Färbeprotokoll von Naik beschrieben wurde für den Einsatz in Flt3L-gesteuerte DC Vorläufer und Vorstufen 17-Generation entwickelt. Wenn wir diesen Ansatz in der GM-CSF Kultursystem versucht, stießen wir auf zwei Hauptprobleme. Die CFSE war etwas zytotoxisch zu entwickelnden Zellen und so hell (auch in geteilten Zellen), die Entschädigung erschwert. Dieser Ansatz erwies sich als ungeeignet für unsere Ziele der frühen Zelltypen (Vorfahren), sowie Zellen über das entwicklungspolitische Spektrum von hoch proliferative (CMPs/GVP) zu hoch entwickelten (MoDC/MoMac) zu isolieren. Wir probierten auch das sortierungsstrategie für GM-CSF-orientierte Zellen beschrieben durch Leenen Gruppe basiert auf CD31 und Ly6C 18. Allerdings haben wir festgestellt, dass CD31 problematisch war. Drückte sich auf sehr niedrigem Niveau (macht es schwierig, die Bevölkerung für die saubere Sortierung zu beheben) durch eine verschwindend kleine Teilmenge von Zellen, und nur sehr früh während der kulturdauer. In der Tat war CD31 Ausdruck nicht vorbei an Tag 2 der Kultur in GM-CSF 10nachweisbar.

Ly6C, war jedoch ein sehr nützliches Molekül zur Trennung von Zellen in den verschiedenen Phasen der Entwicklung aufgrund seiner vorübergehenden Muster der Ausdruck 10. Die Zugabe von CD115 konnten wir genauer Zellen in mittleren und späteren Stadien der Entwicklung zu erkennen, die nicht mit CD31 möglich war. Wir untersuchten auch anderen Markern der Vorfahren wie CD34 und CD117 in der Hoffnung, große Anzahl von diesen frühen Zellen 10zu isolieren. Jedoch anders als die im Flt3L-System gemeldet, wir fanden, dass CD34 und CD117 sich auch auf eine sehr kleine Teilmenge von Zellen äußerten und praktisch nicht waren von Tag 3 der Kultur 17. Diese Stammzell-Marker können in zukünftigen Studien jedoch nützlich Untergruppen innerhalb der CMP oder GMP Populationen unterscheiden.

Es gibt mehrere mögliche Erweiterungen des Protokolls, die den Ertrag der gewünschten Zell-Populationen beeinflussen können. Kann der Benutzer wählen Sie zuerst einen Lebensfähigkeit Fleck um alle abgestorbenen Zellen auszuschließen anzuwenden. Basierend auf den Beobachtungen, die Rate der toten Zellen innerhalb eines typischen vorwärts und Scatter seitentor sind im Allgemeinen relativ niedrig und nur während der ersten Tage der Kultur, deckungsgleich mit Rückgang der Linie positive Lymphozyten Probleme aufwerfen. Allerdings sorgen Fleckes Lebensfähigkeit für Anwendungen in welche, die Zelle Zahlen präzise sein müssen, Ausschluss von abgestorbenen Zellen.

Eine zweite mögliche Änderung ist Erschöpfung der Linie-positiven Lymphozyten vor der Kultur. Wir haben versucht, diesen Ansatz um die kleine Population von Linie positive Zellen zu lösen, die regelmäßig innerhalb der Ly6C-CD115-Zell-Population beobachtet wurden. Die Gesamtausbeute Zelle war etwas niedriger am Tag 5 und 6, und die Reinheit war nicht deutlich höher (Daten nicht gezeigt). So, die Reinheit der ertragsreduzierten nicht rechtfertigen. Ebenso, wenn der Benutzer plant, am 5. Tag oder nach dem Sortieren, die Häufigkeit der Lymphozyten in der Kultur liegt deutlich unter 1 % und sollte kein Problem darstellen.

Denn diese Strategie isolieren soll sollten Zellen in einem großen Entwicklungs-Spektrum der Benutzer schließlich das Timing ihrer Art, möglichst viele der gewünschten Bevölkerungen wie möglich sammeln anpassen. Diese Sortierung Strategie liefert getreu die Zelltypen angegeben unabhängig vom Tag der Kultur, auf denen die Zellen sortiert werden. Z. B. Zellen mit dem Phänotyp Ly6C + CD115-CD11c-sind getreu der GMP-Phänotyp und Funktion ähnlich ob sie sortiert und am Tag 3 oder 5 der Kultur isoliert sind. Die Häufigkeit dieser Zellen ist jedoch am 3. Tag viel größer als 5, so ist das Ziel Isolierung dieses Zelltyps, am 3. Tag sortieren würde empfohlen werden. Es ist auch bemerkenswert, dass Zellen am 3. Tag Fortschritte in der späteren Entwicklungsstufen mit langsameren Kinetik sortiert als wenn sie am Tag 5 oder 7 (Abbildung 3) sortiert.

Während diese Methode für die klare Abgrenzung und Isolation von 5 – 6 verschiedene Populationen des entwicklungspolitischen Spektrums ermöglicht, gibt es wahrscheinlich viele weitere Populationen oder vorübergehende Phasen entlang dieses Weges. In jedem der fünf beschriebenen Populationen möglicherweise mehrere Sub-Populationen in leicht unterschiedlichen Stufen der Entwicklung. Zum Beispiel haben wir beobachtet, dass "unterschiedliche" Populationen mit Zwischenebenen CD115 und Ly6C die etwas andere Muster der Entwicklung in Bezug auf wie viele MoMac MoDC und unterzogen werden (Daten nicht gezeigt) generiert. Es ist auch wahrscheinlich, dass die Bevölkerung zuvor beobachtet in Vivo sind in die Kultur und die Sortieranlage, aber diese sind schwierig, wegen ihrer sehr niedrigen Frequenz zu identifizieren. Bevölkerungsgruppen wie cMOP 19, MDP 20oder CDP 21 wahrscheinlich vorliegen, sondern können innerhalb der größeren Populationen verdeckt werden. Zukünftige Studien werden benötigt zur weiteren Klärung der zahlreichen Entwicklungsstufen, die innerhalb dieser Sortierung Rahmen mit dem Zusatz spezifischer Marker der Differenzierung isoliert werden kann. Der Wert dieser Sortierung Strategie ist, dass es ermöglicht die konsequente Isolation einer großen Zahl von entwicklungspolitisch Phasen während DC Ontogenese.

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Disclosures

Die Autoren haben keine Konflikte offenzulegen.

Acknowledgments

Wir sind dankbar für die technische Unterstützung von Alison Kirche Vogel an Auburn Universität Schule von Veterinärmedizin Flow Cytometry Einrichtung, für Mittel aus der NIH EHS R15 R15 AI107773 und für die Zell- und Molekularbiologie-Programm an der Auburn University für Sommer Forschungsförderung, PBR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HBSS buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60 mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50 mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10 mL Syringe BD Biosciences 301604
23 G needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

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References

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Immunologie und Infektion Ausgabe 138 dendritischen Zellen Entwicklung GM-SCF gemeinsame myeloischen Vorläuferzellen Vorläuferzellen der Granulozyten-Makrophagen Monocyte Monocyte-abgeleitete Dendritische Zellen Makrophagen Monocyte abgeleitet high-Speed Zellsortierung
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Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

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