Summary
Ici, nous fournissons une méthode permettant d’identifier et d’isoler un grand nombre de GM-CSF, piloté par des cellules myéloïdes à l’aide de tri de cellules haute vitesse. On peuvent identifier cinq populations distinctes (progéniteurs myéloïdes communs, progéniteurs de granulocytes/macrophages, monocytes, macrophages dérivés de monocytes et macrophages dérivés de monocytes DCs) basé sur l’expression Ly6C et CD115.
Abstract
Cultures des macrophages dérivés de cellules dendritiques (RCSCND) générés à partir de moelle osseuse de souris à l’aide de Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) ont récemment été reconnus plus hétérogènes qu’auparavant. Ces cultures contiennent systématiquement RCSCND dérivées de monocytes et macrophages (moMac) et même des cellules moins développées telles que les monocytes. Le but du présent protocole est de fournir une méthode cohérente pour l’identification et la séparation des nombreux types de cellules présents dans ces cultures à mesure qu’ils développent, afin que leurs fonctions spécifiques peuvent être davantage étudiées. La stratégie triage présentée ici sépare de cellules tout d’abord en quatre populations basées sur l’expression de Ly6C et CD115, qui sont exprimés transitoirement par les cellules comme ils se développent dans la culture GM-CSF-driven. Ces quatre populations comprennent des progéniteurs myéloïdes communs ou CMP (Ly6C, CD115), progéniteurs de granulocytes/macrophage ou GMP (Ly6C +, CD115-), monocytes (Ly6C +, CD115 +) et les macrophages dérivés de monocytes ou moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c est également ajouté à la stratégie de tri pour distinguer deux populations au sein de la Ly6C-, CD115-population : CMP (CD11c-) et RCSCND (CD11c +). Enfin, deux populations peuvent être plus distinguées au sein de le Ly6C, CD115 + population en se basant sur le niveau de MHC classe expression II. MoMacs expriment des niveaux inférieurs du CMH de classe II, alors qu’un précurseur des DC de macrophages dérivés de monocytes (moDP) exprime plus MHC classe II. Cette méthode permet l’isolation fiable de plusieurs populations distinctes développemental en nombre suffisante pour une variété d’analyses fonctionnelles et du développement. Nous mettons en évidence une telle lecture fonctionnelle, les réponses différentielles de ces types de cellules à une stimulation par Pathogen-Associated profils moléculaires (PAMPs).
Introduction
Mise en culture des cellules de moelle épinière murin avec la cytokine Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (GM-CSF) est largement utilisé comme une méthode pour générer des cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes (RCSCND ; également connu sous le nom DC inflammatoire) dans un grand nombre 1, 2,3,4,5. Ces cellules ont été extrêmement utiles pour une variété d’études de cellules dendritiques (DC) fonction 6,7,8. En règle générale, ces cellules de la moelle épinière murin sont cultivés pendant 6 à 8 jours et sont ensuite utilisés pour l’étude de la fonction des cellules dendritiques 5. Ces cultures avaient longtemps été considérée comme essentiellement homogènes, composé d’une majorité de RCSCND différenciée. Plus récemment, il est devenu clair qu’à la fin de cette période de culture de 6 à 8 jours, il existe en effet de nombreux RCSCND, ainsi qu’un large sous-ensemble de différenciée macrophages dérivés de monocytes (moMacs) 9,10,11. Nos études ont étendu ces résultats démontrant que les autres sous-ensembles de moins développés de cellules, telles que RCSCND précurseurs (moDP) et les monocytes, restent dans les cultures à faible fréquence même après 7 jours, 10. Ainsi, des études de la fonction des cellules dendritiques (DC) à l’aide de cellules générées par ce système pourraient refléter les réponses d’une cohorte plus large de types de cellules que précédemment apprécié.
Nous avons appris beaucoup de choses de l’étude de GM-CSF-généré RCSCND relatives à la fonction de ces cellules au stade final de différenciation 12,13,14. Toutefois, nous comprenons beaucoup moins sur la voie du développement de ces cellules 2,15,16 et de comment et quand ils présentent des fonctions telles que : réactivité à Pathogen Associated Molecular Modèles (PAMPs), phagocytose, antigène traitement et présentation 13et activité anti-bactérienne. Un protocole pour l’isolement d’un grand nombre de classiques progéniteurs axée sur les Flt3L DC et de précurseurs a été rapporté 17. Isolement de ces populations distinctes a été réalisée à l’aide de carboxyfluorescéine succinimidyl ester (CFSE)-coloration des cellules de moelle osseuse (pour suivre la Division des cellules) et de la culture en Flt3L pendant 3 jours. Cellules étaient alors appauvrit les cellules positives linage et triés en populations ancêtre et précurseur basées sur CD11c expression 17. Une autre approche par groupe de Leenen pour identifier les progéniteurs précoces de DC en culture GM-CSF-driven devait trier les cellules basées sur CD31 et Ly6C 18. Le but initial était de créer une méthode similaire pour l’obtention des progéniteurs et précurseurs du GM-CSF-driven RCSCND. Les types de cellules spécifiques générées par le GM-CSF, nous avons adapté l’approche et la stratégie basée sur l’expression des molécules qui ont été exprimées au début et plus tard des stades de développement de tri. En fin de compte, nous avons déterminé que Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), et CD11c ont été les meilleurs marqueurs pour distinguer ces cellules type 10.
Ici, nous présentons une méthode pour isoler des cellules à plusieurs étapes distinctes de développement le long de la voie de la différenciation par le GM-CSF : monocyte progéniteur myéloïde commun (CMP), Granulocyte-Macrophage progénitrices (GMP), macrophages dérivés de monocytes (MoMac) et les macrophages dérivés de monocytes DC (RCSCND). La population de moMac peut être plus séparée basés sur le niveau de MHC classe expression II, révélant un RCSCND précurseur population (moDP) 10. Nous utilisons une cellule de fluorescence-lancée à grande vitesse tri stratégie (FACS) afin d’isoler ces 5 populations basées sur l’expression de Ly6C, CD115 et CD11c. Ensuite, nous démontrons l’examen de ces cellules dans des essais fonctionnels révélant leurs réponses à la stimulation de PAMP.
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Protocol
Tout travail animal a été approuvé par le Comité de l’emploi et de Auburn University Institutional Animal Care conformément aux recommandations énoncées dans le Guide pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire de la National Institutes of Health.
1. préparation pour la collecte de la moelle osseuse
- Préparer 250 mL de milieu complet en ajoutant une solution de milieu de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 additionné de sérum de veau foetal de 10 %, 2 mM de glutamine et 50 µM 2-mercaptoéthanol à la partie supérieure d’une unité de fiole 0,22 µm filtre à vide et vide.
Remarque : Le milieu complet peut être stocké à 4 ° C pendant 2 mois. - Préparer les solution d’éthanol à 70 % en mélangeant 350 mL d’éthanol à 100 % avec 150 mL stérile H2O dans un ballon jaugé de 500 mL.
- Set de centrifuger à 4 ° C.
- Stériliser les pinces, bistouri et ciseaux dans l’éthanol à 70 %.
- À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 5 mL de support complet pour trois boîtes de Petri de 60 mm.
- À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 30 mL de médias complet dans un tube conique de 50 mL.
2. collecte des cellules de la moelle épinière murin
- Euthanasier une souris C57BL/6 de CO2 narcose selon les règles établies par les directives de American Veterinary Medical Association (AVMA) 2013 sur l’euthanasie.
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Retirez et dépouiller les pattes arrière.
- Saturer les pattes et le torse avec 75 % d’éthanol et faire des coupes peu profondes à travers la peau autour de l’articulation de la hanche avec des ciseaux courbes tissu. À l’aide de pinces, tirer fermement la peau de la hanche vers le bas vers la cheville, révélant le muscle. Utiliser des ciseaux pour enlever le lambeau de peau.
- Enlever la patte arrière tout en sectionnant l’os juste au-dessus de l’articulation du fémur/hanche.
NOTE : En plus de la zone de stérilisation, l’éthanol va aider à fournir des coupes nettes et empêcher les cheveux de contaminer les échantillons. - Si les pieds seront transférées vers un nouvel emplacement pour la récolte de la moelle osseuse, plonger les pieds dans les médias.
- Travaillant dans une cabinet de biosécurité stérile, transférer les jambes à l’un des plats Petri préalablement préparée.
- Utiliser des ciseaux pour couper le juste au-dessous de la cheville et soigneusement Enlevez autant du tissu conjonctif musculaire et élastique que possible. Transférer l’OS nettoyés à la deuxième boîte de Pétri préparés.
Remarque : Bien qu’il n’est pas nécessaire d’enlever tout le muscle, trop de tissu restant peut rendre difficile à débusquer la moelle osseuse. -
Séparer le fémur, genou et tibia.
- À l’aide de pinces, tenir la jambe au niveau du genou et localisez la moelle.
Remarque : la moelle osseuse doit être visible comme une ligne rouge pâle à l’intérieur de la cavité osseuse dans la partie supérieure du fémur et vers la fin du tibia.- À l’aide de ciseaux, faire trois incisions comme suit.
- Couper le tibia juste au-dessus où la moelle apparaît à la fin.
- Couper juste en dessous de l’articulation du genou.
- Coupez juste au-dessus de l’articulation du genou.
- Si l’articulation de la hanche est toujours connectée sur le fémur, couper juste en dessous de l’articulation de la hanche.
- Trois fragments de retour à la boîte de Pétri et répétez ce processus sur l’autre jambe.
- À l’aide de ciseaux, faire trois incisions comme suit.
- À l’aide de pinces, tenir la jambe au niveau du genou et localisez la moelle.
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Rincer la moelle osseuse du fémur et du tibia.
- Remplissez une seringue de 10 mL avec support complet du tube conique de 50 mL et du capuchon avec aiguilles 23 G.
- En tenant l’OS avec une pince au-dessus de la troisième boîte de Pétri préparés, introduire l’aiguille dans le canal osseux et pousser les médias à travers, débusquer les cellules (qui peuvent apparaître comme un « bouchon » intact ou plusieurs groupes). Répétez jusqu'à ce qu’aucun plus de la couleur ne peut être vu à travers l’OS. Remplissez la seringue contenant du milieu comme nécessaire.
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Écraser les épiphyses.
- Tandis que toujours dans la deuxième boîte de Pétri, tenir la rotule fermement avec une pince et réduire en purée les genoux avec l’embout de la seringue. Continuez jusqu'à ce que les épiphyses ne sont plus rouges.
- À l’aide de la seringue, transférer les cellules de la deuxième et la troisième boîte de Pétri pour le tube de 50 mL. Éclatement des touffes de pipetage doucement verticalement. Essayez de ne pas générer des bulles. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
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Lyse des globules rouges
- Retirer le liquide surnageant avec pipette sérologique, déloger pellet effleurement et lyse des globules rouges en incubant dans 1 mL de tampon de lyse ACK (chlorure d’Ammonium-Potassium) pendant 1 min à température ambiante.
- À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 40 mL de tampon HBSS (Hanks Balanced Salt Solution).
- À l’aide d’une pipette sérologique, filtrer les cellules si une passoire de cellule 70 µm dans un nouveau tube conique de 50 mL. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
- À l’aide d’une pipette sérologique, retirez le surnageants et laver les cellules avec 40 mL de médias complet. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
Remarque : À ce stade, lymphocytes positifs lignée peuvent être enlevés par FACS ou purification colonne magnétique. Toutefois, les lymphocytes ne sont pas maintenues à long terme dans la culture. Bien qu’un grand nombre de cellules positives de lignée est présent dans la Ly6C-CD115-population dans la moelle osseuse ex vivo, presque tous sont absents par jour 5 (Figure 2). - À l’aide d’une pipette sérologique, éliminer le surnageant et les cellules de moelle osseuse dans les médias complets 10 ng/ml de recombinant mouse GM-CSF à une densité de 1 x 106 cellules/mL de la culture.
Remarque : En général, 4 x 107 cellules total peuvent être récoltées après la lyse des globules rouges. Cependant, s’attendre à aussi peu que 2 × 10-7 pour les débutants et jusqu'à 5 x 107 cellules pour les pêcheurs expérimentés. - À l’aide d’une pipette sérologique, les cellules de transfert aux plaques de culture de tissus et incuber à 37 ° C à 5 % de CO2. Si des graines à l’aide d’une plaque 24 puits, chacun avec 2 mL de suspension cellulaire.
- Toutes les 48 h, utiliser une pipette sérologique pour retirer la moitié des médias et les remplacer par des supports complets neufs et GM-CSF.
NOTE : Cultures peuvent être conservées jusqu'à 9 jours. Cependant, la composition change au fil du temps. Pour plus d’informations, voir la Section 3.
3. choisir le jour du tri
- Compositions de la population de cellules changer au fil du temps, sélectionner un jour qui donne le plus grand nombre de cellules souhaitées.
- Voir le tableau 1 pour le genre de post de rendement cellule prévue pour chacune des populations après 3, 5 et 7 jours de culture en GM-CSF par 1 x 107 cellules.
4. stratégie de coloration
- Petites parties aliquotes de cellules permet de préparer des échantillons de contrôle. Inclure un contrôle non coloré, des échantillons de contrôle de compensation colorées avec un seul anticorps fluorescent, et fluorescence-moins-un contrôle dans laquelle les anticorps sont ajoutés, sauf un, au contrôle de fluorescence non spécifique dans ce canal. Si l’utilisation indirecte d’étiquetage, notamment primaires secondaires seul, seul et primaire et secondaire.
NOTE : Phycoérythrine (PE) et les anticorps allophycocyanin (APC) Taggé offrent nette séparation avec purge minime sur utilisés ensemble. Toutefois, si le fluorochrome options sont limitées, CD115 s’exprime à un niveau relativement bas, tandis que Ly6C est exprimée à des niveaux très élevés. Par conséquent, plus lumineux fluorochromes sont souhaitables pour anti-CD115 et anti-Ly6C fluorochromes sont choisis pour éviter de saigner trop. - Préparer 100 mL de tampon de lavage FACS (FWB) en mélangeant 97 mL de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco réfrigérés (SPD) avec 3 mL de sérum de veau foetal dans un tube conique de 50 mL et placer dans un bain de glace.
- Utiliser une pipette pour doucement, mais complètement, pipette de cellules de haut en bas pour déloger les cellules faiblement adhérentes.
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À l’aide d’une pipette sérologique, transfert de cellules dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
- Si le volume cellulaire dépasse 50 mL, cellules de transfert pour le nombre de tubes nécessaires et se combinent à l’étape de coloration.
- Doucement, décanter le liquide surnageant et laver les cellules boulettes en ajoutant 30 mL de FWB avec une pipette sérologique. Centrifuger à 250 g à 4 ° C pendant 10 min et répéter le lavage.
Remarque : Si la mort cellulaire élevée est attendue, les cellules peuvent être lavés avec FWB avec aussi peu que 0,5 % de sérum de veau foetal (FCS). Cela empêchera l’agglutination des cellules. -
Suspendre et colorer des cellules par les instructions du fabricant de l’anticorps.
- Suspendre les cellules7 5 x 10 dans 1 mL de FWB et ajouter 2 µg chaque anti-Ly6C et anti-CD115 étiquetés avec les fluorophores (de choix du chercheur). Pour distinguer plus loin le CMP du RCSCND (les deux sont Ly6C - et CD115-), ajouter 2 µg d’anticorps anti-CD11c (CMP sont CD11c-; RCSCND sont CD11c+). Incuber pendant 30 minutes sur la glace.
Remarque : La Figure 3 a été générée à l’aide de Ly6C-PE et CD115-APC.
- Suspendre les cellules7 5 x 10 dans 1 mL de FWB et ajouter 2 µg chaque anti-Ly6C et anti-CD115 étiquetés avec les fluorophores (de choix du chercheur). Pour distinguer plus loin le CMP du RCSCND (les deux sont Ly6C - et CD115-), ajouter 2 µg d’anticorps anti-CD11c (CMP sont CD11c-; RCSCND sont CD11c+). Incuber pendant 30 minutes sur la glace.
- À l’aide d’une pipette sérologique, ajouter 10 mL de FWB et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
- Doucement, décanter le liquide surnageant et laver les cellules boulettes en ajoutant 30 mL de FWB avec une pipette sérologique. Centrifuger à 250 g à 4 ° C pendant 10 min et répéter le lavage.
- Avant de suspendre les cellules, feuilleter tube soigneusement pour déloger le culot. Utiliser une pipette sérologique pour suspendre des cellules à 1 x 107 cellules/mL de FWB et filtrer sur filtre de cellule 35 µm. Utiliser une pipette sérologique pour transférer des cellules filtrés dans tube en polypropylène et placer sur la glace jusqu’au moment de trier.
Remarque : Si polypropylène n’est pas disponible, protéine enduit (de lait sec ou FCS) tubes en polystyrène permet de réduire la liaison.
5. Réglez Gates fondées sur des échantillons de contrôle
Remarque : Pour ne pas perturber les cellules en raison de la pression de l’écoulement à grande vitesse, utiliser une buse de 100 – 130 µm pour le tri des cellules.
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Exécuter le contrôle sans coloration (voir point 4.1) par le biais de la Trieuse cellules et appliquez une porte afin d’exclure les petits débris (faible dispersion vers l’avant ; FSC) et hautement granulaire (nuage de points du côté le plus haut ; Particules SSC).
- Pour analyser uniquement les stades avancés (monocytes, moMac/MoDP et RCSCND), appliquer gating pour inclure uniquement des cellules plus grandes (haute FSC).
- Si les taches de viabilité sont utilisés, utilisez-les pour exclure des événements tachés, non viables (un exemple est illustré à la Figure 1).
- Exécuter les exemples de monocommande fluorescent dans le trieur de cellules et ajuster la compensation selon les besoins.
- Exécuter un échantillon de l’échantillon marqué multi. Observer les quatre populations distinctes : Ly6C + CD115-(BPF), Ly6C + CD115 + (monocytes), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) et Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Appliquer une porte pour isoler chacun des quatre principales populations.
Remarque : SCPM et RCSCND partagent le Ly6C-CD115-phénotype. Toutefois, elles peuvent être différenciées sur la base CD11c expression : CMP manque CD11c, tandis que MoDCs express CD11c.
6. perception des Populations isolées
- Préparer les tubes de prélèvement en ajoutant suffisamment FCS pour atteindre au moins 20 % concentration finale lorsqu’il est plein. Par exemple, si vous utilisez des tubes de 5 mL, ajouter 1 mL de FCS avant le tri et retirez le tube lorsqu’il atteint le volume total de 5 mL.
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Pour empêcher l’absorption de chiffre d’affaires et les anticorps membranaires, conserver tous les échantillons (mélangé et tri) à 4 ° C tout au long de la sorte.
- Si ce n’est pas possible, gardez le tube contenant les cellules glace autant que possible être triés et transférer des aliquotes dans la trieuse de selon les besoins.
- En outre, les échantillons de transfert trié à la glace toutes les 20 à 30 min.
- Après que le nombre de cellules ont été recueilli, utiliser une pipette sérologique pour transférer les cellules dans un nouveau tube conique. Centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min.
- Confirmer la pureté post-tri analyse sur petites parties aliquotes de chaque population recueillie.
- Retirer le surnageant, suspension dans 10 mL de FWB et centrifuger à 250 x g à 4 ° C pendant 10 min. Repeat pour un total de deux lavages.
Remarque : Il peut être difficile de retirer tout le liquide surnageant sans déloger le culot. Fixer un embout de la pipette sur une ligne vide peut aider avec l’enlèvement. Si ce n’est pas disponible, on croit percevoir le surnageant dans un nouveau tube en cas de dissociation de pellet. - Retirez le surnageant après le deuxième lavage.
- Si le dispositif expérimental de l’utilisateur dicte les cellules re-être mis en culture, suivez les étapes 2.12 – 2.14. Dans le cas contraire, si cellules seront utilisés pour l’analyse immédiate, préparer les cellules selon le protocole désiré.
Remarque : Un exemple d’analyse fonctionnelle typique est inclus dans la Figure 4.
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Representative Results
Dans un effort pour garder le maximum de canaux disponibles pour l’analyse sous forme de cellules possibles et viables ont été systématiquement choisis sur nuages de points avant et latéraux, à l’exclusion des événements très petites et très granulaires (une porte typique est appliquée à tous le point des parcelles dans la Figure 1 a). Pour déterminer si cette stratégie de blocage fiable exclut les cellules mortes, nous avons teinté avec 7-Amino l’actinomycine D (7-AAD) (Figure 1 b). 7AAD taches ADN dans les cellules mortes et mourants en raison de la perméabilité de la membrane et est exclu par cellules viables. Viabilité des cellules de culture de moelle osseuse a été analysé immédiatement après la récolte (PH) et 1, 3 et 5 Tél. Cell analysés immédiatement PH de GM-CSF avait environ 10 % des cellules positives 7-AAD lorsqu’une porte typique de FSC/SSC a été appliquée à des cellules fraîchement isolées de l’OS moelle osseuse (Figure 1, après la récolte). Une proportion similaire de cellules mortes était également présente au jour 1 (~ 12 %) et 3 (~ 11 %) de culture (Figure 1, jour 1 PH et 3 jours PH). Au jour 5, le nombre de cellules mortes dans la porte a été réduit à environ 5 % (Figure 1, 5J PH). Ainsi, en utilisant une telle porte de viabilité est généralement appropriée pour le jour 5 et après le tri. Par conséquent, si les utilisateurs sont limités dans leurs paramètres disponibles, FSC/SSC Gate est généralement appropriée. Toutefois, pour les tests plus sensibles (en particulier si elles s’appuient sur un nombre précis de cellules), incorporer une tache de viabilité (suggestion).
Beaucoup de protocoles pour la propagation des cellules dendritiques recommande déplétion des cellules positives de lignée, en particulier des lymphocytes, de la moelle osseuse avant la culture 11,17. Cette procédure est censée augmenter la pureté des cellules récupérées sur la différenciation véhiculée par GM-CSF. En règle générale, les cellules expriment des marqueurs de cellules T (CD3), cellules de B (CD45R ou CD19), et les cellules NK (NK1.1) peuvent être épuisées par sélection positive à l’aide de billes magnétiques ou cellule Tri 11,17,18. Cependant, basé sur le système de culture, lymphocytes ont été rarement récupérés ou détectés dans ces essais. Ainsi, nous avons cherché à évaluer la longévité des lymphocytes conservés dans la Ly6C-CD115-population parmi les cellules GM-CSF-driven (Figure 2 a). GM-CSF cultivés de la moelle osseuse, cellules (qui n’avaient pas été lignée appauvrie) ont été colorées avec les anticorps anti-CD3, CD45R et NK1.1 (dans le même fluorophore) et mesuré quotidiennement par cytométrie en flux (Figure 2 b). Au sein de la Ly6C-CD115-population, CD3/CD45R cellules positives persistent fortement par jours 0 à 3 (Figure 2 b). Le jour 4, est resté seulement quelques cellules positives CD3/CD45R et par jour 5 et 6, il n’y a aucun CD3/CD45R exprimant les cellules présentes. Ainsi, dans les 4 jours de culture en GM-CSF, cellules positives de lignée sont essentiellement absents et n’ont pas détectés à tous les jours 5 et 6 de la culture.
La composition de la culture cellulaire de GM-CSF-driven change tous les jours dans ce système que les cellules se développent et différencient (tableau 1 ; La figure 3). Aux premiers moments, les cellules les plus abondantes sont les ancêtres et les précurseurs et au plus tard la majorité des cellules ne sont a plus différenciée 10. Pour déterminer comment le tri sur des jours différents de la culture pourrait affecter le chemin du développement ultérieur ou cinétique, sortes ont été effectuées à 3, 5 et 7 jours PH (Figure 3 a). Le développement de la population de MoMac (Ly6C-CD115 +) a été ensuite suivie pendant 2 – 3 jours supplémentaires de culture (Figure 3 b-3D).
Lorsque le tri 3 jours PH, seuls 40 % des Ly6C-CD115 + cellules avaient diminué CD115 expression dans post-tri 24h (PS) (Figure 3 b). 48 h PS, la fraction qui avait diminuées CD115 était de 66 %, et 72 h, 70 % des cellules avaient ce phénotype. Cette composition phénotypique a été maintenue (~ 70 à 72 % Ly6C - CD115-) même après plus de jours de culture (données non présentées). Quand tri 5 jours PH, environ 75 % des cellules étaient Ly6C - CD115-, ayant rapidement diminuées CD115 dans 24 h ch et environ 80 % ont été CD115 - après seulement 48 h. Cette distribution se maintient après 72 h (Figure 3). Enfin, lorsque le tri 7 jours PH, régulation négative de CD115 était également assez rapide. Moins de 24 h PS, ~ 75 % des cellules ont diminuées CD115 expression, et cette tendance s’est maintenue après 48 h (Figure 3D). Fait intéressant, lorsque trié au jour 7, le niveau global d’expression CD115 était plus faible sur les cellules au sein de la population CD115 +.
Par conséquent, ces résultats indiquent que la cinétique de développement sont un peu plus lent lors du tri à un jour tôt, telles que la journée 3 triés par rapport à un développement plus rapide des cellules et la différenciation observée après tri 5 ou 7 jours. Selon ces résultats, un utilisateur cherchant un plus grand nombre de RCSCND devrait probablement genre 5 ou 7 jours.
La réponse de la maturation des DC est bien établie 6,7,12,14. Lorsque les traités avec une variété de motifs moléculaires associés aux pathogènes (PAMPs), DC immature de la régulation l’expression de MHC, molécules de costimulation et des cytokines pro-inflammatoires, améliorant leur activation des lymphocytes T capacité 6. Toutefois, il est moins claire lorsque les cellules en développement acquièrent la capacité de répondre à une stimulation PAMP et quelle fonction de la maturation des DC, ils peuvent présenter. Pour déterminer laquelle des populations triées répondrait à des stimuli de maturation, chaque population a été traitée peu de temps après le tri avec un cocktail de PAMPs y compris Poly je : C, lipopolysaccharides (LPS) et l’ADN CpG pour déclencher le récepteur toll-like (TLR) 3 (TLR3), TLR4 et TLR9, respectivement. Les cellules ont été traitées (ou non) pendant 24 h et l’expression du CD86 et MHCII a été mesurée par cytométrie en flux (Figure 4 a-4 b). En outre, production de IL-12p 40/70 et IL-6 a été mesurée dans les surnageants de tableau de cytokine ELISA (Figure 4-4D).
SCPM et BPF a exprimé des niveaux très faibles du CMH de classe II et CD86 dans un État non stimulée et ces expression patterns ne changent pas significativement lors de l’exposition au cocktail de PAMPs (Figure 4 a et 4 b). De même, l’expression du CMH de classe II par les monocytes était également faible et peu changé lors de l’exposition PAMP (Figure 4 a). Toutefois, l’expression de CD86 a été modérée sur les monocytes 24h après le tri, et il a augmenté plus loin après la stimulation h 24. Une expression basale supérieure du CMH de classe II et les deux populations montrent une forte induction de ces molécules lors de la stimulation de PAMP CD86 dans le MoMacs et le MoDCs a été observée. En ce qui concerne l’expression MHC classe II suite à la stimulation, il n’y avait aucune différence statistique entre les SCPM, BPF et les monocytes, alors que les MoMacs et les MoDCs forment un groupe distinct. Pourtant, en ce qui concerne l’expression CD86, les cellules SCPM et bonnes pratiques de fabrication étaient statistiquement différents de MoMacs et MoDCs. Cependant, monocytes ne différaient pas que MoMacs ou MoDCs.
Ensuite, nous avons voulu évaluer la capacité relative de chacune des cinq populations de produire des cytokines en réponse à la stimulation du TLR. Ainsi, nous avons effectué une analyse de cytokine sur les populations triées après que culture en présence ou en absence de l’agoniste TLR cocktail utilisé ci-dessus. Cellules sont cultivées avec les stimuli pendant 24 h, puis les surnageants ont été recueillis. Nous avons observé très peu de IL - 12 p 40/70 ou de production d’IL-6 par le CMPs lors de la stimulation de TLR (Figure 4-4D). Le deuxième segment, BPF, était incapable de produire l’IL-12p 40/70 (Figure 4), mais ces cellules produisent une faible quantité d’IL-6 lors de la stimulation par PAMPs (Figure 4). Les plus hauts niveaux de la production de cytokines ont été observées dans les trois populations ce dernier. Monocytes et MoMacs étaient très semblables de patrons et de l’ampleur de la production de cytokines. Tous deux ont grandement augmenté IL - 12 p 40/70 et modestement augmenté la production d’IL-6 place de stimulation (Figure 4-4D). Fait intéressant, en présence de PAMPs MoDCs n’augmentait pas sécrétion d’IL-12 p 40/70 ; Cependant, cette population a considérablement augmenté la production de IL-6 (Figure 4-4D). Ces résultats indiquent que les populations triées maintient leurs fonctions immunologiques après l’isolement.
Figure 1 : cellules viables au sein de l’attaquant contre porte côté Scatter. Moelle osseuse de souris a été cultivée dans le GM-CSF, et la viabilité a été mesurée à l’aide de 7-AAD (7-amino-actinomycine D) coloration post-récolte (PH) et 1, 3 et 5 jours après la récolte. (A) des cellules viables ont été sélectionnés en appliquant une porte (viabilisé) qui a omis les événements petits et très granulaires issus des FSC et SSC. Histogrammes (B) de la coloration de la 7-AAD issues d’événements au sein du portail viabilisé (FSC/SSC). Les événements positifs pour 7-AAD indiquent les cellules en apoptose. Les flèches indiquent le blocage des cellules viables. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Lymphocytes au sein de la population-CD115-Ly6C. Moelle osseuse de souris a été cultivée dans le GM-CSF et marqueurs lymphocytaires (CD3, CD145R et NK1.1) ont été analysés quotidiennement par cytométrie en flux. Cellule (A) ont été colorées avec Ly6C-PE et CD115-APC pour identifier les Ly6C-CD115-cellules. Porte de quadrant a été appliquée en fonction des contrôles de simple-couleur. Terrain de dot Pseudo-couleur généré par jour 0 expression NK1.1 CD3 (B) et CD45R de Ly6C-CD115-cellules a été analysée sur le jour de la récolte (jour 0) jusqu’au jour 6. Nombre de cellules ont été normalisé à la mode à l’aide d’un logiciel d’analyse de cytométrie en flux. Flèche Ly6C-CD115 cloisonnement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : cinétique de mise au point de Ly6C-CD115 + cellules après un tri sur des jours différents. (A) souris moelle osseuse a été récolté et cultivée dans le GM-CSF. Conserver des portions de 1 x 107 cellules ont été récoltées (B) 3, (C), 5, ou (D) 7 jours après la récolte (PH). Les jours indiqués PH, Ly6C-CD115 + cellules ont été triées de culture mixte (tri préalable) et analysées immédiatement post-tri (PS). Cellules triées ont été re-cultivés dans le GM-CSF et changements dans l’expression Ly6C/CD115 ont été analysés quotidiennement par cytométrie en flux. Boîte et flèche indiquent porte de tri. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : expression de Maturation et de cytokines après stimulation TLR. Les cellules ont été regroupées en 5 populations au jour 3 de la culture dans le GM-CSF. Ils sont ensuite traités avec un cocktail de PAMPs (LPS, Poly je : C et ADN CpG) pendant 24 h. signifie l’intensité de fluorescence (IFM) de (A) CMH de classe II et (B) CD86 a été analysée immédiatement post-tri (PS) et 24h avec et sans PAMPs par cytométrie en flux. Barres d’erreur représentent déviation standard de 3-5 expériences répétées. (C) IL - 12 p 40/70 et (D) IL-6 dans les surnageants de 3 échantillons groupés ont été mesurés par blot de dot tableau cytokine ELISA après 24h avec et sans PAMPs. RLU ; Unités de lumière relatives ; -/ + indiquent la présence du marqueur surface cellulaire de la population désignée. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Jour 3 | Jour 5 | Jour 7 | |||||
| Phénotype | Type de cellule | Min | Max | Min | Max | Min | Max |
| Ly6C-CD115-CD11c - | CMP | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 10,5 | 1 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115 + | Mono | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 10,5 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 10,5 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | RCSCND | N/a | N/a | 5 x 10,5 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
Tableau 1 : Attendre les nombres minimal et maximal des cellules récupérées post-tri par 1 x 107 cellules. CMP (progéniteur myéloïde commun) ; GMP (ancêtre de granulocytes/macrophage) Mono (monocytes) ; MoMac (macrophages dérivés de monocytes) ; RCSCND (cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes) ; N/a (non disponible) ; Min (rendement possible cellule minimale de 1 x 107 cellules) ; Max (rendement possible cellulaire maximale de 1 x 107 cellules).
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Discussion
Ce protocole facilite l’isolement de GM-CSF-driven ancêtre et précurseur types cellulaires en nombre suffisant pour plusieurs types d’analyses dont les épreuves biochimiques, les tests de la fonction cellulaire in vitroou in vivode l’instillation. Cette méthode représente une avancée significative dans le domaine du développement des cellules dendritiques macrophages dérivés de monocytes, permettant l’isolation fiable et l’identification des cellules au début de cette voie de développement ainsi que les types de cellules différenciées, plus communément isolés dans des études antérieures.
Protocoles précédents pour l’isolement des progéniteurs et de précurseurs produits de la moelle osseuse in vitro sont sont appuyés sur CFSE-coloration pour identifier de cellules progénitrices proliférative 17 ou sur la coloration avec CD31 et Ly6C comme des marqueurs de cellules myéloïdes 18 . Le CFSE souillant le protocole décrit par Natacha a été conçu pour utilisation dans la génération d’axée sur les Flt3L DC progéniteurs et précurseurs 17. Lorsque nous avons tenté cette approche dans le système de culture GM-CSF, nous avons rencontré deux questions principales. Le CFSE était quelque peu cytotoxique pour les cellules en développement et si brillante (même dans les cellules divisées) qu’elle compliquait la compensation. Cette approche s’est avérée ne pas convenir à nos objectifs d’isoler les premiers types de cellules (cellules souches), ainsi que de cellules dans le spectre du développement, de très prolifératives (CMPs/BPF) pour très développé (RCSCND/MoMac). Nous avons aussi essayé la stratégie de tri pour les cellules de GM-CSF-driven décrite par groupe de Leenen qui reposait le CD31 et Ly6C 18. Cependant, nous avons constaté que CD31 était problématique. Il a été exprimé à des niveaux très bas (ce qui rend difficile de résoudre les populations de tri propres) par un sous-ensemble ridiculement faible de cellules et seulement très tôt au cours de la période de culture. En fait, CD31 expression n’était pas détectable passé jour 2 de culture GM-CSF 10.
Ly6C, cependant, est une molécule très utile pour séparer les cellules à différents stades de développement en raison de son modèle transitoire d’expression 10. L’ajout de CD115 nous a permis de mieux discerner les cellules aux stades intermédiaires et plus tard du développement qui n’était pas possible avec CD31. Nous avons également examiné d’autres marqueurs des progéniteurs CD34 et CD117 dans l’espoir d’isoler un grand nombre de ces premières cellules 10. Cependant, contrairement à celui rapporté dans le système Flt3L, nous avons constaté que CD34 et CD117 ont également été exprimées sur un très petit sous-ensemble de cellules étaient pratiquement absents par jour 3 de culture 17. Ces marqueurs de cellules souches peuvent être utiles dans de futures études, cependant, de distinguer les sous-ensembles au sein des populations CMP ou GMP.
Il y a plusieurs modifications possibles au protocole qui peuvent affecter le rendement des populations de cellules souhaitée. Tout d’abord, l’utilisateur peut choisir d’appliquer une teinture de viabilité afin d’exclure toute les cellules mortes. Se fondant sur les observations, le taux de cellules mortes au sein d’un typique avant et porte de dispersion latérale sont relativement faible en général et posent des problèmes que pendant les premiers jours de la culture, qui coïncide avec la diminution des lymphocytes positifs de lignage. Toutefois, pour les applications dans quelle cellule numéros doivent être précis, une tache de viabilité assurera exclusion des cellules mortes.
Une deuxième modification potentielle est la déplétion des lymphocytes de la lignée positive avant la culture. Nous avons essayé cette approche pour aborder la petite population de cellules positives de lignée régulièrement observées au sein de la population Ly6C-CD115-cell. Le rendement global de la cellule était légèrement inférieur aux jours 5 et 6, et la pureté n’était pas significativement plus élevées (données non présentées). Ainsi, la pureté ne justifiaient pas le rendement réduit. De même, si l’utilisateur a l’intention de trier au jour 5 ou après, la fréquence des lymphocytes au sein de la culture est bien inférieur à 1 % et ne devrait poser aucun problème.
Enfin, parce que cette stratégie vise à isoler les cellules à travers un large spectre du développement, l’utilisateur devraient adapter le calendrier de leur genre de recueillir autant de populations désirées que possible. Cette stratégie triage donne fidèlement les types de cellules indiqués quel que soit le jour de la culture à laquelle les cellules sont triées. Par exemple, les cellules avec le phénotype Ly6C + CD115-CD11c-are true pour le phénotype de la GMP et la fonction de la même façon qu’elles soient triées et isolés jour 3 ou 5, de la culture. Toutefois, la fréquence de ces cellules est bien supérieure au jour 3 à 5, donc si le but est l’isolement de ce type de cellule, tri le jour 3 est recommandé. Il faut aussi noter que les cellules triées sur jour 3 franchiront les étapes ultérieures du développement avec une cinétique plus lente que si elles ont été triées au jour 5 ou 7 (Figure 3).
Bien que cette méthode permet la délimitation claire et l’isolement des populations distinctes de 5 – 6 le long du spectre du développement, il y a probablement des populations plus nombreuses ou les stades de transition le long de cette voie. Au sein de chacune des cinq populations décrites, il peut y avoir plusieurs sous-populations par tranches légèrement différente du développement. Par exemple, nous avons observé « distinctes » populations avec des niveaux intermédiaires de CD115 et de Ly6C qui subissent des modèles légèrement différents du développement, en termes de combien moMac et RCSCND sont générés (données non présentées). Il est également probable que les populations observées précédemment en vivo sont présents dans la culture et le système de tri, mais ceux-ci ont été difficiles à identifier en raison de leur très basse fréquence. Les populations comme MCRO 19, MDP 20ou 21 de la CDP sont probablement présente, mais peuvent être cachées au sein des populations plus grandes. Les études à venir seront nécessaires afin de mieux clarifier les nombreux stades de développement qui peuvent être isolés dans ce cadre tri avec l’ajout de marqueurs spécifiques de la différenciation. La valeur de cette stratégie triage, c’est qu’il permet d’isolement conforme d’un grand nombre de stades développemental distincts au cours de l’ontogenèse de la DC.
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Disclosures
Les auteurs n’ont aucun conflit de divulguer.
Acknowledgments
Nous sommes reconnaissants pour l’assistance technique de l’église de Alison Bird à l’Auburn University de médecine vétérinaire Flow Cytometry établissement scolaire, pour le financement du NIH pour EHS R15 R15 AI107773 et le cellulaire et le programme de biologie moléculaire à l’Université d’Auburn pour financer la recherche été au PBR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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