Summary
Здесь мы предоставляем метод для выявления и изоляции большого числа ГМ-КСФ инициативе миелоидных клеток, используя высокую скорость сортировки клеток. Пять различных популяций (общие миелоидного прародителями, предшественники гранулоцитов/макрофагов, моноциты, моноцитарных макрофагов и моноцитарных DCs) могут быть определены на основе Ly6C и CD115 выражения.
Abstract
Культур моноцитарных дендритных клеток (moDC) из костного мозга мыши с помощью гранулоцитарно-макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) недавно были признаны быть более неоднородными, чем ранее высоко. Эти культуры обычно содержат также моноцитарных moDC макрофагов (moMac) и даже некоторые менее развитые клетки, такие как моноцитов. Цель настоящего Протокола заключается в том, предоставить согласованный метод для выявления и отделения многих типов клеток, присутствующие в этих культурах, как они развиваются, так, что их конкретные функции может быть дальнейшее расследование. Стратегию сортировки, представленные здесь разделяет клетки сначала на четыре населения на основе выражения Ly6C и CD115, оба из которых выражаются временно клетками, как они развиваются в ГМ-КСФ driven культуры. Эти четыре группы населения включают общие миелоидного прародителями или CMP (Ly6C-, CD115-), предшественники гранулоцитов/макрофагов или GMP ("Ly6C +", "CD115-"), моноцитов (Ly6C +, CD115 +) и моноцитарных макрофаги или moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c также добавляется в стратегию сортировки различать две популяции в пределах Ly6C-, CD115-население: CMP (CD11c-) и moDC (CD11c +). Наконец две популяции могут различаться далее в пределах Ly6C-, CD115 + населения, основанные на уровень MHC класса II выражение. MoMacs Экспресс более низкий уровень MHC класса II, в то время как прекурсор моноцитарных DC (moDP) выражает выше MHC класса II. Этот метод позволяет для надежной изоляции несколько развивающих собственный населения в цифрах достаточно для различных анализов, функциональной и развития. Мы выделяем один из таких функциональных индикация, дифференциальной ответы этих типов клеток для стимуляции с Pathogen-Associated молекулярных структур (PAMPs).
Introduction
Культивирование клеток костного мозга мышиных с цитокина гранулоцитарно-макрофагальный колонии стимулирующий фактор (ГМ-КСФ) широко используется как метод для создания моноцитарных дендритных клеток (moDC; также известен как воспалительные DC) в больших количествах 1, 2,3,4,5. Эти клетки были чрезвычайно полезными в различных исследований дендритных клеток (DC) функция 6,,78. Как правило эти клетки костного мозга мышиных культивировали для 6-8 дней и затем используются для изучения дендритные клетки функции 5. Эти культуры давно считается основном однородной, состоящий из большинства дифференцированных moDC. Совсем недавно стало ясно, что в конце этого периода 6-8 день культуры, есть действительно много moDC, а также большое подмножество дифференцированной моноцитарных макрофагов (moMacs) 9,10,11. Далее наши собственные исследования расширили эти результаты демонстрируют, что другие подмножеств менее развитых клеток, таких как moDC прекурсоров (moDP) и моноцитов, остаются в культурах низкой частотой даже после 7 дней 10. Таким образом исследования дендритных клеток (DC) функции с использованием клеток, порожденных этой системы может отражать ответы широкой когорты типов клеток, чем ранее высоко.
Мы узнали многое из сферы исследования ГМ-КСФ генерируется moDC, касающиеся функции этих клеток в заключительной стадии дифференцировки 12,,1314. Однако, мы понимаем значительно меньше о пути развития этих клеток 2,,1516 и как и когда они выставки конкретные функции, такие как: реагировать возбудителя связанные молекулярные Шаблоны (PAMPs), фагоцитоз, обработки и презентации антигена 13и антибактериальная активность. Протокол для изоляции большого числа обычных Flt3L-driven DC прародителями и прекурсоров был сообщил 17. Изоляция этих различных групп населения была достигнута с помощью Карбоксифлуоресцеина succinimidyl эфира (CFSE)-окрашенных клеток костного мозга (для отслеживания деления клеток) и культуры в Flt3L на 3 дня. Клетки затем были истощены построчная оплата позитивных клеток и рассортированы прародителем и прекурсоров населения, основанные на CD11c выражение 17. Другой подход Leenen в группы для выявления ранних прародителями DC в ГМ-КСФ driven культуры был для сортировки клеток, основанные на CD31 и Ly6C 18. Первоначальной целью было создать аналогичный метод для получения прародителями и прекурсоров ГМ-КСФ driven moDC. Из-за определенных ячеек типы, созданные с помощью GM-CSF мы адаптировали подход и сортировка стратегию, основанную на экспрессию молекул, которые были высказаны на ранних и более поздних стадиях развития. Мы в конечном счете определил, что Ly6C, CD115 (РСУ-1 рецепторов), и CD11c были лучшие маркеры для разграничения этих клеток типов 10.
Здесь мы представляем метод для изоляции клеток в несколько различных этапов развития по пути дифференциации, движимый ГМ-КСФ: общие миелоидного Progenitor (CMP), гранулоцитарно-макрофагального Progenitor (GMP), моноцитов, макрофагов, моноцитарных (MoMac) и моноцитарных DC (MoDC). MoMac населения можно далее подразделить на основе на уровень MHC класса II выражение, выявление прекурсоров moDC населения (moDP) 10. Мы используем высокоскоростной флуоресценции активированный ячейку Сортировка (FACS) стратегия изолировать эти 5 населения на основе выражения, Ly6C, CD115 и CD11c. Затем мы показываем изучение этих клеток в функциональных анализов, раскрывая свои ответы PAMP стимуляции.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все животные работы был одобрен Auburn университета институциональных животное уход и использование Комитетом согласно рекомендациям, изложенным в руководстве для ухода и использования лабораторных животных национальных институтов здоровья.
1. Подготовка к коллекции костного мозга
- Подготовить полный СМИ 250 мл, добавив раствором Розуэлл парк Мемориальный институт (RPMI) 1640 среды с 10% плода телячьей сыворотки, глютамин 2 мм и 50 мкм 2-меркаптоэтанол в верхней части 0,22 мкм вакуумные колбы фильтр и вакуум.
Примечание: Полный среднего может храниться при температуре 4 ° C на срок до 2 месяцев. - Подготовка 70% этанола раствор путем смешивания 350 мл 100% этанола с 150 мл стерильного H2O в 500 мл флакон.
- Набор центрифуги до 4 ° C.
- Стерилизуйте щипцы, скальпель и ножницы в 70% этиловом спирте.
- С помощью Серологические Пипетки, добавьте 5 мл полной СМИ три чашки Петри 60 мм.
- С помощью Пипетки серологические, добавьте 30 мл полной СМИ в 50 мл Конические трубки.
2. сбор клеток костного мозга мышиных
- Усыпить мыши C57BL/6 от наркоза CO2 в соответствии с правилами, установленными 2013 американской ветеринарной медицинской ассоциации (AVMA) руководящие принципы эвтаназии.
-
Удалите и Стрип задних ног.
- Saturate задние ноги и туловище с 75% этанола и сделать неглубокие порезы через кожу вокруг тазобедренного сустава с изогнутой ткань ножницами. С помощью щипцов, твердо тяните кожу от бедра к щиколотке, раскрывая мышцы. Используйте ножницы, чтобы удалить кожного лоскута.
- Удалите всю заднюю ногу, проходящем через кости непосредственно над бедренной кости/тазобедренного сустава.
Примечание: в дополнение к стерилизации области, этанол будет помощь в предоставлении сокращение чистого и предотвратить загрязнение образцов волос. - Если ноги будут переведены на новое место для уборки костного мозга, опускайте ноги в полной СМИ.
- Работая в стерильных биобезопасности кабинета, передать ноги один из ранее подготовленных Петри.
- Используйте ножницы, чтобы вырезать только ниже лодыжки и тщательно удалить как можно больше мышц и упругой соединительной ткани как можно скорее. Передачи очищены кости на второй подготовленный Петри блюдо.
Примечание: Хотя это не обязательно для удаления всех мышц, слишком много оставшихся ткани может сделать это трудно вымывать костного мозга. -
Отдельные, бедра, колена и голени.
- С помощью щипцов, держать ногу в колене и найдите костного мозга.
Примечание: костного должны быть видны как слабая красная линия внутри полость кости на верхней части бедра и голени в конце.- С помощью ножниц, сделайте три отрубов следующим образом.
- Вырежьте голени чуть выше где костного мозга, как представляется, конец.
- Вырежьте чуть ниже коленного сустава.
- Вырежьте чуть выше коленного сустава.
- Если тазобедренного сустава до сих пор подключен к бедренной кости, вырежьте чуть ниже тазобедренного сустава.
- Возвращение трех фрагментов на Петри блюдо и повторите этот процесс на другой ноге.
- С помощью ножниц, сделайте три отрубов следующим образом.
- С помощью щипцов, держать ногу в колене и найдите костного мозга.
-
Флеш костного мозга от бедра и голени.
- Заполните шприц 10 мл с полным СМИ от 50 мл Конические трубки и крышка с иглой 23 G.
- Проведение кости с щипцами выше третий подготовленный Петри, вставить иглу в костный канал и нажмите средств массовой информации, смыв клетки (которые могут возникнуть как нетронутыми «пробка» или несколько кластеров). Повторяйте до тех пор, пока не больше цвета можно увидеть через кости. Наполните шприц с СМИ в случае необходимости.
-
Раздавить эпифизов.
- Хотя до сих пор в втором Петри, крепко коленного сустава с щипцами и пюре колени с кончика шприца. Продолжайте, пока эпифизов больше не красный.
- С помощью шприца, клетки перехода от второго и третьего Петри Тюбик 50 мл. Распад вверх сгустки, нежно закупорить вверх и вниз. Старайтесь не создавать пузыри. Центрифуга на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
-
Лизировать клетки крови
- Удалить супернатант с Серологические Пипетки, выбить Пелле, стряхивая и лизируют красные кровяные клетки путем инкубации в 1 мл буфера Lysis ACK (аммония хлорид калия) за 1 мин при комнатной температуре.
- С помощью Пипетки серологические, добавьте 40 мл буфера HBSS (Хэнкс сбалансированного солевого раствора).
- С помощью Пипетки серологические, фильтр клетки хотя стрейнер ячейки 70 мкм в новой 50 мл Конические трубки. Центрифуга на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
- С помощью Серологические Пипетки, удалите супернатант и вымыть клетки с 40 мл полной СМИ. Центрифуга на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
Примечание: На данном этапе положительные лимфоциты линии можно удалить СУИМ или магнитные столбец очистки. Однако лимфоциты не поддерживаются долгосрочной перспективе в культуре. Хотя большое количество позитивных клеток линии присутствуют в Ly6C-CD115-населения в костного ex vivo, почти все отсутствуют в день 5 (рис. 2). - Использование Пипетки серологические, удалить супернатант и культуры клеток костного мозга в полной СМИ с 10 нг/мл рекомбинантных мыши ГМ-КСФ на плотности 1 х 106 клеток/мл.
Примечание: Как правило, 4 x 107 всего клетки могут быть собраны после лизиса красных кровяных клеток. Однако ожидаете как маленькое как 2 x 10-7 для начинающих и до 5 x 107 клеток для опытных комбайнов. - Использование Серологические Пипетки, передавать клетки культуры ткани пластины и инкубировать при 37 ° C в 5% CO2. Если с помощью 24-ну плита, семена каждый хорошо с 2 мл суспензии клеток.
- Чтобы удалить половину средств массовой информации и заменить свежей полной СМИ и ГМ-КСФ каждые 48 ч, используйте Серологические Пипетки.
Примечание: Культур может храниться 9 дней. Однако со временем меняется состав. Для получения дополнительной информации см. раздел 3.
3. Выбор день рода
- Как клетки населения менялся со временем, выберите день, что дает наибольшее количество желаемых клеток.
- Смотрите таблицу 1 для сортировки пост урожайность ожидается ячейки для каждой из групп населения после 3, 5 и 7 дней культуры в ГМ-КСФ за 1 x 10-7 клеток.
4. Окрашивание стратегия
- Используйте небольшие аликвоты клеток для подготовки контрольных образцов. Безупречная управления, компенсация контрольных образцов, окрашенных с только одной флуоресцентные антитела, включать и флуоресценции минус один управляет, в котором все антитела добавляются за исключением одного, чтобы контроль-неспецифический флуоресценции в этом канале. Если с помощью косвенных маркировки, включают начальной средней только, только и как первичный и вторичный.
Примечание: Фикоэритрин (PE) и аллофикоцианин (APC) с меткой антитела обеспечивают различные отделения с минимальным кровоточить над при совместном использовании. Однако если флюрохром варианты ограничены, CD115 выражается на относительно низком уровне, в то время как Ly6C выражается на очень высоком уровне. Таким образом ярче флуорохромов желательны для анти CD115, и анти Ly6C флуорохромов выбираются для предотвращения кровотечения над. - Подготовка 100 мл из буфера мытья СУИМ (FWB) путем смешивания 97 мл охлажденного Дульбекко фосфатный буфер (DPBS) с 3 мл сыворотки плода теленка в 50 мл Конические трубки и место в ледяной бане.
- Используйте пипетку, чтобы мягко, но тщательно, Пипетка клетки вверх и вниз, чтобы выбить любой слабо адэрентных клеток.
-
С помощью Пипетки серологические, клетки перехода к 50 мл Конические трубки. Центрифуга на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
- Если объем ячейки превышает 50 мл, передать необходимое количество трубок клетки и объединить на окрашивание шаг.
- Осторожно слить супернатанта и Вымойте гранулированных ячейки, добавив 30 мл FWB с Серологические Пипетки. Центрифуга на 250 x g при 4 ° C на 10 мин и повторять мыть.
Примечание: Если ожидается высокая клеточной смерти, клетки могут быть вымыты с FWB с как низко как 0,5% плода телячьей сыворотки (FCS). Это позволит избежать слипания клеток. -
Приостановить и пятен ячеек на антитела с инструкциями производителя.
- Приостановить 5 x 107 клеток в 1 мл FWB и добавить 2 мкг анти Ly6C и анти CD115 помечены флуорофоров (по выбору исследователя). Для дальнейшего отличить CMP от moDC (оба-Ly6C - и CD115-), добавить 2 мкг антител анти CD11c (CMP являются CD11c-; moDC, CD11c+). Инкубируйте 30 мин на льду.
Примечание: На рисунке 3 был создан с помощью Ly6C-PE и CD115-APC.
- Приостановить 5 x 107 клеток в 1 мл FWB и добавить 2 мкг анти Ly6C и анти CD115 помечены флуорофоров (по выбору исследователя). Для дальнейшего отличить CMP от moDC (оба-Ly6C - и CD115-), добавить 2 мкг антител анти CD11c (CMP являются CD11c-; moDC, CD11c+). Инкубируйте 30 мин на льду.
- С помощью Пипетки серологические, добавьте 10 мл FWB и центрифуги на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
- Осторожно слить супернатанта и Вымойте гранулированных ячейки, добавив 30 мл FWB с Серологические Пипетки. Центрифуга на 250 x g при 4 ° C на 10 мин и повторять мыть.
- Перед отключением клетки, Флик трубки тщательно, чтобы выбить гранулы. Используйте Серологические Пипетки приостановить клеток в 1 x 10 FWB7 клеток/мл, и процеживают через фильтр ячейки 35 мкм. Используйте Серологические Пипетки для передачи фильтрованного клетки в полипропиленовые трубы и место на льду до готовности для сортировки.
Примечание: Если недоступен полипропилена, полистирола трубы белка с покрытием (обезжиренное сухое молоко или FCS) может использоваться для уменьшения привязки.
5. установить ворота, на основе контрольных образцов
Примечание: Для предотвращения разрушения клеток из-за давления потока высокоскоростной поток, используйте 100 – 130 мкм насадку для сортировки клеток.
-
Запустите неокрашенных управления (см. шаг 4.1) через ячейки сортировщик и применять ворота исключить мелких частиц мусора (низкая вперед разброс; FSC) и высоко гранулированный (высокой стороне разброс; SSC) частиц.
- Чтобы проанализировать лишь на более поздних этапах (моноциты, moMac/MoDP и MoDC), применяются стробирования только включить более крупных клеток (высокая FSC).
- Если используются жизнеспособности пятна, используйте их для исключить окрашенных, нежизнеспособных события (пример показан на рисунке 1).
- Запустить один флуоресцентные контрольные образцы через ячейки сортировщик и корректировать компенсацию по мере необходимости.
- Запуск образца multi меченых образца. Соблюдать четыре различных популяций: Ly6C + CD115-(ГИП), Ly6C + CD115 + (моноциты), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) и Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Примените ворота изолировать каждый из четырех основных групп населения.
Примечание: CMPs и moDC доля Ly6C-CD115-фенотип. Однако, они могут быть продифференцированы основаны на выражение CD11c: CMP не хватает CD11c, тогда как MoDCs Экспресс CD11c.
6. сбор изолированных популяций
- Подготовить коллекцию трубок, добавив достаточно FCS для достижения по меньшей мере 20% конечная концентрация при полной. Например при использовании 5 мл пробирок, добавляют 1 мл FCS до сортировки и снять трубку, когда он достигает 5 мл общий объем.
-
Чтобы избежать поглощения оборот и антитела мембраны, держите все образцы (смешанные и сортировка) при 4 ° C на протяжении сортировки.
- Если это не представляется возможным, держите трубку, содержащие клетки, чтобы быть отсортированы на льду как можно больше и передать сортировщик аликвоты, при необходимости.
- Кроме того передача отсортированные образцы для льда каждые 20 – 30 мин.
- После того, как были собраны нужное количество клеток, используйте Серологические Пипетки для передачи клетки на новой Конические трубки. Центрифуга на 250 x g при 4 ° C на 10 мин.
- Подтвердите чистоту анализ выполняемых после сортировки на небольших аликвоты каждого собранного населения.
- Удалить супернатант, приостановить в 10 мл FWB и центрифуги на 250 x g при 4 ° C на 10 мин повторить в общей сложности двух стирок.
Примечание: Это может быть трудно удалить супернатант без выбивании гранулы. Присоедините наконечник пипетки для вакуумной магистрали может помочь с удаления. Если это не доступно, предполагается, что супернатант собраны в свежий трубку при диссоциации Пелле. - После второго мыть удалите супернатант.
- Если пользователя экспериментальный дизайн диктует клетки быть повторно культивировали, выполните шаги 2.12 – 2.14. В противном случае если клетки будут использоваться для немедленного анализа, подготовьте ячеек в зависимости от желаемого протокола.
Примечание: На рисунке 4включен пример типичной функционального анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
В попытке сохранить как много каналов, доступных для анализа как можно, жизнеспособные клетки регулярно отбирались на основе прямых и сбоку разброс, за исключением очень маленьким и очень гранулированных событий (типичная ворота применяется ко всем, что точка участков в Рисунок 1A). Чтобы определить, если эта стратегия стробирования надежно исключить мертвые клетки, мы окрашенных с 7-аминокислоты актиномицин Д (7-AAD) (рис. 1B). 7AAD пятна ДНК в мертвые и умирающие клетки из-за проницаемости мембраны и исключается жизнеспособных клеток. Жизнеспособности клетки культивировали костного была проанализирована сразу послеуборочных (PH) и 1, 3 и 5 клеток тел сразу проанализированы PH ГМ-КСФ имел примерно 10% 7-AAD позитивных клеток, когда типичный FSC/SSC ворота был применен к свежевыделенных клеток от кости костного мозга (рис. 1, после сбора урожая). Аналогичная доля мертвых клеток присутствовал также на день 3 (~ 11%), культуры (рис. 1, 1 день PH и 3 дня PH) и день 1 (~ 12%). К 5-й день количество мертвых клеток в ворота был сокращен до ~ 5% (рис. 1, 5 дней PH). Таким образом используя такой жизнеспособности ворота обычно подходит для сортировки на 5 день и после. Поэтому если пользователи ограничены в их доступных параметров, FSC/SSC стробирования подходит как правило. Однако, для более чувствительных анализов (особенно если они полагаются на число точных клеток) включать жизнеспособности пятно (предложение).
Многие протоколы для распространения дендритных клеток рекомендуем истощение линии клеток, особенно лимфоцитов, из костного мозга до культуры 11,17. Считается, что эта процедура повышения чистоты оправился после ГМ-КСФ опосредованной дифференцировки клеток. Как правило клетки, выражая маркеров Т-клеток (CD3), B-клеток (CD45R или CD19) и НК-клеток (NK1.1) могут быть исчерпаны положительный выбор, используя магнитные бусы или ячейку Сортировка 11,17,18. Однако основываясь на системе культивирования, лимфоцитов были редко восстановлены или обнаружены в этих анализов. Таким образом мы стремились оценить долголетия лимфоцитов, в Ly6C-CD115-населения среди ГМ-КСФ driven клеток (рис. 2A). ГМ-КСФ культивированный костного мозга, клетки (которые не были истощены линии) окрашивали антитела CD3, CD45R и NK1.1 (в том же Флюорофор) и ежедневно измеряется проточной цитометрии (Рисунок 2Б). В пределах Ly6C-CD115-населения CD3/CD45R клеток сильно сохраняются через дней 0-3 (рис. 2B). На 4 день остались только несколько CD3/CD45R положительные клетки и день 5 и 6, были не CD3/CD45R, выражая клетки присутствуют. Таким образом в течение 4 дней культуры в ГМ-КСФ, линии позитивные клетки были по существу отсутствует и не были обнаружены на всех в дни 5 и 6 культуры.
В состав ГМ-КСФ управляемый клеточной культуры меняется ежедневно в этой системе, как клетки развиваются и дифференцировать (Таблица 1; Рисунок 3). В начале моменты времени наиболее обильные клетки предшественники и прекурсоров и в позднее время большинство клеток являются более дифференцированной 10. Чтобы определить, как сортировка в разные дни культуры могут повлиять на последующие пути развития или кинетики, сорта были проведены 3, 5 и 7 дней PH (рис. 3A). Развитие MoMac населения (Ly6C-CD115 +) затем отслеживается за еще 2-3 дней в культуре (рисунок 3B-3D).
При сортировке 3 дня PH, только 40% Ly6C-CD115 + клеток снизился CD115 выражение в течение 24 ч после сортировки (PS) (рис. 3B). 48 ч PS дроби, вниз регулировало CD115 составила 66% и 72 ч, 70% клеток имел этот фенотип. Эта Фенотипическая композиция была сохранена (~ 70-72% Ly6C - CD115-) даже после дальнейших дней культуры (данные не показаны). При сортировке 5 дней PH, ~ 75% клеток были Ly6C - CD115-, имея быстро вниз регулируется CD115 в течение 24 ч PS и ~ 80% были CD115 - после только 48 ч. Это распределение осуществлялось после 72 ч (рис. 3 c). Наконец при сортировке 7 дней PH, вниз регулирование CD115 также был довольно быстрым. В течение 24 ч Л.С. ~ 75% клеток было вниз регулируется CD115 выражение, и эта тенденция была сохранена после 48 ч (рис. 3D). Интересно, что при сортировке на 7 день, общий уровень экспрессии CD115 был ниже на клетки в CD115 + населения.
Таким образом эти результаты показывают, что кинетика развития несколько медленнее, при сортировке в начале дня, такие, как день 3 сортировка клеток, по сравнению с более быстрое развитие и дифференциация наблюдается после сортировки на день 5 или 7. На основе этих результатов, пользователь ищет большего числа moDC следует скорее всего рода день 5 или 7.
Созревание ответ DC является хорошо установленным 6,7,12,14. При обработке различных патоген связанные молекулярные структуры (PAMPs), незрелых DC вверх регулируют выражение костимуляторных молекул MHC и провоспалительных цитокинов, повышение их активация Т клеток емкость 6. Однако это менее ясно, когда развивающихся клеток получить способность реагировать PAMP стимуляции и какие функции DC созревания они могут демонстрировать. Чтобы определить, какие из отсортированных населения будет реагировать на раздражители созревания, вскоре после сортировки с коктейлем PAMPs, включая поли я лечился каждой популяции: C, липополисахаридов (ЛПС) и ВПУ ДНК, чтобы вызвать Толл подобный рецептор (TLR) 3 (TLR3), TLR4 и TLR9, соответственно. Клетки были лечение (или не лечить) за 24 часа и выражение CD86 и MHCII был измерен проточной цитометрии (рис. 4A-4B). Кроме того производство Ил-12p 40/70 и IL-6 в supernatants измерялась цитокина массив ELISA (рис. 4 cсостав).
CMPs и ГИП выразил очень низкий уровень MHC класса II и CD86 в состоянии кератоз и эти выражения, что шаблоны существенно не изменяется под воздействием коктейль PAMPs (рис. 4A и 4B). Аналогично выражение гистосовместимости, моноциты было также низкой и немного изменено, после PAMP экспозиции (рис. 4A). Однако выражение CD86 было умеренным на моноциты 24 ч после сортировки, и он вырос, далее следуя 24 h стимуляции. Высокий базальный выражение MHC класса II и CD86 в MoMacs и MoDCs было отмечено, и обе популяции выставлены сильное всасывание этих молекул при стимуляции PAMP. С точки зрения MHC класса II выражение после стимуляции был никакой статистической разницы между CMPs, ГИП и моноцитов, в то время как MoMacs и MoDCs образовали отдельной группы. Тем не менее с точки зрения CD86 выражение, CMPs и ГИП клетки были статистически отличается от MoMacs и MoDCs. Однако моноциты не отличается от MoMacs или MoDCs.
Далее мы хотели бы оценить относительную способность каждого из пяти популяций производить цитокинов в ответ на стимуляции TLR. Таким образом мы провели цитокина пробирного отсортированный населения после того, как в наличие или отсутствие агониста TLR коктейль культуры использовали выше. Клетки были культивируемых с стимулы для 24 ч, затем supernatants были собраны. Мы наблюдали очень мало Ил - 12 p 40/70 или ИЛ-6 производства CMPs после стимуляции TLR (рис. 4 cсостав). Второй населения, ГИП, были не в состоянии производить Ил-12p 40/70 (рис. 4 c), но эти клетки производятся низкое количество ИЛ-6 после стимуляции, PAMPs (рис. 4 d). Самые высокие уровни цитокина производства наблюдались в последние три популяции. Моноциты и MoMacs были очень похожие шаблоны и величины цитокиновой продукции. Оба значительно увеличилось Ил - 12 p 40/70 и незначительно увеличил производство ИЛ-6 до стимуляции (рис. 4 cсостав). Интересно, что при наличии PAMPs MoDCs не увеличивается секрецию Ил-12 p 40/70; Однако эта группа населения значительно увеличил производство ИЛ-6 (рис. 4 cсостав). Эти заключения показывают, что отсортированный населения сохранить их иммунологической функции после изоляции.
Рисунок 1: жизнеспособных клеток внутри вперед против разброс стороне ворот. Костного мозга мыши был культивировали в ГМ-КСФ, и жизнеспособности была измерена с помощью 7-AAD (7-амино дактиномицин D) пятная после уборки урожая (PH) и 1, 3 и 5 дней после сбора урожая. (A) жизнеспособных клеток были отобраны путем применения ворот (жизнеспособные), который опущен малых и весьма гранулированных событий на основе FSC и SSC. (B) гистограммы 7-AAD окрашивания генерируется из событий в жизнеспособные (FSC/SSC) ворота. Положительное для 7-AAD события указывают проходят apoptosis клетки. Стрелки указывают стробирования жизнеспособных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: лимфоцитов в пределах Ly6C-CD115-населения. Костного мозга мыши был культивировали в ГМ-КСФ и маркеры лимфоцитов (CD3, CD145R и NK1.1) были проанализированы ежедневно проточной цитометрии. (A) клетки окрашивали Ly6C-PE и CD115-APC для выявления Ly6C-CD115-клеток. Квадрант ворота был применен основе элементов одного цвета. Псевдоцветном точка сюжет из день 0 (B) CD3, CD45R и NK1.1 выражение Ly6C-CD115-клеток было проанализировано на день урожая (день 0) до 6 день. Клеток были нормализованы в режиме с использованием потока cytometry анализ программного обеспечения. Стрелка указывает на Ly6C-CD115 - стробирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: кинетика развития Ly6C-CD115 + клеток после сортировки в разные дни. (A) мыши костного был собран и культивировали в ГМ-КСФ. Аликвоты 1 x 10-7 клеток были заготовленной (B) 3, (C) 5, или (D) 7 дней после сбора урожая (PH). В указанные дни PH, Ly6C-CD115 + клетки были отсортированы от смешанные культуры (Предварительная сортировка) и проанализированы сразу после сортировки (PS). Отсортированный клетки были повторно культивировали в ГМ-КСФ, и изменения в выражении Ly6C/CD115 были проанализированы ежедневно проточной цитометрии. Коробки и стрелки указывают сортировки ворота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: созревания и цитокина выражение после стимуляции TLR. Клетки были отсортированы в 5 населения на 3 день культуры в ГМ-КСФ. Затем они лечили коктейль PAMPs (LPS, поли я: C и ВПУ ДНК) за 24 ч. означают интенсивности флуоресценции (MFI) класса II MHC (A) и (B) CD86 была проанализирована сразу после сортировки (PS) и 24 ч с и без PAMPs, проточная цитометрия. Планки погрешностей представляют собой стандартное отклонение 3-5 реплицировать экспериментов. (C) Ил - 12 p 40/70 и (D) ИЛ-6 в supernatants от 3 проб имелось были измеряется цитокина массив дот-блот ИФА после 24 ч с и без PAMPs. RLU; Относительные единицы легких; -/ + указывают на наличие клеток поверхности маркера для места для населения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| День 3 | День 5 | День 7 | |||||
| Фенотип | Тип ячейки | Мин | Макс. | Мин | Макс. | Мин | Макс. |
| Ly6C-CD115-CD11c - | CMP | 3 х 106 | 4 x 10-6 | 5 x 105 | 1 x 10-6 | Н/д | Н/д |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 10-6 | 3 х 106 | 2 x 10-6 | 3 х 106 | Н/д | Н/д |
| Ly6C + CD115 + | Моно | 2 x 10-6 | 3 х 106 | 2 x 10-6 | 3 х 106 | 5 x 105 | 1 x 10-6 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 105 | 1 x 10-6 | 3 х 106 | 4 x 10-6 | 3 х 106 | 4 x 10-6 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | MoDC | Н/д | Н/д | 5 x 105 | 1 x 10-6 | 3 х 106 | 4 x 10-6 |
Таблица 1: Предполагается, что минимальное и максимальное количество ячеек восстановлены после сортировки в ячейки 1 x 10-7 . CMP (общие миелоидного progenitor); GMP (предшественники гранулоцитов/макрофагов) моно (моноциты); MoMac (моноцитарных макрофагов); MoDC (моноцитарных дендритных клеток); Н/д (нет в наличии); Min (минимальная клеток выход из ячейки 1 x 10-7 ); Max (максимальная клеток выход из ячейки 1 x 10-7 ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Этот протокол способствует изоляции ГМ-КСФ driven прародителем и прекурсоров типов клеток в количествах, достаточных для нескольких видов анализов, включая биохимические анализы, анализов клеточную функцию в пробирке, или инстилляции в естественных условиях. Этот метод представляет собой значительный шаг вперед в области развития моноцитарных дендритных клеток, позволяя надежной изоляции и идентификации клеток в начале этого пути развития, а также те типы дифференцированных клеток чаще изолированные в предыдущих исследований.
Предыдущих протоколов для изоляции прародителями и прекурсоров, созданный из костного мозга в vitro полагались на CFSE-окрашивание для выявления пролиферативной прогениторных клеток 17 или окрашивание с CD31 и Ly6C как маркеры миелоидных клеток 18 . CFSE, окрашивание Протокол описан Naik был разработан для использования в поколение управляемых Flt3L DC прародителями и прекурсоров 17. Когда мы пытались этот подход в системе культуры ГМ-КСФ, мы столкнулись с двумя основными вопросами. CFSE было несколько цитотоксических развивающихся клеток и была настолько яркой (даже в разделенных ячеек), что затрудняет компенсации. Этот подход оказался непригодным для наших целей изоляции ранних типов клеток (предшественники), а также клетки по всему спектру развития, от высокой пролиферативной (CMPs/ГИП) для высокоразвитых (MoDC/MoMac). Мы также стараемся стратегию сортировки для ГМ-КСФ driven клетки описано Leenen группой, которая была основана на CD31 и Ly6C 18. Однако мы обнаружили, что CD31 было проблематичным. Это было выражено на очень низком уровне (что делает его трудно решить население чистой сортировки), исчезающе малой подмножество ячеек и только очень рано, в период культуры. В самом деле обнаружен прошлых 2 день культуры в ГМ-КСФ 10был не CD31 выражение.
Ly6C, однако, был весьма полезным молекулы для разделения клетки на разных стадиях развития ввиду его временной схеме выражение 10. Добавление CD115 позволила нам различать более тесно клетки на промежуточных и более поздних этапах развития, что не было возможно с CD31. Мы также рассмотрели другие маркеры прародителями CD34 и CD117 надежде изоляции большого числа этих ранних клеток 10. Однако, в отличие от сообщили в системе Flt3L, мы обнаружили, что CD34 и CD117 были также высказаны на очень небольшое подмножество ячеек и практически отсутствовали в день 3 культуры 17. Эти маркеры стволовых клеток может быть полезным в будущих исследованиях однако, чтобы отличить подмножества в рамках населения CMP или GMP.
Существует несколько возможных поправок к протоколу, которые могут повлиять на выход желаемых клеточных популяций. Во-первых пользователь может выбрать применить жизнеспособности пятно, чтобы исключить любой мертвые клетки. Основываясь на наблюдениях, скорость мертвых клеток в течение типичного вперед и стороны точечной ворота являются сравнительно низкими в целом и создают проблемы только в течение первых нескольких дней культуры, совпадающих с уменьшается в lineage положительные лимфоциты. Однако для приложений, в котором ячейки номера должны быть точными, жизнеспособность пятно будет гарантировать исключение мертвых клеток.
Вторая модификация потенциал является истощение lineage позитивных лимфоцитов до культуры. Мы пробовали этот подход к решению небольшая популяция линии позитивных клеток, которые регулярно наблюдались в пределах Ly6C-CD115-клеток населения. Урожайность ячейки был несколько ниже в дни 5 и 6, и чистоту не был значительно выше (данные не показаны). Таким образом чистота не оправдывает снижение урожайности. Аналогичным образом если пользователь планирует сортировки на 5 день или после, частота лимфоцитов в культуре намного ниже 1% и не должен представлять собой проблему.
Наконец потому что эта стратегия предназначена для изоляции клетки спектра большого развития пользователь должен адаптировать сроков их рода, чтобы собрать как многие из желаемых населения как можно скорее. Эта стратегия сортировки добросовестно дает типы клеток, указывается независимо от дня культуры, на котором сортируются клеток. Например клетки с фенотипом Ly6C + CD115-CD11c-являются верными GMP фенотипа и функции аналогично ли они сортируются и изолированные на день 3 или 5 культуры. Однако частота этих клеток на 3 день гораздо больше 5, так что если цель заключается в изоляции этого типа ячейки, будет рекомендовано сортировка на 3 день. Примечательно также, что клетки отсортированы на 3 день прогресс через последующие этапы развития с кинетики медленнее, чем если они были отсортированы по день 5 или 7 (рис. 3).
Хотя этот метод позволяет для четкого и изоляции отдельных популяций 5 – 6 вдоль развития спектра, скорее всего есть много больше населения или переходные этапы на этом пути. В рамках каждой из пяти описанных населения может быть несколько подгрупп населения в слегка различных шагом развития. Например мы наблюдали «собственный» населения с промежуточными уровнями CD115 и Ly6C которые проходят несколько различных моделей развития, с точки зрения как много moMac и moDC, сформированных (данные не показаны). Это также вероятно, что население ранее наблюдали в vivo присутствуют в культуре и система сортировки, но они были трудно определить из-за их очень низкой частоты. Население cMOP 19, MDP 20или 21 CDP вероятно настоящее, но может быть скрыт в пределах крупных групп населения. Будущие исследования необходимо будет разъяснить многочисленные этапы развития, которые могут быть изолированы с добавлением определенных маркеров дифференциации в рамках этой сортировки. Значение этой сортировки стратегии является, что она позволяет последовательно изоляции большого числа развивающих этапов в ходе онтогенеза DC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют конфликты не разглашать.
Acknowledgments
Мы благодарны за технической помощи от Элисон церковь птица в Auburn университета Школа по ветеринарной медицины потока цитометрии объект, для финансирования из низ EHS R15 R15 AI107773 и клеточной и молекулярной биологии программа в университете Оберн для летних исследований финансирование PBR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
- Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
- Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
- van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
- Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
- Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
- Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
- Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
- Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
- Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
- Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
- Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
- Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
- Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
- Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
- Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
- Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
- Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
- Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
- Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
- Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
- Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).
