Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57365
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Auburn University

Summary

Hier bieden we een methode voor het vaststellen en isoleren van grote aantallen van GM-CSF gedreven myeloïde cellen met hoge snelheid cel sorteren. Vijf verschillende populaties (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen, granulocyt/macrofaag progenitoren monocyten, monocyt-afgeleide macrofagen en monocyt-afgeleide DCs) kunnen worden geïdentificeerd op basis van Ly6C en CD115 expressie.

Abstract

Culturen van monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDC) gegenereerd uit beenmerg van de muis met behulp van granulocyt-Macrophage kolonie stimulerende Factor (GM-CSF) zijn onlangs bekroond meer een heterogeen beeld vertonen dan eerder gewaardeerd. Deze culturen worden routinematig moDC evenals monocyt-afgeleide macrofagen (moMac) en zelfs sommige minder ontwikkelde cellen zoals monocyten bevatten. Het doel van dit protocol is bedoeld als een consistente methode voor de identificatie en de scheiding van de vele celtypes aanwezig in deze culturen zoals zij ontwikkelen, zodat hun specifieke taken kunnen verder worden onderzocht. De sorteer-strategie gepresenteerde scheidt cellen eerst in vier bevolkingsgroepen op basis van uitdrukking van Ly6C en CD115, die beide worden uitgedruct in Transient door cellen ontwikkelen ze in GM-CSF-gedreven cultuur. Deze vier populaties omvatten gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen of CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyt/macrofaag progenitoren of GMP (Ly6C +, CD115-), monocyten (Ly6C +, CD115 +), en macrofagen monocyt-afgeleide of moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c wordt ook toegevoegd aan het sorteren strategie om te onderscheiden van de twee bevolkingsgroepen binnen de Ly6C-, CD115-bevolking: CMP (CD11c-) en moDC (CD11c +). Tot slot kunnen twee populaties verder worden onderscheiden binnen de Ly6C-, CD115 + bevolking op basis van het niveau van de MHC klasse II expressie. MoMacs express lagere niveaus van MHC klasse II, terwijl een monocyt-afgeleide DC voorloper (moDP) hogere MHC klasse II spreekt. Deze methode zorgt voor de betrouwbare isolatie van verschillende ontwikkelingsachterstand verschillende populaties in getallen voldoende voor een scala aan functionele en developmental analyses. We benadrukken dat een dergelijke functionele uitlezing, de differentiële reacties van dit type cel op stimulatie met Pathogen-Associated moleculaire patronen (PAMPs).

Introduction

Kweken van lymfkliertest beenmergcellen met de cytokine wordt granulocyt-Macrophage kolonie stimulerende Factor (GM-CSF) veel gebruikt als een methode voor het genereren van monocyt-afgeleide dendritische cellen (moDC; ook bekend als inflammatoire DC) in grote aantallen 1, 2,3,4,5. Deze cellen zijn uiterst nuttig in een aantal studies van dendritische cellen (DC) functie 6,7,8. Meestal deze lymfkliertest beenmergcellen zijn gekweekte voor 6-8 dagen en worden vervolgens gebruikt voor de studie van dendritische cel functie 5. Deze culturen had lang beschouwd als meestal homogene, bestaande uit een meerderheid van gedifferentieerde moDC. Meer recentelijk is gebleken dat aan het einde van deze periode van 6-8 dagen cultuur, er inderdaad vele moDC, evenals een grote subset van gedifferentieerde monocyt-afgeleide macrofagen (moMacs) 9,10,11 zijn. Onze eigen studies hebben deze bevindingen aan te tonen dat andere deelverzamelingen van minder ontwikkelde cellen, zoals moDC precursoren (moDP) en monocyten, zelfs na 7 dagen 10in de culturen met lage frequentie blijven verder uitgebreid. Aldus, kon studies van dendritische cellen (DC) functie met behulp van cellen die zijn gegenereerd door dit systeem de reacties van een bredere cohort van celtypes weerspiegelen dan eerder gewaardeerd.

We hebben veel geleerd uit de studie van GM-CSF-gegenereerd moDC met betrekking tot de functie van deze cellen in de laatste stadia van differentiatie 12,13,14. Wij begrijpen echter aanzienlijk minder over de ontwikkelings traject van deze cellen 2,15,16 en van hoe en wanneer zij specifieke vertonen functies zoals: Pathogen verbonden moleculaire klantgerichtheid Patronen (PAMPs), fagocytose, antigeen processing en presentatie 13en anti-bacteriële activiteit. Een protocol voor het isoleren van grote aantallen van conventionele Flt3L-gedreven DC progenitoren en precursoren geweest gerapporteerde 17. Isolatie van deze verschillende populaties tot stand gekomen met behulp van carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-gekleurd beenmergcellen (voor het bijhouden van scheidslijn cellen) en cultuur in Flt3L voor 3 dagen. Cellen werden dan uitgeput van linage positieve cellen en gesorteerd in voorlopercellen en voorloper populaties op basis van CD11c expressie 17. Een andere benadering van Leenen de Fractie op het identificeren van vroege progenitorcellen van DC in GM-CSF-gedreven cultuur moest sorteren van cellen op basis van CD31 en Ly6C 18. Het oorspronkelijke doel was om een soortgelijke methode voor het verkrijgen van de progenitoren en precursoren van GM-CSF-gedreven moDC. Als gevolg van de specifieke celtypes gegenereerd door GM-CSF, aangepast we de aanpak en sorteren van de strategie die gebaseerd is op de expressie van de moleculen die werden uitgedrukt in vroege en latere stadia van ontwikkeling. We uiteindelijk vastgesteld dat Ly6C, CD115 (CSF-1-receptor), en CD11c waren de beste markers voor 10onderscheiden deze cel typen.

Hier presenteren we een methode voor het isoleren van cellen in meerdere verschillende stadia van ontwikkeling langs het traject van differentiatie gedreven door GM-CSF: gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen (CMP), granulocyt-Macrophage voorlopercellen (GMP), monocyt, monocyt-afgeleide Macrophage (MoMac) en monocyt-afgeleide DC (MoDC). De moMac bevolking kan worden verder gescheiden gebaseerd op niveau van MHC klasse II expressie, onthullend een moDC voorloper bevolking (moDP) 10. Wij gebruiken een high-speed fluorescentie-activated cell sorting (FACS) strategie om te isoleren van deze 5 bevolkingsgroepen op basis van expressie van Ly6C, CD115 en CD11c. Wij tonen dan de behandeling van deze cellen in functionele assays onthullen hun reacties op PAMP stimulatie.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierlijke werk werd goedgekeurd door de Auburn University institutionele Animal Care en gebruik Comité overeenkomstig de aanbevelingen die worden beschreven in de gids voor de zorg en het gebruik van proefdieren van het National Institutes of Health.

1. voorbereiding voor het beenmerg collectie

  1. Bereiden van 250 mL volledig media door toevoeging van een oplossing van Roswell Park Memorial Instituut (RPMI) 1640 medium aangevuld met 10% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine en 50 µM 2-mercaptoethanol naar de top van een 0,22 µm vacuüm filter kolf eenheid en vacuüm van toepassing.
    Opmerking: Complete medium kan worden achtergelaten bij 4 ° C voor maximaal 2 maanden.
  2. Bereid 70% ethanol-oplossing door het mengen van 350 mL ethanol 100% met 150 mL steriele H2O in een maatkolf van 500 mL.
  3. Set centrifuge tot 4 ° C.
  4. Steriliseren pincet, scalpel en schaar in 70% ethanol.
  5. Met behulp van een serologische precisiepipet, voeg 5 mL van de volledige media aan drie petrischalen van 60 mm.
  6. Met behulp van een serologische precisiepipet, Voeg 30 mL volledige media aan een conische buis van 50 mL.

2. verzameling van lymfkliertest beenmergcellen

  1. Een C57BL/6 muis euthanaseren door CO2 versuffing overeenkomstig de voorschriften die zijn vastgesteld door de 2013 Amerikaanse veterinaire medische vereniging (AVMA) richtsnoeren inzake euthanasie.
  2. Verwijder en strippen van de achterpoten.
    1. De achterpoten en de torso te verzadigen met 75% ethanol en ondiepe snoeien via de huid rond het heupgewricht met een gebogen weefsel schaar. Met behulp van Tang, stevig Trek de huid van de heup naar beneden richting de enkel, onthullen de spier. Gebruik schaar te verwijderen van de klep van de huid.
    2. Verwijder de hele achterpoot door doorsnijden van het bot net boven het dijbeen/heupgewricht.
      Opmerking: Naast het steriliseren van het gebied, de ethanol zal steun bij het verstrekken van schone bezuinigingen en haar verhinderen besmetting van de monsters.
    3. Als de benen zal worden overgebracht naar een nieuwe locatie voor het oogsten van beenmerg, dompelen de poten in volledige media.
  3. Werken in een steriele bioveiligheid kabinet, de benen naar één van de eerder bereid petrischalen overbrengen.
  4. Gebruik schaar te knippen het net onder de enkel, en zorgvuldig Verwijder zo veel van het spierweefsel en elastisch bindweefsel mogelijk. Het schoongemaakte bot overbrengen in de tweede bereid petrischaal.
    Opmerking: Hoewel het niet nodig om alle de spier, teveel resterende weefsel kan het moeilijk maken om te spoelen van het beenmerg.
  5. Het scheiden van het bovenbeen, knie en onderbeen.
    1. Met behulp van Tang, houden van het been bij de knie en zoek het merg.
      Opmerking: het beenmerg moet zichtbaar als een vage rode lijn in de holte van het bot aan de bovenkant van het dijbeen en tegen het einde van het scheenbeen.
      1. Met behulp van schaar, maken drie bezuinigingen als volgt.
        1. Snijd het scheenbeen net boven waar het merg lijkt te eindigen.
        2. Gesneden net onder het kniegewricht.
        3. Gesneden net boven het kniegewricht.
        4. Als het heupgewricht nog steeds met het dijbeen verbonden is, gesneden net onder het heupgewricht.
      2. De drie fragmenten terug te keren naar de petrischaal en herhaal dit proces op andere been.
  6. Spoel het beenmerg van het bovenbeen en onderbeen.
    1. Vul een 10 mL spuit met volledige media uit de conische tube van 50 mL en cap met 23 G naald.
    2. Houd het bot met een tang boven de derde bereid petrischaal en schuif de naald in het bot-kanaal en duw media via, spoelen uit de cellen (die kunnen ontstaan als een intact "plug" of als meerdere clusters). Herhaal totdat er geen meer kleur kan worden gezien door het been. De spuit met media zo nodig bijvullen.
  7. Plet de epifyses.
    1. Terwijl nog in de tweede petrischaal, houdt de knieschijf vast met een tang, en prak de knieën met het topje van de spuit. Totdat de epifyses zijn niet langer rood.
  8. Met behulp van de spuit, overbrengen in de cellen van de tweede en derde petrischaal de tube van 50 mL. Uiteenvallen van klontjes door pipetteren zachtjes op en neer. Probeer niet te genereren van de bubbels. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  9. Lyse van rode bloedcellen
    1. Verwijderen van supernatant met serologische Pipet, pellet verjagen door flicking en lyse van rode bloedcellen door in 1 mL lysisbuffermengsel ACK (Ammonium-Chloride-kalium) voor 1 minuut bij kamertemperatuur incuberen.
    2. Met behulp van een serologische precisiepipet, voeg 40 mL HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) buffer.
  10. Met behulp van een serologische precisiepipet, filtreer de cellen al een 70 µm cel zeef in een nieuwe conische tube van 50 mL. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  11. Met behulp van een serologische precisiepipet, bezinken en wassen cellen met 40 mL van volledige media verwijderen. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    Opmerking: In dit stadium, lineage positieve lymfocyten kunnen worden verwijderd door FACS of magnetische kolom zuivering. Lymfocyten worden echter niet onderhouden op lange termijn in cultuur. Hoewel een groot aantal lineage positieve cellen aanwezig in de Ly6C-CD115-bevolking in het beenmerg ex vivo zijn, bijna allemaal afwezig zijn door dag 5 (Figuur 2).
  12. Met behulp van een serologische precisiepipet, verwijder het supernatant en cultuur van de beenmergcellen in volledige media met 10 ng/mL van recombinante muis GM-CSF bij een dichtheid van 1 x 106 cellen/mL.
    Opmerking: Doorgaans, 4 x 107 totaal aantal cellen geoogst kunnen worden na een lysis van de rode bloedcellen. Echter, verwachten zo weinig zoals 2 x 107 voor beginners en maximaal 5 x 107 cellen voor ervaren rooiers.
  13. Met behulp van een serologische precisiepipet, de cellen overbrengen naar weefselkweek platen, en Incubeer bij 37 ° C in 5% CO2. Als met behulp van een 24-well plaat, elk zaad goed met 2 mL celsuspensie.
  14. Elke 48 h, kunt een serologische pipet verwijderen helft van de media en vervangt door vers volledige media en GM-CSF.
    Opmerking: Culturen kunnen worden gehouden tot 9 dagen. Maar de samenstelling verandert na verloop van tijd. Zie hoofdstuk 3 voor meer informatie.

3. keuze dag soort

  1. Als cel bevolking composities na verloop van tijd veranderen, een dag dat de opbrengst van het hoogste aantal gewenste cellen selecteren.
  2. Zie tabel 1 voor de verwachte cel opbrengst post sorteren voor elk van de bevolking na 3, 5 en 7 dagen van de cultuur in GM-CSF per 1 x 107 cellen.

4. vlekken van strategie

  1. Gebruik kleine porties van cellen te bereiden controlemonsters. Een onbevlekt besturingselement, compensatie controlemonsters gekleurd met slechts één fluorescent antibody elke, opnemen en fluorescentie-min-één regelt in welke alle antilichamen worden toegevoegd met uitzondering van één, om te bepalen voor niet-specifieke fluorescentie in dat kanaal. Als primaire alleen, secundaire alleen, met behulp van indirecte etikettering, omvatten en zowel primaire en secundaire.
    Opmerking: Phycoerythrin (PE) en allophycocyanin (APC) gelabeld antilichamen bieden duidelijke scheiding met minimale afloop wanneer samen gebruikt. Echter als fluorescerende opties beperkt zijn, CD115 uitgedrukt op een relatief laag niveau, terwijl Ly6C wordt uitgedrukt op een zeer hoog niveau. Daarom, helderder fluorochromes zijn wenselijk voor anti-CD115 en anti-Ly6C fluorochromes zijn gekozen om te voorkomen dat afloop.
  2. 100 mL van FACS Wash Buffer (FWB) bereid door het mengen van 97 mL gekoeld Dulbecco van fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) met 3 mL foetaal kalfsserum in een conische tube van 50 mL en plaats in een ijsbad.
  3. Gebruik een pipet te voorzichtig, maar grondig, Pipetteer cellen op en neer om te verjagen losjes Adherente cellen.
  4. Met behulp van een serologische precisiepipet, overbrengen in cellen een conische tube van 50 mL. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    1. Als cel volume 50 mL overschrijdt, cellen overbrengen in het benodigde aantal buizen en combineren bij de kleuring stap.
  5. Zachtjes giet af het supernatant en wassen van de Ingehuld cellen door toevoeging van 30 mL FWB met een serologische pipet. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 min, en herhaal het wassen.
    Opmerking: Als hoge celdood wordt verwacht, kunnen de cellen worden gewassen met FWB met zo laag als 0,5% foetaal kalfsserum (FCS). Hierdoor zal het samendoen van de cel.
  6. Schorten en vlek cellen per de instructies van de fabrikant van de antilichaam.
    1. 5 x 107 cellen in 1 mL FWB schorten en voeg 2 µg van anti-Ly6C en anti-CD115 met het label met de fluorophores (van de onderzoeker van de keuze). Toevoegen om te verder onderscheiden CMP van moDC (allebei zijn Ly6C- en CD115-), 2 µg van anti-CD11c antilichamen (CMP zijn CD11c-; moDC zijn CD11c+). Incubeer gedurende 30 min op ijs.
      Opmerking: Figuur 3 werd gegenereerd met behulp van Ly6C-Pet en CD115-APC.
  7. Met behulp van een serologische precisiepipet, voeg toe 10 mL FWB en centrifuge bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
  8. Zachtjes giet af het supernatant en wassen van de Ingehuld cellen door toevoeging van 30 mL FWB met een serologische pipet. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 min, en herhaal het wassen.
  9. Voordat de cellen wordt verbroken, flick buis grondig te verjagen van de pellet. Gebruik een serologische pipet te schorten cellen op 1 x 107 cellen/mL FWB, en filtreer door 35-µm cel filter. Gebruik een serologische pipet om gefilterde cellen Pipetteer in polypropyleen buis en plaats op ijs totdat u wilt sorteren.
    Opmerking: Als polypropyleen niet beschikbaar is, eiwit coating (nonfat droge melk of FCS) polystyreen buizen kunnen worden gebruikt om bindende.

5. Stel Gates op basis van controlemonsters

Opmerking: Om te voorkomen dat cel verstoring als gevolg van de druk van de snelle stroom stream, gebruik een 100-130 µm mondstuk voor het sorteren van de cel.

  1. Het Onbevlekt besturingselement uit te voeren (zie stap 4.1) via de cel sorter, en toepassing van een poort als u wilt uitsluiten van kleine puin (laag voorwaartse verstrooien; FSC) en uiterst granulaire (hoge kant verstrooien; WS) deeltjes.
    1. Als u wilt analyseren toepassing alleen de latere stadia (monocyten, moMac/MoDP en MoDC), gating alleen met grotere cellen (hoge FSC).
    2. Als levensvatbaarheid vlekken worden gebruikt, kunt u deze gebruiken om uit te sluiten van gebeitst, niet-levensvatbare evenementen (een voorbeeld wordt geïllustreerd in Figuur 1).
  2. De één fluorescerende controlemonsters doorlopen de cel sorter en compensatie naar wens aanpassen.
  3. Een monster van het multi-geëtiketteerden monster worden uitgevoerd. Observeren van vier verschillende populaties: Ly6C + CD115-(GGP's), Ly6C + CD115 + (monocyten), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), en Ly6C-CD115 - (CMPs/moDCs). Een hek om te isoleren van elk van de vier grote populaties van toepassing.
    Opmerking: CMPs moDC samen met het Ly6C-CD115-fenotype. Echter, zij kunnen worden gedifferentieerd op basis van CD11c expressie: CMP ontbreken CD11c, terwijl MoDCs express CD11c.

6. verzameling van geïsoleerde populaties

  1. Bereiden collectie buizen door toevoeging van genoeg FCS om ten minste 20% eindconcentratie wanneer volledige. Bijvoorbeeld, als u buizen van 5 mL, voeg 1 mL FCS voordat u sorteert, en verwijderen van de buis, wanneer het totale volume van de 5 mL wordt bereikt.
  2. Om te voorkomen dat membraan omzet en antilichaam opname, houden alle monsters (gemengd en gesorteerd) bij 4 ° C gedurende het sorteren.
    1. Als dit niet mogelijk is, houden de buis met de cellen om te worden gesorteerd op zoveel mogelijk ijs en aliquots aan de sorter overdragen zoals nodig.
    2. Bovendien overdracht gesorteerd op monsters aan ijs elke 20-30 min.
  3. Nadat het gewenste aantal cellen zijn verzameld, gebruiken een serologische pipet om de cellen naar een nieuwe conische buis. Centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 minuten.
    1. Bevestigen zuiverheid met post sorteren analyse van kleine porties van elke verzamelde bevolking.
  4. Verwijder het supernatant, schorten in 10 mL FWB en centrifugeer bij 250 x g bij 4 ° C gedurende 10 min. herhalen voor een totaal van twee wasbeurten.
    Opmerking: Het kan moeilijk zijn om alle de bovendrijvende vloeistof verwijderen zonder het loskomen van de pellet. Een pipet tip aansluiten in een vacuüm lijn kan helpen met de verwijdering. Als dit niet beschikbaar is, wordt voorgesteld dat het supernatant worden verzameld in een verse buis bij pellet dissociatie.
  5. Verwijder het supernatant na de tweede wash.
  6. Als de gebruiker proefopzet de cellen opnieuw worden gekweekt dicteert, stappen 2.12-2.14. Anders, als cellen wordt gebruikt voor onmiddellijke analyse, bereiden cellen volgens het gewenste protocol.
    Opmerking: Een voorbeeld van de typische functionaalanalyse is opgenomen in afbeelding 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

In een poging om te houden zo veel kanalen beschikbaar voor analyse als mogelijk, levensvatbare cellen werden routinematig geselecteerd op basis van de voorwaartse en zijdelingse scatter, met uitzondering van zeer kleine en zeer gedetailleerde gebeurtenissen (een typische gate wordt toegepast op alle de stip in figuur 1A percelen). Om te bepalen of deze gating strategie betrouwbaar dode cellen uitgesloten, gekleurd we met 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (figuur 1B). 7AAD vlekken van DNA in cellen van dode en stervende als gevolg van de membraan permeabiliteit, en wordt uitgesloten door levensvatbare cellen. Levensvatbaarheid van GM-CSF gekweekte beenmergcellen werd geanalyseerd onmiddellijk na de oogst (PH) en 1, 3 en 5 PH. cellen geanalyseerd onmiddellijk PH had ongeveer 10% van de 7-AAD positieve cellen als een typische FSC/SSC-gate werd toegepast op vers geïsoleerde cellen van het bot merg (Figuur 1, na de oogst). Een vergelijkbaar deel van de dode cellen was ook aanwezig op dag 1 (~ 12%) en dag 3 (~ 11%) van de cultuur (Figuur 1, 1 dag PH en 3 dagen PH). Tegen dag 5, was het aantal dode cellen binnen de poort verminderd tot ~ 5% (Figuur 1, 5 dagen PH). Dus, met behulp van dergelijke een levensvatbaarheid gate is over het algemeen geschikt voor het sorteren op dag 5 en na. Dus als gebruikers worden beperkt in hun beschikbare parameters, past FSC/SSC gating in het algemeen. Echter, voor de meer gevoelige testen (vooral als ze op precieze cel nummers vertrouwen), nemen een levensvatbaarheid vlek (suggestie).

Vele protocollen voor vermeerdering van dendritische cellen raden uitputting van lineage positieve cellen, met name lymfocyten, uit beenmerg voorafgaand aan cultuur 11,17. Deze procedure wordt gedacht aan het verhogen van de zuiverheid van de cellen hersteld bij GM-CSF-gemedieerde differentiatie. Doorgaans worden cellen uiten markers van T-cellen (CD3), B cellen (CD45R of CD19) en NK-cellen (NK1.1) kunnen worden uitgeput door positieve selectie met behulp van magnetische kralen of cel sorteren van 11,17,18. Echter, gebaseerd op het kweken systeem, lymfocyten werden zelden teruggewonnen of gedetecteerd in deze tests. Dus willen wij beoordelen de levensduur van lymfocyten gehandhaafd in de Ly6C-CD115-bevolking onder de GM-CSF-driven cellen (figuur 2A). GM-CSF gekweekte beenmerg cellen (die niet had lineage uitgeput) werden gekleurd met antilichamen tegen CD3, CD45R en NK1.1 (in de zelfde fluorophore) en dagelijks gemeten door stroom cytometry (figuur 2B). Binnen de Ly6C-CD115-bevolking blijvend CD3/CD45R positieve cellen sterk door dagen 0-3 (figuur 2B). Op dag 4, slechts een paar CD3/CD45R en positieve cellen bleef en dag 5 en 6, er waren geen CD3/CD45R uiten van cellen aanwezig. Zo, binnen 4 dagen van de cultuur in GM-CSF, lineage positieve cellen in wezen afwezig waren en waren helemaal niet gedetecteerd op de dagen 5 en 6 van cultuur.

De samenstelling van de GM-CSF-driven celcultuur verandert dagelijks in dit systeem als de cellen zich ontwikkelen en (tabel 1 onderscheiden; Figuur 3). Vroege tijd punten, de meest voorkomende cellen zijn progenitoren en precursoren en in later tijden de meerderheid van de cellen zijn meer gedifferentieerde 10. Om te bepalen hoe het sorteren op verschillende dagen van cultuur de daaropvolgende ontwikkelings pad of kinetiek kan beïnvloeden, werden soorten uitgevoerd 3, 5 en 7 dagen PH (figuur 3A). De ontwikkeling van de bevolking van MoMac (Ly6C-CD115 +) vervolgens werd bijgehouden 2-3 verdere dagen in cultuur (figuur 3B-3D).

Wanneer gesorteerd op 3 dagen PH, slechts 40% van de Ly6C-CD115 + cellen gedaald CD115 expressie binnen 24u na sortering (PS) (figuur 3B). Door 48u PS, de breuk die had CD115 down-geregeld was 66%, en door 72 h, 70% van de cellen had dit fenotype. Deze fenotypische compositie werd gehandhaafd (~ 70-72% Ly6C - CD115-) zelfs na verdere dagen van cultuur (gegevens niet worden weergegeven). Toen gesorteerd op 5 dagen PH, ~ 75% van de cellen waren Ly6C - CD115-, CD115 - na slechts 48 uur hebben snel omlaag-gereglementeerde CD115 binnen 24u PS en ~ 80% waren. Deze verdeling werd gehandhaafd na 72 uur (Figuur 3 c). Tenslotte, wanneer gesorteerd op 7 dagen PH, down-regulatie van CD115 was ook vrij snel. Binnen de 24u PS, ~ 75% van de cellen had down-gereglementeerde CD115 expressie, en deze tendens werd gehandhaafd na 48u (figuur 3D). Interessant, toen gesorteerd op dag 7, was het algemene niveau van CD115 expressie lager op de cellen binnen de bevolking CD115 +.

Dus, deze bevindingen wijzen erop dat de kinetiek van ontwikkeling zijn enigszins trager bij het sorteren op een vroege dag, zoals dag 3 gesorteerd op cellen ten opzichte van de snellere ontwikkeling en differentiatie waargenomen na sortering op dag 5 of 7. Op basis van deze resultaten, moet een gebruiker op zoek naar grotere aantallen moDC waarschijnlijk sorteren op dag 5 of 7.

De reactie van de rijping van DC is goed ingeburgerd 6,7,12,14. Wanneer behandeld met een verscheidenheid van pathogenen-geassocieerde moleculaire patronen (PAMPs), onvolwassen DC up-reguleren de expressie van MHC, costimulatory moleculen, en pro-inflammatoire cytokines, verbetering van hun capaciteit activeren van T-cel 6. Echter is het minder duidelijk als ontwikkelende cellen krijgen de capaciteit om te reageren PAMP stimulatie en welke functie van DC rijping zij kunnen vertonen. Om te bepalen welke van de gesorteerde bevolking zou reageren op stimuli van de rijping, elk volk kort na het sorteren met een cocktail van PAMPs met inbegrip van Poly ik werd behandeld: C, lipopolysacchariden (LPS), en apr DNA om te activeren van toll-like receptor (TLR) 3 (TLR3), TLR4 en TLR9, respectievelijk. Cellen werden behandeld (of onbehandeld) gedurende 24 uur en uitdrukking van CD86 en MHCII werd gemeten door stroom cytometry (figuur 4A-4B). Bovendien werd de productie van IL-12p 40/70 en IL-6 gemeten in het supernatant door cytokine matrix ELISA (figuur 4C-4D).

CMPs en GGP's uitgedrukt zeer lage niveaus van MHC klasse II en CD86 in een ongestimuleerde staat, en deze expressie patronen veranderde niet aanzienlijk bij blootstelling aan de cocktail van PAMPs (figuur 4A en 4B). Ook was de expressie van MHC klasse II door de monocyten ook laag en gewijzigde beetje bij PAMP blootstelling (figuur 4A). De expressie van CD86 was matig op de monocyten 24u na sortering echter, en het steeg verder na 24 h stimulatie. Hogere basale expressie van MHC klasse II en CD86 in de MoMacs en de MoDCs werd waargenomen en beide populaties tentoongesteld een sterke inductie van deze moleculen bij PAMP stimulatie. In termen van de MHC klasse II expressie na stimulatie, was er geen statistische verschil tussen de CMPs GGP's en de monocyten, terwijl de MoMacs en de MoDCs een aparte groep vormden. Toch, in termen van CD86 expressie, de cellen CMPs en GGP's waren statistisch anders dan MoMacs en MoDCs. Monocyten waren echter niet anders dan MoMacs of MoDCs.

Vervolgens wilden we het relatieve vermogen van elk van de vijf populaties te produceren van cytokines in reactie op de stimulatie van de TLR beoordelen. Dus wij uitgevoerd een cytokine assay op de gesorteerde populaties nadat cultuur in de aanwezigheid of afwezigheid van de cocktail TLR-agonist boven gebruikt. Cellen werden gekweekt met de stimuli voor 24u, waarna het supernatant werden verzameld. We hebben vastgesteld dat zeer weinig IL - 12 p 40/70 of productie van de IL-6 door CMPs op TLR stimulatie (figuur 4C-4D). De tweede bevolking, GGP's, konden voor de productie van IL-12p 40/70 (figuur 4C), maar deze cellen geproduceerd een lage hoeveelheid van de IL-6 op stimulatie door PAMPs (Figuur 4 d). De hoogste niveaus van cytokine productie werden waargenomen in de laatste drie populaties. Monocyten en MoMacs had zeer gelijkaardig patronen en omvang van cytokine productie. Beide sterk toegenomen IL - 12 p 40/70 en bescheiden verhoogde productie van de IL-6 van stimulatie (figuur 4C-4D). Interessant, verhogen in aanwezigheid van de PAMPs MoDCs niet de secretie van de IL-12 p 40/70; echter, deze bevolking sterk toegenomen productie van de IL-6 (figuur 4C-4D). Deze bevindingen wijzen erop dat de gesorteerde bevolking hun immunologische functies na isolatie behouden.

Figure 1
Figuur 1: levensvatbare cellen binnen Forward tegenover gate kant Scatter. Muis beenmerg werd gekweekt in GM-CSF en levensvatbaarheid werd gemeten met behulp van 7-AAD (7-amino-actinomycin D) kleuring na de oogst (PH) en 1, 3 en 5 dagen na de oogst. (A) levensvatbare cellen werden geselecteerd door een poort (levensvatbaar) die kleine en uiterst granulaire gebeurtenissen op basis van FSC en SSC weggelaten toe te passen. (B) histogrammen van 7-AAD kleuring gegenereerd op basis van gebeurtenissen binnen levensvatbaar (FSC/SSC) poort. Evenementen positief voor 7-AAD geven aan cellen apoptosis ondergaan. Pijlen geven aan levensvatbare cellen gating. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: lymfocyten binnen de Ly6C-CD115-bevolking. Muis beenmerg werd gekweekt in GM-CSF en markeringen van de lymfocyt (CD3, CD145R en NK1.1) werden dagelijks geanalyseerd door stroom cytometry. (A) cel werden gekleurd met Ly6C-PE en CD115-APC Ly6C-CD115-cellen worden geïdentificeerd. Kwadrant poort werd toegepast op basis van één kleur besturingselementen. Kleurcorrectie dot plot gegenereerd vanaf dag 0 CD3 (B), CD45R en NK1.1 uitdrukking van Ly6C-CD115-cellen werd geanalyseerd op dag van de oogst (dag 0) tot en met dag 6. Cellen werden genormaliseerd naar modus met behulp van een software van de analyse van de cytometry van de stroom. Pijl geeft aan dat Ly6C-CD115 - gating. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: kinetiek van de ontwikkeling van Ly6C-CD115 + cellen na sortering op verschillende dagen. (A) muis beenmerg werd geoogst en gekweekt in GM-CSF. Aliquots 1 x 107 cellen werden geoogst (B) 3, (C) 5, of (D) 7 dagen na de oogst (PH). Op de aangegeven dagen PH, Ly6C-CD115 + cellen waren van gemengde cultuur (pre soort) gesorteerd en geanalyseerd onmiddellijk na sortering (PS). Gesorteerde cellen waren opnieuw gekweekte in GM-CSF, en wijzigingen in Ly6C/CD115 expressie dagelijks werden geanalyseerd door stroom cytometry. Vak en pijl geven sorteren poort. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: rijping en cytokine-expressie na stimulatie van de TLR. Cellen werden ingedeeld in 5 populaties op dag 3 van de cultuur in GM-CSF. Ze werden vervolgens behandeld met een cocktail van PAMPs (LPS, Poly ik: C en CpG DNA) voor 24 h. betekenen fluorescerende intensiteit (MFI's) van (A) de MHC klasse II en (B) CD86 was geanalyseerd onmiddellijk na sorteren (PS) en 24 h met en zonder PAMPs door stroom cytometry. Foutbalken vertegenwoordigen standaarddeviatie van 3-5 repliceren experimenten. (C) IL - 12 p 40/70 en (D) IL-6 in supernatant van 3 samengevoegde monsters werden gemeten door cytokine matrix dot vlek ELISA na 24 h met en zonder PAMPs. RLU; Relatief lichte eenheden; -/ + wijzen op de aanwezigheid van de cel-oppervlakte markering voor de aangewezen bevolking. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Dag 3 Dag 5 Dag 7
Fenotype Celtype Min Max Min Max Min Max
Ly6C-CD115-CD11c - CMP 3 x 106 4 x 106 5 x 105 1 x 106 N/b N/b
Ly6C + CD115- GMP 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 N/b N/b
Ly6C + CD115 + Mono 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 5 x 105 1 x 106
Ly6C-CD115 + MoMac 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106 3 x 106 4 x 106
Ly6C-CD115-CD11c + MoDC N/b N/b 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106

Tabel 1: Verwachte minimale en maximale aantal cellen hersteld na sorteren per 1 x 107 cellen. CMP (gemeenschappelijk myeloïde voorlopercellen); GMP (granulocyt/macrofaag voorlopercellen) Mono (monocyten); MoMac (macrophage monocyt-afgeleide); MoDC (monocyt-afgeleide dendritische cel); N.v.t. (niet beschikbaar); Min (minimumgrootte voor een cel opbrengst uit 1 x 107 cellen); Max (maximale cel opbrengst uit 1 x 107 cellen).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dit protocol vergemakkelijkt isolatie van GM-CSF-driven voorlopercellen en voorloper celtypes in getallen voldoende voor verschillende soorten analyses met inbegrip van biochemische testen, testen van cellulaire functie in vitroof instillation in vivo. Deze methode vertegenwoordigt een belangrijke stap voorwaarts op het gebied van monocyt-afgeleide dendritische cel ontwikkeling, waardoor de betrouwbare isolatie en identificatie van cellen in het begin van dit traject van ontwikkeling, alsook deze gedifferentieerde celtypes meer in het algemeen geïsoleerd in voorafgaande studies.

Eerdere protocollen voor isolatie van de progenitoren en precursoren gegenereerd op basis van het beenmerg in vitro hebben vertrouwd op de CFSE-kleuring te identificeren proliferatieve voorlopercellen cellen 17 of kleuring met CD31 en Ly6C als markers van myeloïde cellen 18 . De CFSE kleuring protocol beschreven door Naik is ontworpen voor gebruik in de generatie van Flt3L gestuurde DC progenitoren en precursoren 17. Toen we deze aanpak in het systeem van de cultuur GM-CSF probeerden, ondervonden we twee belangrijke kwesties. De CFSE was enigszins cytotoxisch zijn voor de ontwikkelingslanden cellen en zo helder (zelfs in opgesplitste cellen) die het compensatie bemoeilijkt. Deze aanpak bleek niet geschikt voor onze doelstellingen van het isoleren van vroege celtypes (progenitorcellen), evenals de cellen in de hele de ontwikkelingstoxiciteit spectrum, van uiterst proliferatieve (CMPs/GGP's) te sterk ontwikkeld (MoDC/MoMac). We hebben ook geprobeerd de sorteer strategie voor GM-CSF-driven cellen beschreven door Leenen de groep die was gebaseerd op CD31 en Ly6C 18. Echter vonden wij dat CD31 problematisch was. Het kwam tot uiting op een zeer laag niveau (waardoor het moeilijk op te lossen van de bevolking voor het sorteren van de schone) door een verwaarloosbaar kleine ondergroep van cellen, en slechts zeer vroeg tijdens de periode van de cultuur. CD31 expressie was in feite niet aantoonbaar verleden dag 2 van de cultuur in GM-CSF 10.

Ly6C, echter, was een zeer nuttige molecule voor het scheiden van cellen in verschillende stadia van ontwikkeling als gevolg van de voorbijgaande patroon van expressie 10. De toevoeging van CD115 konden we nauwer onderscheiden cellen in intermediaire en latere stadia van ontwikkeling dat niet mogelijk is met CD31 was. Wij onderzocht ook andere merkers van progenitoren zoals CD34 en CD117 in de hoop isoleren van grote aantallen van deze vroege cellen 10. Echter, in tegenstelling tot die gerapporteerd in het Flt3L systeem, vonden we dat CD34 en CD117 ook op een zeer klein aantal cellen uitgedrukt werden en vrijwel afwezig waren op dag 3 van cultuur 17. Deze markeringen van de cel van de stam is wellicht echter nuttig in toekomstige studies te onderscheiden subgroepen binnen de CMP of GMP populaties.

Er zijn verschillende mogelijke wijzigingen van het protocol dat kan invloed hebben op het rendement van de gewenste cel populaties. Eerst, de gebruiker kan kiezen om toe te passen een levensvatbaarheid vlek om uit te sluiten van alle dode cellen. Op basis van de opmerkingen, het aantal dode cellen binnen een typische vooruit en kant scatter poort zijn relatief laag in het algemeen, en problemen alleen tijdens de eerste paar dagen van cultuur, samenvallen met afname in bloedlijn positieve lymfocyten. Echter, voor toepassingen in welke cel nummers moeten nauwkeurig zijn, een levensvatbaarheid vlek zorgt voor uitsluiting van dode cellen.

Een tweede mogelijke wijziging is uitputting van lineage-positieve lymfocyten voorafgaand aan cultuur. We hebben geprobeerd deze aanpak om de kleine bevolking van lineage positieve cellen die regelmatig werden waargenomen in de Ly6C-CD115-celpopulatie. De totale opbrengst van de cel was iets lager op de dagen 5 en 6, en de zuiverheid was niet significant hoger (gegevens niet worden weergegeven). De zuiverheid deed dus geen rechtvaardiging voor de lagere opbrengst. Ook als de gebruiker van plan is om te sorteren op dag 5 of na, de frequentie van lymfocyten binnen de cultuur is ook minder dan 1% en dient niet een probleem.

Ten slotte, omdat deze strategie is ontworpen om te isoleren cellen in een grote developmental spectrum de gebruiker moeten afstemmen op de timing van hun soort te verzamelen zo veel van de gewenste bevolking mogelijk. Deze sorteren strategie levert getrouw de celtypes aangegeven ongeacht de dag van cultuur waarin de cellen worden gesorteerd. Bijvoorbeeld cellen met het fenotype Ly6C + CD115-CD11c-zijn trouw aan de GMP fenotype en functie ook of ze gesorteerd en geïsoleerd op dag 3 of 5 van cultuur. De frequentie van deze cellen is echter veel groter op dag 3 5, dus als het doel isolatie van dit celtype is, sorteren op dag 3 zouden worden aanbevolen. Het is ook opmerkelijk dat cellen gesorteerd op dag 3 vooruitgang door middel van de volgende ontwikkelingsstadia met langzamere kinetiek dan als ze zijn gesorteerd op dag 5 of 7 (Figuur 3).

Hoewel deze methode geschikt is voor de duidelijke afbakening en isolatie van 5-6 verschillende populaties langs het ontwikkelings spectrum, zijn er waarschijnlijk veel meer populaties of tijdelijke fasen langs dit traject. Binnen elk van de vijf beschreven populaties kunnen er verschillende subpopulatie op enigszins verschillende stappen van de ontwikkeling. Wij hebben bijvoorbeeld geconstateerd "verschillende" bevolkingsgroepen met tussenliggende niveaus van CD115 en Ly6C die ondergaan enigszins verschillende patronen van ontwikkeling, in termen van hoeveel moMac en moDC zijn gegenereerd (gegevens niet worden weergegeven). Het is ook waarschijnlijk dat de populaties eerder waargenomen in vivo aanwezig zijn in de cultuur en sorteer systeem, maar deze zijn moeilijk te herkennen vanwege hun zeer lage frequenties. Populaties zoals cMOP 19, MDP 20of CENSUS 21 waarschijnlijk aanwezig zijn, maar binnen de grotere populaties worden verborgen. Toekomstige studies zal nodig zijn om de talrijke ontwikkelingsstadia die geïsoleerd in deze sorteren kader met de toevoeging van specifieke markers van differentiatie mogelijk verder te verduidelijken. De waarde van deze sorteren strategie is dat het consequent isolatie van grote aantallen ontwikkelingsachterstand verschillende fasen tijdens DC ontogenie toestaat.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs er geen conflicten optreden bekend te maken.

Acknowledgments

We zijn dankbaar voor de technische bijstand van Alison kerk Bird op de Auburn University School van diergeneeskunde Stroom Cytometry faciliteit, voor financiering uit de NIH EHS R15 R15 AI107773 en naar de cellulaire en moleculaire biologie programma aan de Universiteit van Auburn voor de zomer onderzoekssteun aan PBR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HBSS buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60 mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50 mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10 mL Syringe BD Biosciences 301604
23 G needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Tags

Immunologie en infecties probleem 138 dendritische cel ontwikkeling GM-SCF gemeenschappelijke myeloïde voorlopercellen granulocyt-macrofaag voorlopercellen monocyt monocyt-afgeleide dendritische cel monocyt-afgeleide macrofaag hoge snelheid cel sorteren
Generatie van grote aantallen van myeloïde voorlopercellen en dendritische cel precursoren uit lymfkliertest beenmerg met behulp van een nieuwe cel sorteren van strategie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, P. B., Schwartz, E. H.… More

Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter