Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57365
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Auburn University

Summary

هنا نقدم طريقة لتحديد وعزل عدد كبير من GM-CSF مدفوعة النقوي الخلايا باستخدام فرز الخلايا عالية السرعة. ويمكن تحديد خمس السكان متميزة (المتكفل النقوي المشتركة وفروعه المحببات/بلعم ووحيدات، الضامة المشتقة من الوحيدات والمشتقة من الوحيدات DCs) استناداً إلى تعبير Ly6C و CD115.

Abstract

مؤخرا تم الاعتراف بثقافات المشتقة من الوحيدات الخلايا الجذعية (مودك) التي تم إنشاؤها من نخاع العظام الماوس باستخدام "عامل تحفيز مستعمرة" بلعم المحببات (GM-CSF) لتكون غير متجانسة أكثر مما كانت موضع تقدير. وتتضمن هذه الثقافات بشكل روتيني مودك كذلك الوحيدات المستمدة الضامة (موماك)، وحتى بعض الخلايا الأقل نمواً مثل وحيدات. والهدف من هذا البروتوكول توفير أسلوب متناسق لتحديد الهوية، والفصل بين العديد من أنواع الخلايا الموجودة في هذه الثقافات كما أنها تضع، حتى أن وظائفها المحددة قد يكون مزيدا من التحقيق. الاستراتيجية الفرز المعروضة هنا يفصل الخلايا أولاً إلى السكان أربعة استناداً إلى التعبير عن Ly6C و CD115، اللذين يتم أعرب عابر من الخلايا كما أنها تضع في ثقافة يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية. تشمل هؤلاء السكان أربعة المتكفل النقوي المشتركة أو CMP (Ly6C و CD115)، المتكفل المحببات/بلعم أو GMP (Ly6C +، CD115-)، وحيدات (Ly6C +، CD115 +)، والمشتقة من الوحيدات الضامة أو موماك (Ly6C-، CD115 +). يتم أيضا إضافة CD11c إلى استراتيجية الفرز التمييز بين اثنين من السكان داخل Ly6C-، CD115-السكان: اجتماع الأطراف (CD11c-) ومودك (CD11c +). وأخيراً، اثنين من السكان يمكن تمييز كذلك داخل Ly6C-، CD115 + السكان استناداً إلى مستوى الطبقة MHC التعبير الثاني. موماكس التعبير عن المستويات الدنيا من الطبقة MHC الثاني، بينما سليفة DC المشتقة من الوحيدات (مودب) تعرب عن أعلى MHC الدرجة الثانية. يسمح هذا الأسلوب لعزل عدة السكان تنمويا متميزاً في أرقام موثوقة كافية لمجموعة متنوعة من التحليلات الفنية والإنمائية. نسلط الضوء على أحد قراءات وظيفية مثل، التفاضلية ردود هذه أنواع الخلايا على التحفيز مع "أنماط الجزيئية باثوجيناسوسياتيد" (بامبس).

Introduction

استزراع خلايا نخاع العظام مورين مع سيتوكين "عامل تحفيز مستعمرة" بلعم المحببات (GM-CSF) يستخدم على نطاق واسع كوسيلة لتوليد الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات (مودك؛ ويعرف أيضا باسم DC التحريضية) في، إعداد كبيرة 1 2،3،،من45. هذه الخلايا كانت مفيدة للغاية في مجموعة متنوعة من الدراسات المتعلقة بالخلايا الجذعية (DC) الدالة 6،،من78. بشكل عام، هذه الخلايا نخاع العظام مورين تربى لمدة 6-8 أيام وتستخدم فيما بعد لدراسة الخلية الجذعية الدالة 5. هذه الثقافات منذ فترة طويلة وقد نظر معظمها متجانسة، تتكون من أغلبية مودك المتباينة. في الآونة الأخيرة، أصبح من الواضح أن في نهاية هذه الفترة 6-8 يوم الثقافة، هناك في الواقع العديد من مودك، فضلا عن مجموعة فرعية كبيرة من المتباينة الضامة المشتقة من الوحيدات (موماكس) 9،،من1011. وقد مدد الدراسات الخاصة بنا هذه النتائج تبين أن مجموعات فرعية أخرى من خلايا أقل نمواً، مثل مودك السلائف (مودب) ووحيدات، تظل في الثقافات في الترددات المنخفضة حتى بعد 7 أيام 10. وهكذا، يمكن أن تعكس الدراسات المتعلقة بالخلايا الجذعية (DC) دالة باستخدام الخلايا التي تم إنشاؤها بواسطة هذا النظام الردود الواردة من مجموعة أوسع من أنواع الخلايا مما سبق تقدير.

لقد تعلمنا الكثير من دراسة مودك GM-CSF-ولدت المتصلة بوظيفة هذه الخلايا في المراحل النهائية للمفاضلة 12،،من1314. بيد أننا نفهم إلى حد كبير أقل حول المسار التنموي لهذه الخلايا 2،،من1516 ومن كيف ومتى هم يعرضون محددة المهام مثل: القدرة على الاستجابة "مسببات الأمراض المرتبطة الجزيئية" أنماط (بامبس)، البلعمه، مستضد تجهيز وعرض 13، والأنشطة المضادة للبكتيريا. بروتوكول لعزل عدد كبير من فروعه DC يحركها Flt3L التقليدية والسلائف قد أبلغ عنها 17. عزل هؤلاء السكان متميزة تحقق استخدام إستر سوكسينيميديل "كاربوكسيفلوريسسين" (CFSE)-الملون خلايا نخاع العظام (لتعقب تقسيم الخلايا) والثقافة في Flt3L لمدة 3 أيام. الخلايا ثم استنفاد الخلايا إيجابية لينج وفرزها إلى السلف والسلائف من السكان استناداً إلى تعبير CD11c 17. وكان نهج آخر لينين للفريق لتحديد المتكفل المبكر من العاصمة في ثقافة يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية لفرز الخلايا استناداً إلى CD31 و Ly6C 18. وكان الهدف الأولى لإنشاء أسلوب مماثل للحصول على فروعها والسلائف من مودك يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية. بسبب أنواع الخلايا المحددة التي تم إنشاؤها بواسطة GM-CSF، نحن تكييف النهج وفرز استراتيجية تستند إلى التعبير عن الجزيئات التي تم الإعراب عنها في مراحل مبكرة ولاحق للتنمية. ونحن في نهاية المطاف قرر أن Ly6C، CD115 (مستقبلات السائل الدماغي النخاعي-1)، وكانوا CD11c على علامات أفضل للتمييز بين هذه الخلية أنواع 10.

وهنا نقدم طريقة لعزل الخلايا على عدة مراحل متميزة للتنمية على طول الطريق من التمايز يقودها جنرال موتورز-CSF: المشترك النقوي السلف (CMP)، بلعم المحببات السلف (GMP)، الوحيدات، المشتقة من الوحيدات بلعم (موماك) والمشتقة من الوحيدات DC (مودك). السكان موماك يمكن كذلك عزلهم يستند إلى على مستوى الطبقة MHC التعبير الثاني، يكشف عن مودك سلائف سكان (مودب) 10. فنحن نستخدم خلية تنشيط الفلورية عالية السرعة الفرز استراتيجية (نظام مراقبة الأصول الميدانية) لعزل هؤلاء السكان 5 استناداً إلى التعبير عن Ly6C و CD115 و CD11c. ثم نظهر في دراسة هذه الخلايا بالوظيفية فحوصات الكشف عن استجاباتها لتحفيز بمب.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

أقر جميع أعمال الحيوان برعاية الحيوان المؤسسية جامعة أوبورن واستخدام اللجنة وفقا للتوصيات الواردة في الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية "المعاهد الوطنية للصحة".

1-التحضير لجمع نخاع العظام

  1. تحضير الوسائط كاملة 250 مل بإضافة حل للمتوسطة روزويل بارك التذكاري المعهد (ربمي) 1640 تستكمل مع مصل العجل الجنين 10% والجلوتامين 2 مم و 50 ميكرومتر 2-mercaptoethanol إلى الجزء العلوي من 0.22 ميكرومتر تصفية فراغ قارورة وحدة، وتطبيق فراغ.
    ملاحظة: يمكن تخزين متوسطة كاملة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهرين.
  2. تحضير محلول الإيثانول 70% بخلط 350 مل إيثانول 100% مع 150 مل العقيمة ح2س في قارورة 500 مل.
  3. مجموعة من أجهزة الطرد المركزي إلى 4 درجات مئوية.
  4. تعقيم الملقط ومشرط ومقص في الإيثانول 70%.
  5. استخدام ماصة مصلية، إضافة 5 مل من وسائل الإعلام كاملة إلى ثلاثة أطباق بيتري 60 ملم.
  6. استخدام ماصة مصلية، إضافة 30 مل وسائط كاملة إلى أنبوب مخروطي 50 مل.

2-مجموعة من خلايا نخاع العظام مورين

  1. Euthanize ماوس C57BL/6 بالخدر2 CO وفقا للقواعد المقررة في عام 2013 الرابطة الطبية البيطرية الأميركية (وبرايتون) مبادئ توجيهية بشأن القتل الرحيم.
  2. إزالة وقطاع الخلفيتين.
    1. تشبع الخلفيتين والجذع مع الإيثانول 75%، وإجراء تخفيضات الضحلة عن طريق الجلد حول الورك مع مقص منحنى الأنسجة. استخدام الملقط، إيمانا راسخا سحب الجلد من الورك إلى أسفل نحو الكاحل، يكشف عن العضلات. استخدام مقص لإزالة رفرف الجلد.
    2. إزالة الساق كله هند بالقطع عن طريق العظام فقط فوق عظم الفخذ/الورك.
      ملاحظة: بالإضافة إلى تعقيم المنطقة، سوف المعونة في تقديم تخفيضات نظيفة والحيلولة دون تلوث العينات الشعر الإيثانول.
    3. إذا الساقين ستنقل إلى موقع جديد لحصاد نخاع العظام، تغرق في الساقين في وسائل الإعلام كاملة.
  3. تعمل في مجال السلامة الأحيائية عقيمة مجلس الوزراء، نقل الساقين إلى واحدة من أطباق بيتري المجهز سابقا.
  4. استخدام مقص لقص فقط أدناه الكاحل، وعناية إزالة جزء كبير من النسيج الضام العضلات ومرنة قدر الإمكان. نقل العظام تنظيفها إلى طبق بتري استعداد الثانية.
    ملاحظة: على الرغم من أنه ليس من الضروري إزالة جميع العضلات، الكثير من الأنسجة المتبقية يمكن أن تجعل من الصعب طرد نخاع العظام.
  5. فصل في عظم الفخذ والركبة والساق.
    1. استخدام الملقط، عقد فريق الخبراء في الركبة وتحديد موقع النخاع.
      ملاحظة: يجب أن تكون مرئية كخط أحمر خافت داخل تجويف العظام في الجزء العلوي من عظم الفخذ، وفي نهاية الساق نخاع العظام.
      1. باستخدام مقص، جعل التخفيضات الثلاثة كما يلي.
        1. قص الساق فقط أعلاه حيث يظهر النخاع لإنهاء.
        2. قص أسفل الركبة.
        3. قص فقط فوق الركبة.
        4. إذا كان يزال متصلاً الورك لعظم الفخذ، قص أسفل الورك.
      2. إعادة الأجزاء الثلاثة إلى طبق بتري وكرر هذه العملية على الساق الأخرى.
  6. مسح نخاع العظم من عظم الفخذ والساق.
    1. تعبئة حقنه 10 مل مع وسائل الإعلام كاملة من أنبوب 50 مل المخروطية، وكاب بإبرة ز 23.
    2. عقد العظام مع الملقط أعلاه طبق بيتري استعداد الثالث، أدخل الإبرة في القناة العظام ودفع وسائل الإعلام من خلال طرد الخلايا (التي قد تخرج سليمة "توصيل" أو كمجموعات عدة). كرر حتى يمكن رؤية لا المزيد من الألوان من خلال العظام. إعادة ملء المحاقن مع وسائل الإعلام عند الاقتضاء.
  7. سحق في epiphyses.
    1. بينما لا يزال في طبق بتري الثاني، عقد الركبة بشدة مع الملقط، واهرسيها الركبتين مع غيض المحاقن. أن يستمر epiphyses لم تعد حمراء.
  8. استخدام المحاقن، نقل الخلايا من طبق بتري الثاني والثالث إلى أنبوب 50 مل. تفكك حتى كتل بلطف بيبيتينج صعودا وهبوطاً. حاول عدم توليد فقاعات. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  9. خلايا الدم الحمراء
    1. إزالة المادة طافية مع ماصة المصلية، وإزاحة بيليه بالتحريك، وخلايا الدم الحمراء التي تفرخ في 1 مل من "المخزن المؤقت لتحلل" ACK (الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم) لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. استخدام ماصة مصلية إضافة 40 مل من المخزن المؤقت لحبس (هانكس متوازن الملح الحل).
  10. استخدام ماصة مصلية، تصفية الخلايا على الرغم من مصفاة خلية 70 ميكرومتر في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل جديد. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  11. استخدام ماصة مصلية، إزالة خلايا طافية ويغسل مع 40 مل من وسائل الإعلام كاملة. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    ملاحظة: في هذه المرحلة، يمكن إزالة النسب لمفاوية إيجابية من نظام مراقبة الأصول الميدانية أو تنقية العمود المغناطيسية. ومع ذلك، لا يتم الاحتفاظ لمفاوية طويلة الأجل في الثقافة. على الرغم من أن عددا كبيرا من الخلايا إيجابية النسب موجودة في Ly6C-CD115-السكان في نخاع العظام السابقين فيفو، كلها تقريبا لا توجد بها يوم 5 (الشكل 2).
  12. استخدام ماصة مصلية، إزالة المادة طافية، والثقافة خلايا نخاع العظام في وسائل الإعلام كاملة مع 10 نانوغرام/مل من الماوس المؤتلف GM-CSF في كثافة 1 × 106 خلايا/مل.
    ملاحظة: عادة، 4 × 107 مجموع الخلايا يمكن حصادها بعد تحلل خلايا الدم الحمراء. ومع ذلك، نتوقع أقل من 2 × 107 للمبتدئين، وتصل إلى 5 × 107 خلايا حصادات ذوي الخبرة.
  13. استخدام ماصة مصلية، نقل الخلايا إلى لوحات زراعة الأنسجة، واحتضان في 37 درجة مئوية في شركة 5%2. في حالة استخدام لوحة 24-حسنا، البذور كل جيدا مع 2 مل تعليق خلية.
  14. كل 48 ساعة، استخدم ماصة مصلية إزالة نصف من وسائط الإعلام واستبدالها مع وسائل الإعلام كاملة جديدة و GM-CSF.
    ملاحظة: يمكن الاحتفاظ الثقافات إلى 9 أيام. ومع ذلك، تكوين التغييرات على مر الزمن. انظر القسم 3 للحصول على مزيد من المعلومات.

3-اختيار اليوم للفرز

  1. التراكيب السكانية خلية تغير مع مرور الزمن، وحدد يوم الذي غلة أعلى عدد من الخلايا المطلوب.
  2. انظر الجدول 1 للفرز وظيفة العائد المتوقع من الخلية لكل السكان بعد أيام 3 و 5 و 7 من الثقافة في GM-CSF الواحدة 1 × 107 الخلايا.

4-صبغة استراتيجية

  1. استخدام مختبرين صغيرة من الخلايا لتحضير عينات مراقبة. إدراج عنصر تحكم أونستينيد، عينات مراقبة التعويض ملطخة بجسم واحد فقط الفلورسنت كل منهما، والأسفار-ناقص-واحد يتحكم في أي أجسام جميع يتم إضافة استثناء واحد، إلى عنصر تحكم للأسفار غير محددة في هذه القناة. في حالة استخدام العلامات غير المباشرة، وتشمل الابتدائي الثانوي وحدها، وحدها، والابتدائية والثانوية.
    ملاحظة: فيكوريثرين (PE) والأجسام المضادة اللوفيكوسيانين (APC) معلم توفر فصل متميزة مع الحد الأدنى من التسييل عبر عند استخدامها معا. لكن إذا كانت خيارات fluorochrome محدودة، CD115 هو أعرب عن عند مستوى منخفض نسبيا، بينما يتم التعبير عن Ly6C على مستويات عالية جداً. ولذلك، فلوروتشروميس أكثر إشراقا من المستصوب لمكافحة CD115، ويتم اختيار فلوروتشروميس Ly6C المضادة لمنع التسييل على.
  2. إعداد 100 مل من "المخزن المؤقت" المياه والصرف الصحي نظام مراقبة الأصول الميدانية (FWB) عن طريق خلط مل 97 من الفوسفات مخزنة المالحة برود دولبيكو (دببس) مع 3 مل مصل العجل الجنين في أنبوب 50 مل مخروطية، ووضع في حمام الثلج.
  3. استخدام ماصة بلطف، ولكن دقة، "الماصة؛" خلايا صعودا وهبوطاً لإزاحة أي خلايا ملتصقة فضفاضة.
  4. استخدام ماصة مصلية، نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    1. إذا تجاوز حجم الخلية 50 مل، نقل الخلايا إلى العدد اللازم من أنابيب والجمع في الخطوة المصبوغة.
  5. بلطف من أجل إيقاف المادة طافية، وتغسل الخلايا الأعلاف بإضافة 30 مل FWB مع ماصة مصلية. الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتكرار الغسيل.
    ملاحظة: إذا كان من المتوقع موت الخلايا عالية، يمكن غسلها الخلايا مع FWB مع منخفضة تصل إلى 0.5% مصل العجل الجنين (FCS). سيمنع هذا التثاقل الخلية.
  6. تعليق ووصمة عار الخلايا كل جسم لإرشادات الشركة المصنعة.
    1. تعليق 5 × 107 خلايا في 1 مل FWB وإضافة 2 ميكروغرام في كل Ly6C المضادة ومكافحة--CD115 المسمى مع فلوروفوريس (من اختيار للباحث). إضافة لزيادة تمييز CMP من مودك (كلاهما Ly6C-و CD115-)، 2 ميكروغرام للأجسام المضادة-CD11c (CMP هي CD11c–؛ هي مودك CD11c+). احتضان لمدة 30 دقيقة على الجليد.
      ملاحظة: الرقم 3 تم إنشاؤها باستخدام Ly6C-PE و CD115--آسيا والمحيط الهادئ.
  7. استخدام ماصة مصلية، إضافة 10 مل FWB، وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  8. بلطف من أجل إيقاف المادة طافية، وتغسل الخلايا الأعلاف بإضافة 30 مل FWB مع ماصة مصلية. الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، وتكرار الغسيل.
  9. قبل تعليق الخلايا، نفض الغبار أنبوب دقيق لإزاحة بيليه. استخدام ماصة مصلية تعليق الخلايا في خلية 1 × 107 /مل من FWB، وتصفيتها من خلال تصفية خلية 35-ميكرومتر. استخدام ماصة مصلية نقل الخلايا التي تمت تصفيتها في الأنبوب البولي بروبلين، ووضع على الجليد حتى جاهزة لفرز.
    ملاحظة: إذا كان بولي بروبلين غير متوفر، يمكن استخدام أنابيب البوليسترين المغلفة البروتين (اللبن المجفف الخالي أو السفح) خفض ملزم.

5-تعيين غيتس استناداً إلى عينات التحكم

ملاحظة: لمنع تعطيل الخلية بسبب ضغط تيار تدفق عالية السرعة، استخدم فوهة ميكرومتر 100 – 130 لفرز الخلايا.

  1. تشغيل عنصر التحكم أونستينيد (راجع الخطوة 4، 1) من خلال فارز الخلية، وتطبيق بوابة لاستبعاد الحطام الصغيرة (مبعثر الأمام منخفضة؛ منتدى التعاون الأمني) والغاية الحبيبية (مبعثر الجانب عالية؛ SSC) الجسيمات.
    1. لتحليل تنطبق فقط مراحل لاحقة (وحيدات، موماك/مودب ومودك)، النابضة لتضمين الخلايا أكبر (FSC عالية) فقط.
    2. إذا المستخدمة الجدوى البقع، استخدم هذه لاستبعاد أحداث الملون، وغير قابل للحياة (على سبيل مثال يتضح في الشكل 1).
  2. تشغيل نماذج تحكم فلوري واحد عن طريق فارز الخلية، وضبط التعويض حسب الحاجة.
  3. تشغيل عينة من عينة المسمى متعدد. مراقبة السكان متميزة أربعة: Ly6C + CD115-(غمبس)، Ly6C + CD115 + (وحيدات)، Ly6C-CD115 + (موماكس/مودب)، و Ly6C-CD115-(CMPs/مودكس). تطبيق بوابة لعزل كل من السكان الرئيسية الأربعة.
    ملاحظة: مشاركة CMPs ومودك Ly6C-CD115-النمط الظاهري. بيد أنها يمكن أن تكون متباينة استناداً إلى التعبير CD11c: CMP تفتقر إلى CD11c، في حين أعرب مودكس CD11c.

6-مجموعة من السكان المعزولين

  1. إعداد أنابيب جمع بإضافة السفح ما يكفي لتحقيق 20 في المائة على الأقل التركيز النهائي عندما الكامل. على سبيل المثال، في حالة استخدام أنابيب 5 مل، إضافة 1 مل السفح قبل الفرز، وإزالة الأنبوب عندما يصل إلى حجم إجمالي 5 مل.
  2. لمنع امتصاص الغشاء دوران، والأجسام المضادة، تبقى جميع العينات (مختلطة وفرز) في 4 درجات مئوية خلال عملية الفرز.
    1. إذا لم يكن هذا ممكناً، الاحتفاظ بالانبوب الذي يحتوي على الخلايا لفرز على الجليد بقدر الإمكان ونقل مختبرين إلى فارز حسب الحاجة.
    2. بالإضافة إلى ذلك، نقل فرز عينات الجليد كل 20-30 دقيقة.
  3. بعد أن تم جمع العدد المطلوب من الخلايا، استخدم ماصة مصلية نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي الشكل جديد. أجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
    1. تأكيد النقاء مع نوعا ما بعد التحليل في مختبرين الصغيرة من كل السكان التي تم جمعها.
  4. إزالة المادة طافية، وتعليق في 10 مل FWB وأجهزة الطرد المركزي في 250 x ز عند 4 درجة مئوية للحد الأدنى 10 تكرار لمجموعة من يغسل اثنين.
    ملاحظة: أنه يمكن أن تكون صعبة لإزالة جميع المادة طافية دون إزاحة بيليه. إرفاق تلميح ماصة لخط فراغ يمكن أن تساعد في إزالة. إذا لم يكن هذا متوفراً، اقترح أن تجمع المادة طافية في أنبوب طازجة في حالة الانفصال بيليه.
  5. إزالة المادة طافية بعد الغسيل الثاني.
  6. إذا كان التصميم التجريبي الخاص بالمستخدم يفرض إعادة استزراع الخلايا، اتبع الخطوات 2.12 – 2.14. وبخلاف ذلك، إذا كان سيتم استخدام الخلايا للتحليل الفوري، إعداد الخلايا وفقا للبروتوكول المطلوب.
    ملاحظة: يتم تضمين مثال نموذجي التحليل الوظيفي في الشكل 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في محاولة للحفاظ على العديد من القنوات المتاحة للتحليل كالخلايا الممكنة، وقابلة للتطبيق بشكل روتيني اختيرت استناداً إلى مبعثر أمامية وجانبية، باستثناء أحداث صغيرة جداً ومحبب جداً (بوابة نموذجية يتم تطبيق على كافة المؤامرات دوت في الشكل 1A). لتحديد ما إذا كانت هذه الاستراتيجية النابضة موثوق استبعاد الخلايا الميتة، ونحن ملطخة 7 الأمينية والاكيتنوميسين د (7-عاد) (الشكل 1B). 7AAD بقع الحمض النووي في خلايا ميتة ويموتون بسبب نفاذية الغشاء، واستبعدت من خلايا قابلة للحياة. بقاء للآلية العالمية-CSF خلايا نخاع العظام مثقف وقد تم تحليل فورا بعد الحصاد (PH) وخلية الدكتوراه 1 و 3 و 5 حلل فورا الأس الهيدروجيني قد 10% تقريبا من الخلايا إيجابية 7-عاد عند بوابة منتدى التعاون الأمني/SSC نموذجي تم تطبيقها على الخلايا طازجة معزولة من العظم نخاع (الشكل 1، ما بعد الحصاد). كما حضر نسبة مماثلة من الخلايا الميتة في يوم 1 (~ 12 في المائة) ويوم الثقافة (الشكل 1، 1 يوم PH و 3 أيام PH) 3 (~ 11 ٪). يوم 5، انخفض عدد الخلايا الميتة داخل البوابة إلى ~ 5% (الشكل 1، 5 أيام الأس الهيدروجيني). وبالتالي، استخدام هذه بوابة بقاء عموما مناسبة للفرز في يوم 5 وبعد. ولذلك، إذا كان المستخدمين محدودة على المعلمات المتوفرة، منتدى التعاون الأمني/SSC النابضة عموما مناسبة. ومع ذلك، لفحوصات أكثر حساسية (لا سيما إذا أنها تعتمد على أرقام الخلية الدقيقة)، تتضمن صلاحية وصمة عار (اقتراح).

ويوصي العديد من البروتوكولات لإكثار الخلايا الجذعية استنفاد الخلايا إيجابية النسب، وخاصة الخلايا الليمفاوية، من نخاع العظام قبل الثقافة 11،17. ويعتقد هذا الإجراء زيادة نقاء الخلايا استردادها عند المفاضلة GM-CSF-بوساطة. عادة، خلايا معربا عن علامات لخلايا تي (CD3)، ب الخلايا (CD45R أو CD19)، وقد نفد ناغورني كاراباخ الخلايا (NK1.1) بالتحديد الإيجابي باستخدام الخرز المغناطيسي أو الخلية فرز 11،17،18. ومع ذلك، استناداً إلى نظام تثقيف، لمفاوية كانت نادراً ما استرداده أو الكشف عنها في هذه الاختبارات. وهكذا، سعينا إلى تقييم طول العمر للخلايا الليمفاوية في Ly6C-CD115-السكان بين خلايا السائل الدماغي النخاعي يحركها الآلية العالمية (الشكل 2A). GM-CSF استزراع نخاع العظام الخلايا (التي لم تكن النسب المنضب) كانت ملطخة بالأجسام المضادة إلى CD3 و CD45R و NK1.1 (في نفس فلوروفوري) ويقاس يوميا بالتدفق الخلوي (الشكل 2). داخل Ly6C-CD115-السكان، استمرت الخلايا إيجابية CD3/CD45R بقوة من خلال أيام 0 – 3 (الشكل 2). في يوم 4، بقي فقط بضعة CD3/CD45R الخلايا إيجابية، وقبل يوم 5 و 6، كانت هناك لا CD3/CD45R الإعراب عن الخلايا الحالية. وهكذا، خلال 4 أيام للثقافة في GM-CSF، الخلايا إيجابية النسب تغيبوا أساسا، واكتشفت على الإطلاق لا في أيام 5 و 6 من الثقافة.

تكوين ثقافة خلية يحركها من السائل الدماغي النخاعي جنرال موتورز التغيرات اليومية في هذا النظام مع تطور الخلايا والتفريق (الجدول 1؛ الشكل 3). في وقت مبكر النقاط الزمنية، الخلايا الأكثر وفرة المتكفل والسلائف، وفي وقت لاحق مرات غالبية الخلايا هي أكثر تمايزاً 10. لتحديد كيفية فرز في أيام مختلفة من الثقافة قد تؤثر على المسار التنموي اللاحقة أو حركية، أجريت أنواع أيام 3 و 5 و 7 درجة الحموضة (الشكل 3A). تنمية السكان موماك (Ly6C-CD115 +) كان ثم تعقبها خلال 2 – 3 أيام إضافية في الثقافة (الشكل 3B-3D).

عند فرز 3 أيام الأس الهيدروجيني، 40 في المائة فقط من Ly6C-CD115 + الخلايا قد انخفض التعبير CD115 خلال 24 ساعة بعد انتهاء الفرز (PS) (الشكل 3). ح 48 PS، الكسر التي كانت أسفل-تنظم CD115 كان 66 في المائة، ومن ح 72، كان 70 في المائة الخلايا هذا النمط الظاهري. واستمر هذا التشكيل المظهرية (Ly6C ~ 70-72%-CD115-) حتى بعد أيام المزيد من الثقافة (البيانات لا تظهر). عند فرز 5 أيام الأس الهيدروجيني، كانت ~ 75% الخلايا Ly6C بعد CD115 سرعة أسفل ينظم داخل PS ح 24، و ~ 80% كانت-CD115-CD115-بعد 48 ساعة فقط. واستمر هذا التوزيع بعد 72 ساعة (الشكل 3). وأخيراً، عند فرز 7 أيام درجة الحموضة، أسفل-تنظيم CD115 كان أيضا السريع جداً. ضمن ح 24 PS، ~ 75% خلايا ينظم أسفل التعبير CD115، واستمر هذا الاتجاه بعد 48 ساعة (3D الشكل). من المثير للاهتمام، عند فرز في اليوم السابع، كان المستوى العام للتعبير CD115 أقل من شأن الخلايا ضمن السكان CD115 +.

وهكذا، تشير هذه النتائج إلى أن حركية التنمية أبطأ إلى حد ما عند الفرز في يوم مبكر، مثل يوم 3 فرز الخلايا مقارنة بالتطور السريع أكثر والتمايز ولاحظ بعد الفرز في يوم 5 أو 7. وبناء على هذه النتائج، ينبغي أن مستخدم تسعى إلى إعداد أكبر من مودك المحتمل أن الفرز في يوم 5 أو 7.

رد نضوج DC هو راسخة 6،7،،من1214. عند التعامل مع مجموعة متنوعة من أنماط الجزيئية المرتبطة بالعوامل الممرضة (بامبس)، العاصمة غير ناضجة حتى-تنظيم التعبير عن MHC وجزيئات كوستيمولاتوري السيتوكينات الموالية التحريضية، تعزيز بهم خلية T-تفعيل قدرة 6. بيد أنها أقل واضحة عند الخلايا النامية اكتساب القدرة على الاستجابة للتحفيز بمب والميزة التي نضج العاصمة أنها قد تظهر. لتحديد التي تم فرزها السكان أن الاستجابة للمحفزات النضج، يعامل كل السكان بعد وقت قصير من الفرز مع مزيج بامبس بما في ذلك بولي أنا: ج، ليبوبوليساكتشاريديس (LPS)، و "الحمض النووي البد" لتحريك عدد القتلى مثل مستقبلات (TLR) 3 (TLR3)، TLR4، و TLR9، على التوالي. الخلايا تم التعامل مع (أو دون علاج) ح 24، والتعبير عن CD86 ومهسيي تم قياسه بواسطة التدفق الخلوي (الشكل 4A-4B). وعلاوة على ذلك، إنتاج إيل-12 ف 40/70، وايل-6 كان يقاس في supernatants صفيف سيتوكين أليسا (الشكل 4-4D).

CMPs وغمبس أعرب عن مستويات منخفضة جداً من MHC الطبقة الثانية و CD86 في دولة أونستيمولاتيد، والتعبير هذه الأنماط لم تتغير كثيرا عند التعرض إلى مزيج بامبس (الشكل 4A و 4B). وبالمثل، كان التعبير عن MHC الدرجة الثانية قبل وحيدات أيضا منخفضة وتغيرت قليلاً عند التعرض بمب (الشكل 4 أ). بيد أن التعبير عن CD86 كان معتدلاً في وحيدات ح 24 بعد الفرز وأنها زادت عقب زيادة تحفيز ح 24. التعبير القاعدية أعلى من MHC من الدرجة الثانية ولوحظ CD86 في موماكس ومودكس، وعرضت كل السكان تحريض قوي هذه الجزيئات عند التحفيز بمب. من حيث التعبير الثاني الطبقة MHC بعد التحفيز، لم يكن هناك إحصائية فرق بين CMPs، غمبس ووحيدات، بينما موماكس ومودكس تشكيل مجموعة متميزة. حتى الآن، من حيث التعبير CD86، كانت الخلايا CMPs وغمبس إحصائية مختلفة من موماكس ومودكس. ومع ذلك، لم تكن وحيدات مختلفة من موماكس أو مودكس.

لقد أردنا التالية لتقييم القدرة النسبية لكل من السكان خمسة لإنتاج السيتوكينات في الاستجابة للتحفيز TLR. وهكذا، أجرينا مقايسة سيتوكين على السكان تم فرزها بعد الثقافة في وجود أو عدم وجود مؤثر TLR الكوكتيل المستخدم أعلاه. تم استزراع الخلايا مع المحفزات ح 24، ثم جمعت supernatants. لاحظنا القليل جداً إيل-12 ف 40/70 أو إنتاج إيل-6 قبل CMPs عند التحفيز TLR (الشكل 4-4D). سكان الثانية، غمبس، كان غير قادر على إنتاج إيل-12 ف 40/70 (الشكل 4)، ولكن هذه الخلايا تنتج كمية منخفضة من إيل-6 عند التحفيز التي بامبس (الشكل 4). ولوحظت أعلى مستويات إنتاج سيتوكين في السكان الثلاثة الأخيرة. كان أنماط مشابهة جداً ومقادير إنتاج سيتوكين وحيدات وموماكس. زيادة كبيرة في إيل-12 ف 40/70 ومتواضعة زيادة إنتاج إيل-6 حتى التحفيز (الشكل 4-4D). من المثير للاهتمام، حضور "مودكس بامبس" لم يؤد إلى زيادة إفراز إيل-12 ف 40/70؛ ومع ذلك، هذه الفئة من السكان زيادة كبيرة في إنتاج إيل-6 (الشكل 4-4D). تشير هذه النتائج إلى أن السكان تم فرزها في الحفاظ على وظائفهم المناعية بعد عزلة.

Figure 1
رقم 1: الخلايا قادرة على البقاء ضمن الأمام مقابل بوابة "مبعثر الجانب". كان مثقف نخاع العظام الماوس في GM-CSF، وتم قياس صلاحية استخدام 7-عاد (7-الأمينية والاكيتنوميسين د) تلطيخ ما بعد الحصاد (PH) و 1 و 3 و 5 أيام ما بعد الحصاد. واختيرت خلايا قابلة للحياة (A) عن طريق تطبيق بوابة (الصالحة) الذي أغفل الأحداث الصغيرة والحبيبية شديدة استناداً إلى منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب. (ب) رسوم بيانية لتلطيخ 7-عاد المتولدة من أحداث داخل بوابة قابلة للحياة (منتدى التعاون الأمني/SSC). تشير الأحداث إيجابية بالنسبة 7-عاد إلى الخلايا تمر بالمبرمج. تشير الأسهم إلى خلية قابلة للحياة النابضة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: لمفاوية ضمن السكان--Ly6C-CD115- كان مثقف نخاع العظام الماوس في GM-CSF وحللت علامات اللمفاويات (CD3 و CD145R و NK1.1) يوميا بالتدفق الخلوي. الخلية (أ) كانت ملطخة Ly6C-PE و CD115--آسيا والمحيط الهادئ لتحديد Ly6C-CD115-الخلايا. تم تطبيق بوابة رباعي، استناداً إلى عناصر التحكم في لون واحد. ارسم دوت بسيودوكولور المتولدة من اليوم وقد تم تحليل التعبير 0 (ب) CD3 و CD45R و NK1.1 Ly6C-CD115-الخلايا في يوم الحصاد (يوم 0) حتى يوم 6. عدد خلايا تم تطبيع للوضع باستخدام برنامج تحليل تدفق الخلوي. يشير السهم إلى Ly6C-CD115-النابضة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: حركية التنمية من Ly6C-CD115 + الخلايا بعد الفرز في أيام مختلفة- (أ) الماوس تحصد نخاع العظام ومثقف في GM-CSF. وكانت مختبرين 1 × 107 خلايا المقطوع (ب) 3، (ج) 5، أو (د) 7 أيام ما بعد الحصاد (PH). في الأيام المشار إليها درجة الحموضة، Ly6C-CD115 + خلايا تم فرزها من الثقافة المختلطة (ما قبل الفرز) وتحليلها فورا بعد انتهاء الفرز (PS). فرز الخلايا المستزرعة إعادة في GM-CSF، وتم تحليل التغيرات في التعبير Ly6C/CD115 يوميا بالتدفق الخلوي. مربع والسهم يشير إلى بوابة الفرز. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: النضج وسيتوكين التعبير بعد التحفيز TLR. تم فرز الخلايا إلى السكان 5 في اليوم 3 من الثقافة في GM-CSF. أنهم يعاملون معاملة ثم مع مزيج بامبس (لبس، بولي أنا: ج، والحمض النووي البد) ل 24 h. يعني شدة الفلورسنت (MFI) MHC (A) الدرجة الثانية وكان تحليل CD86 (ب) مباشرة بعد انتهاء الفرز (PS) و 24 ساعة مع أو بدون بامبس بالتدفق الخلوي. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من 3-5 تكرار التجارب. (ج) إيل-12 ف 40/70، وايل-6 (د) في supernatants من العينات المجمعة 3 كانت تقاس سيتوكين الصفيف دوت وصمة عار أليسا بعد 24 ساعة مع أو بدون بامبس. رلو؛ وحدات خفيفة نسبيا؛ --/+ تشير إلى وجود علامة الخلية السطحية للسكان المعينة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

3 يوم يوم 5 يوم 7
النمط الظاهري نوع الخلية دقيقة ماكس دقيقة ماكس دقيقة ماكس
Ly6C-CD115-CD11c- اجتماع الأطراف 3 × 106 4 × 106 5 × 105 1 × 106 N/a N/a
Ly6C + CD115- برنامج الرصد العالمي 2 × 106 3 × 106 2 × 106 3 × 106 N/a N/a
Ly6C + CD115 + مونو 2 × 106 3 × 106 2 × 106 3 × 106 5 × 105 1 × 106
Ly6C-CD115 + موماك 5 × 105 1 × 106 3 × 106 4 × 106 3 × 106 4 × 106
Ly6C-CD115-CD11c + مودك N/a N/a 5 × 105 1 × 106 3 × 106 4 × 106

الجدول 1: يتوقع استردادها الحد الأدنى والحد الأقصى من عدد من الخلايا بعد فرز كل الخلايا7 1 × 10- كيوتو (السلف النقوي المشتركة)؛ برنامج الرصد العالمي (السلف المحببات/بلعم) مونو (وحيدات)؛ موماك (المشتقة من الوحيدات بلعم)؛ مودك (الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات)؛ N/a (غير متوفر)؛ دقيقة (العائد الأدنى الخلية خارج الخلايا7 1 × 10)؛ ماكس (الخلية أقصى غلة خارج الخلايا7 1 × 10).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ويسهل هذا البروتوكول عزلة يحركها من السائل الدماغي النخاعي جنرال موتورز السلف والسلائف أنواع الخلايا بإعداد كافية لعدة أنواع من التحليلات بما في ذلك فحوصات الكيمياء الحيوية، فحوصات وظيفة الخلوية في المختبر، أو تقطير في فيفو. هذا الأسلوب يمثل تقدما كبيرا في مجال تطوير الخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات، تمكين عزل موثوق بها وتحديد الخلايا في بداية هذا المسار للتنمية، فضلا عن تلك الأنواع من خلية متمايزة أكثر شيوعاً معزولة في دراسات سابقة.

وقد اعتمدت البروتوكولات السابقة لعزل المتكفل والسلائف التي تم إنشاؤها من نخاع العظام في المختبر على تلطيخ كفسي لتحديد الخلايا التكاثري السلف 17 أو تلطيخ مع CD31 و Ly6C كعلامات لخلايا النقوي 18 . كفسي تلطيخ البروتوكول المذكورة نايك صمم للاستخدام في توليد يحركها Flt3L DC المتكفل والسلائف 17. عندما حاولنا هذا النهج في نظام الثقافة GM-CSF، واجهنا مسألتين رئيسيتين. كفسي السامة للخلايا إلى حد ما إلى الخلايا النامية وكان مشرقة جداً (حتى في الخلايا المقسمة) التي جعلت من الصعب التعويض. أثبت هذا النهج أنه تكون غير ملائمة لتحقيق أهدافنا المتمثلة في عزل أنواع الخلايا المبكر (فروعه)، فضلا عن الخلايا عبر الطيف الإنمائية، من شدة التكاثري (CMPs/غمبس) إلى درجة عالية من التطور (مودك موماك). حاولنا أيضا استراتيجية الفرز لخلايا يحركها من السائل الدماغي النخاعي الآلية العالمية ووصف لينين للفريق الذي كان يستند إلى CD31 و Ly6C 18. ومع ذلك، وجدنا أن CD31 كان يمثل مشكلة. أعرب عن مستويات منخفضة جداً (مما يجعل من الصعب حل السكان للفرز نظيفة) بمجموعة فرعية صغيرة زوال الخلايا، وإلا وقت مبكر جداً خلال فترة الثقافة. وفي الواقع، لم يكن التعبير CD31 يمكن اكتشافها في الماضي يوم 2 من الثقافة في GM-CSF 10.

ومع ذلك، كان Ly6C، جزيء مفيد جداً لفصل الخلايا في مراحل مختلفة من التنمية بسبب نمط التعبير 10عابرة. إضافة CD115 مكنتنا من أوثق تمييز الخلايا في مراحل التنمية التي لم يكن من الممكن مع CD31 المتوسطة والإصدارات الأحدث. درسنا أيضا علامات أخرى من فروعه مثل CD34 و CD117 أمل عزل عدد كبير من هذه الخلايا المبكر 10. ومع ذلك، بخلاف التي ذكرت في النظام Flt3L، وجدنا أن CD34 و CD117 أبديت أيضا على مجموعة فرعية صغيرة جداً من الخلايا وكانت غائبة تقريبا يوم 3 من الثقافة 17. قد تكون هذه العلامات الخلايا الجذعية مفيدة في الدراسات المستقبلية ولكن التمييز بين مجموعات فرعية داخل السكان CMP أو برنامج الرصد العالمي.

وهناك عدة تعديلات محتملة للبروتوكول التي يمكن أن تؤثر على عائد السكان الخلايا المطلوب. أولاً، قد يختار المستخدم تطبيق صلاحية وصمة عار لاستبعاد أي خلايا ميتة. استناداً إلى الملاحظات، معدل الخلايا الميتة إطار نموذجي للأمام والجانب مبعثر بوابة منخفضة نسبيا بشكل عام، وتطرح مشاكل فقط خلال الأيام القليلة الأولى من الثقافة، تزامنت مع انخفاض في نسب لمفاوية إيجابية. إلا للتطبيقات في الخلية التي يجب أن تكون أرقام دقيقة، ستكفل وصمة صلاحية استبعاد الخلايا الميتة.

تعديل ثاني محتمل استنفاد لمفاوية إيجابية النسب قبل الثقافة. وقد حاولنا في هذا النهج لمعالجة السكان صغيرة من الخلايا إيجابية النسب التي لوحظت بشكل منتظم ضمن السكان Ly6C-CD115-خلية. خلية العائد الإجمالي أقل بشكل طفيف في أيام 5 و 6، والنقاء لم يكن أعلى بكثير (البيانات لا تظهر). وهكذا، لا تبرر النقاء انخفاض العائد. وبالمثل، إذا كان المستخدم تخطط لفرز 5 في اليوم أو بعد، تواتر لمفاوية داخل الثقافة هو أقل من 1% ولا ينبغي أن يطرح مشكلة.

أخيرا، لأنه تم تصميم هذه الاستراتيجية لعزل الخلايا عبر طيف إنمائية كبيرة للمستخدم ينبغي تكييف توقيت انتهاء الفرز لجمع أكبر عدد ممكن من السكان المطلوب قدر الإمكان. صدق غلة هذه الاستراتيجية فرز أنواع الخلايا التي ذكرت بغض النظر عن يوم الثقافة التي يتم فرز الخلايا. على سبيل المثال، الخلايا بالنمط الظاهري Ly6C + CD115-CD11c-هي وفيا بالنمط الظاهري برنامج الرصد العالمي ووظيفة المثل ما إذا كان يتم فرز ومعزولة في اليوم 3 أو 5 من الثقافة. غير أن تواتر هذه الخلايا أكبر بكثير في يوم 3 من 5، حتى إذا كان الهدف عزل هذا النوع الخلية، أن أوصى الفرز في اليوم 3. ومن الملاحظ أيضا أن فرز الخلايا في اليوم 3 التقدم المحرز من خلال مراحل النمو اللاحقة مع حركية أبطأ مما إذا كانت تم فرزها في يوم 5 أو 7 (الشكل 3).

في حين يسمح هذا الأسلوب لتحديد واضح وعزل السكان 5 – 6 متميزة على امتداد الطيف التنموية، يرجح أن هناك العديد من السكان أكثر أو المراحل الانتقالية على طول هذا المسار. داخل كل فئة من السكان في وصف خمسة قد يكون هناك عدة السكان الفرعية في زيادات طفيفة مختلفة من التنمية. على سبيل المثال، لاحظنا ولدت "مميزة" السكان بمستويات متوسطة من CD115 ومن Ly6C التي تخضع لأنماط مختلفة قليلاً للتنمية، من حيث كم موماك ومودك (البيانات لا تظهر). من المرجح أيضا أن السكان لوحظ سابقا في فيفو موجودة في نظام الفرز وثقافة، ولكن هذه كان من الصعب تحديد سبب هذه الترددات المنخفضة جداً. السكان مثل كمب 19أو 20من حزب الألفية الديمقراطي CDP 21 المحتمل في الوقت الحاضر، ولكن قد تكون محجوبة ضمن عدد أكبر من السكان. سوف يلزم الدراسات المستقبلية لزيادة توضيح المراحل التنموية العديدة التي قد تكون معزولة داخل هذا الإطار فرز بالإضافة إلى علامات محددة للتفريق. قيمة هذه الاستراتيجية الفرز أنه يسمح لعزل يتفق عدد كبير من مراحل متميزة تنمويا خلال أونتوجيني العاصمة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب على لا تعارضات بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن ممتنون للمساعدة التقنية من "أليسون الكنيسة الطيور" في أوبورن جامعة مدرسة من الطب البيطري التدفق الخلوي المرفق، لتمويل من المعاهد الوطنية للصحة EHS R15 R15 AI107773 والخلوية وبرنامج البيولوجيا الجزيئية في جامعة أوبورن لفصل الصيف تمويل البحوث لاستعراض البرامج والميزانية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HBSS buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60 mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50 mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10 mL Syringe BD Biosciences 301604
23 G needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 138، الخلية الجذعية التنمية، والآلية العالمية-صندوق إنقاذ الطفولة، المشتركة النقوي السلف، السلف بلعم المحببات، الوحيدات، والخلايا الجذعية المشتقة من الوحيدات، والمشتقة من الوحيدات بلعم، فرز الخلايا عالية السرعة
توليد عدد كبير من فروعه النقوي وسلائف الخلايا الجذعية من نخاع العظام مورين باستخدام خلية رواية فرز استراتيجية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, P. B., Schwartz, E. H.… More

Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter