Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Generation af stort antal myeloide stamceller og dendritiske celle prækursorer fra Murine knoglemarven ved hjælp af en roman celle sortering strategi

Published: August 10, 2018 doi: 10.3791/57365
Automatic Translation
1, 1
1Department of Biological Sciences, Auburn University

Summary

Her giver vi en metode til at identificere og isolere stort antal GM-CSF drevet myeloide celler ved hjælp af højhastigheds celle sortering. Fem forskellige populationer (fælles myeloide stamceller, granulocyt-makrofag progenitorceller, monocytter, monocyt-afledte makrofager og monocyt-afledte DCs) kan identificeres baseret på Ly6C og CD115 udtryk.

Abstract

Kulturer af monocyt-afledte dendritiske celler (moDC) genereret fra mus knoglemarven ved hjælp af granulocyt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) har for nylig blevet anerkendt at være mere forskelligartede end tidligere værdsat. Disse kulturer indeholder rutinemæssigt moDC samt monocyt-afledte makrofager (moMac), og endda nogle mindre udviklede celler som monocytter. Målet med denne protokol er at skabe en konsekvent metode til identifikation og adskillelse af de mange celletyper i disse kulturer som de udvikler, således at deres særlige funktioner kan undersøges yderligere. Sortering strategien præsenteret her adskiller cellerne først i fire befolkning baseret på udtryk for Ly6C og CD115, som begge udtrykkes forbigående af celler som de udvikler i GM-CSF-drevet kultur. Disse fire populationer omfatter fælles myeloide stamceller eller CMP (Ly6C-, CD115-), granulocyt-makrofag ophav eller GMP (Ly6C +, CD115-), monocytter (Ly6C +, CD115 +), og monocyt-afledte makrofager eller moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c er også tilføjet til sortering-strategien til at skelne mellem to befolkninger i Ly6C-, CD115-befolkning: CMP (CD11c-) og moDC (CD11c +). Endelig kan to populationer skelnes yderligere inden for Ly6C-, CD115 + befolkning baseret på niveauet af MHC klasse II udtryk. MoMacs express lavere niveauer af MHC klasse II, mens en monocyt-afledte DC forløber (moDP) udtrykker højere MHC klasse II. Denne metode giver mulighed for pålidelige isolering af flere udviklingshæmmede adskilte populationer i antal tilstrækkeligt til en lang række funktionelle og udviklingsmæssige analyser. Vi fremhæve én sådan funktionelle udlæsning, disse celletyper differential Reaktionerne stimulation med Pathogen-Associated molekylære mønstre (PAMPs).

Introduction

Dyrkning af murine knoglemarv celler med cytokin er granulocyt-makrofag koloni stimulerende faktor (GM-CSF) almindeligt anvendt som en metode til at generere monocyt-afledte dendritiske celler (moDC; også kendt som inflammatoriske DC) i stort tal 1, 2,3,4,5. Disse celler har været yderst nyttig i en række undersøgelser af dendritiske celler (DC) funktion 6,7,8. Typisk, disse murine knoglemarv celler er kulturperler i 6-8 dage og derefter anvendes til undersøgelse af dendritiske celle funktion 5. Disse kulturer havde længe været betragtet som for det meste homogen, bestående af et flertal af differentierede moDC. For nylig, er det blevet klart, at i slutningen af denne periode på 6 – 8 dage kultur, der er faktisk mange moDC, samt en stor delmængde af differentierede monocyt-afledte makrofager (moMacs) 9,10,11. Vores egne undersøgelser har yderligere udvidet disse resultater viser, at andre delmængder af mindre udviklede celler, såsom moDC prækursorer (moDP) og monocytter, forbliver i kulturer med lav frekvens selv efter 7 dage 10. Således, undersøgelser af dendritiske celler (DC) funktion ved hjælp af celler genereret af dette system kunne afspejle svar af en bredere kohorte af celletyper end tidligere værdsat.

Vi har lært en hel del fra studiet af GM-CSF-genereret moDC vedrørende funktionen af disse celler i de sidste faser af differentiering 12,13,14. Vi forstår dog væsentligt mindre om den udviklingsmæssige pathway af disse celler 2,15,16 , og af hvordan og hvornår de udviser specifikke funktioner som f.eks: lydhørhed over for patogenet associeret molekylære Mønstre (PAMPs), fagocytose, antigen behandling og præsentation 13og anti-bakteriel aktivitet. En protokol til isolering af store mængder af konventionelle Flt3L-drevet DC ophav og prækursorer er blevet rapporteret 17. Isolation af disse forskellige befolkninger blev opnået ved hjælp af carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-farves knoglemarv celler (for at spore delende celler) og kultur i Flt3L for 3 dage. Celler var så forarmet af linage positive celler og sorteret i Stamform og forløber befolkning baseret på CD11c udtryk 17. En anden tilgang af Leenens gruppe at identificere tidlige stamfaderen til DC i GM-CSF-drevet kultur var at sortere cellerne baseret på CD31 og Ly6C 18. Det oprindelige mål var at skabe en lignende metode til at indhente ophav og prækursorer af GM-CSF-drevet moDC. På grund af de specifikke celletyper genereret af GM-CSF, tilpasset vi tilgangen og sortering strategi baseret på udtryk for molekyler, der blev udtrykt i starten og senere faser af udvikling. Vi har i sidste ende besluttet, at Ly6C, CD115 (CSF-1 receptor), og CD11c var de bedste markører for skelne disse celle typer 10.

Vi præsenterer her, en metode til dyrkning af celler på flere forskellige stadier af udvikling langs vej af differentiering drevet af GM-CSF: fælles myeloide stamceller (CMP), granulocyt-makrofag stamfader (GMP), monocyt, monocyt-afledte makrofag (MoMac) og monocyt-afledte DC (MoDC). MoMac befolkningen kan være yderligere adskilte baseret på niveau af MHC klasse II udtryk, afslører en moDC forløber befolkning (moDP) 10. Vi udnytter en højhastigheds fluorescens-aktiveret celle sortering (FACS) strategi for at isolere disse 5 befolkning baseret på udtryk for Ly6C, CD115 og CD11c. Vi så vise, undersøgelse af disse celler i funktionelle assays afslører deres svar til PAMP stimulation.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyr arbejde blev godkendt af Auburn University institutionelle Animal Care og brug Udvalget i overensstemmelse med de henstillinger, der er skitseret i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health.

1. forberedelse til knoglemarven samling

  1. Forbered 250 mL komplet medier ved at tilføje en opløsning af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin og 50 µM 2-mercaptoethanol til toppen af et 0,22 µm vakuum filter kolbe enhed, og anvende vakuum.
    Bemærk: Komplet medium kan opbevares ved 4 ° C i op til 2 måneder.
  2. Forberede 70% ethanol løsning ved at blande 350 mL 100% ethanol med 150 mL sterilt H2O i en 500 mL målekolbe.
  3. Sæt centrifuge til 4 ° C.
  4. Sterilisere pincet, skalpel og saks i 70% ethanol.
  5. Ved hjælp af en serologisk pipette, tilsættes 5 mL af komplette medier til tre petriskåle med 60 mm.
  6. Ved hjælp af en serologisk pipette, tilsættes 30 mL af komplette medier til en 50 mL konisk slange.

2. indsamling af Murine knoglemarv celler

  1. Aflive en C57BL/6 mus af CO2 narkose i overensstemmelse med de regler i 2013 amerikanske veterinære Medical Association (AVMA) retningslinjerne om aktiv dødshjælp.
  2. Ophæve og afklæde bagbenene.
    1. Mætte på bagbenene og torso med 75% ethanol, og lavvandede skærer gennem huden omkring hofteleddet med buede væv saks. Brug af pincet, fast træk huden fra hoften mod anklen, afslørende musklen. Brug saks til at fjerne hud flap.
    2. Fjerne den hele bagben ved at skære igennem ben lige over femur/hofteleddet.
      Bemærk: Ud over sterilisering området, ethanol vil støtte i at yde rene snit og forhindre hår fra forurener prøverne.
    3. Hvis benene vil blive overført til en ny placering til knoglemarven høst, nedsænkes ben i komplet media.
  3. Arbejder i en steril biosikkerhed kabinet, overføre benene til en af de tidligere parat petriskåle.
  4. Brug saks til at skære det bare under anklen, og forsigtigt fjerne så meget af muskel og elastisk bindevævet som muligt. Overføre rengøres knoglen til andet rede petriskålen.
    Bemærk: Selv om det ikke er nødvendigt at fjerne alle muskler, for meget resterende væv kan gøre det vanskeligt at skylle ud knoglemarven.
  5. Adskille laarben, knæ og skinneben.
    1. Brug af pincet, holde benet på knæet og Find marv.
      Bemærk: knoglemarven bør ses som en svag rød linje inde i knoglen hulrummet øverst på lårbenet og mod slutningen af skinnebenet.
      1. Brug saks, lave tre nedskæringer som følger.
        1. Skære tibia lige over hvor marv synes at ende.
        2. Skære lige under knæleddet.
        3. Skær lige over knæleddet.
        4. Hvis hofteleddet er stadig forbundet til lårbenet, skære lige nedenfor hofteleddet.
      2. Returnere de tre fragmenter til petriskålen og gentage denne proces på andre ben.
  6. Skylle knoglemarv fra lårben og skinneben.
    1. Fyld en 10 mL sprøjte med komplet media fra 50 mL konisk rør og hætte med 23 G kanyle.
    2. Holde knoglen med pincet ovenfor den tredje rede petriskål, indsætte nålen ind i knoglen kanalen og skubbe medier gennem, udskylning cellerne (som kan opstå som en intakt "stik" eller flere klynger). Gentag indtil ikke flere farve kan ses igennem ben. Refill sprøjte med medier som nødvendigt.
  7. Knuse epifyserne.
    1. Mens stadig i den anden petriskål, hold knæskallen fast med pincet og mash knæ med spidsen af sprøjten. Fortsætte indtil epifyserne er ikke længere rød.
  8. Brug sprøjten, overførsel cellerne fra den anden og tredje petriskål til 50 mL tube. Bruddet op klumper af pipettering forsigtigt op og ned. Prøv ikke at generere bobler. Der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
  9. Lyse røde blodlegemer
    1. Fjern supernatanten med serologisk pipette, løsne pellet ved at bladre og lyse røde blodlegemer ved at inkubere i 1 mL af ACK (Ammonium-chlorid-kalium) lysisbuffer i 1 minut ved stuetemperatur.
    2. Brug en serologisk pipette, tilføje 40 mL af HBSS (Hanks Balanced Salt Solution) buffer.
  10. Ved hjælp af en serologisk pipette, filtrere cellerne selv en 70 µm celle si ind i en ny 50 mL konisk rør. Der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
  11. Ved hjælp af en serologisk pipette, Fjern supernatanten og vask celler med 40 mL af komplette medier. Der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
    Bemærk: På dette stadium, lineage positive lymfocytter kan fjernes ved FACS eller magnetiske kolonne rensning. Lymfocytter bevares dog ikke lang sigt i kultur. Selv om et stort antal lineage positive celler findes i Ly6C-CD115-befolkning i knoglemarven ex vivo, næsten alle er fraværende af dag 5 (figur 2).
  12. Ved hjælp af en serologisk pipette, Fjern supernatanten, og kultur knoglemarven cellerne i komplet media med 10 ng/mL af rekombinante mus GM-CSF med en tæthed på 1 x 106 celler/mL.
    Bemærk: Typisk 4 x 107 samlede celler kan høstes efter røde blodlegemer lysering. Forvent dog så lidt som 2 x 107 for begyndere og op til 5 x 107 celler for erfarne høstmaskiner.
  13. Ved hjælp af en serologisk pipette, overføre cellerne til vævskultur plader og inkuberes ved 37 ° C i 5% CO2. Hvis ved hjælp af en 24-godt plade, frø hver godt med 2 mL cellesuspension.
  14. Hver 48 h, bruge en serologisk pipette til at fjerne halvdelen af medierne og erstatte med frisk komplet media og GM-CSF.
    Bemærk: Kulturer kan holdes til 9 dage. Dog ændrer sammensætning sig over tid. Flere oplysninger finder du under afsnit 3.

3. at vælge dag i form

  1. Da cellen befolkningen kompositioner ændre sig over tid, vælge en dag, der giver det højeste antal ønskede celler.
  2. Se tabel 1 for den forventede celle udbytte post form for hver af befolkningsgrupper efter 3, 5 og 7 dage af kultur i GM-CSF pr. 1 x 107 celler.

4. farvning strategi

  1. Bruge små prøver af celler til at forberede kontrolprøver. Omfatter en unstained kontrol, kompensation kontrolprøver farves med kun én fluorescerende antistof hver, og fluorescens-minus-one styrer i hvilken alle antistoffer er tilføjet undtagen én, at kontrollere for non-specifik fluorescens i denne kanal. Hvis ved hjælp af indirekte mærkning, omfatter primær alene, sekundære alene, og både primære og sekundære.
    Bemærk: Phycoerythrin (PE) og allophycocyanin (APC) mærkede antistoffer giver tydelig adskillelse med minimal bløder når de bruges sammen. Men hvis fluorokrom muligheder er begrænsede, CD115 er udtrykt på et relativt lavt niveau, mens Ly6C udtrykkes på et meget højt niveau. Derfor lysere fluorokromer er ønskeligt for anti-CD115, og anti-Ly6C fluorokromer er valgt at forhindre bløder over.
  2. Forberede 100 mL af FACS Wash Buffer (FWB) ved at blande 97 mL af kølet Dulbecco fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) med 3 mL føtalt kalveserum i en 50 mL konisk slange, og anbringes i isbad.
  3. Bruge en pipette til forsigtigt, men grundigt, afpipetteres celler op og ned for at løsne eventuelle løst vedhængende celler.
  4. Brug en serologisk pipette, overførsel celler til en 50 mL konisk slange. Der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
    1. Hvis cellevolumen overstiger 50 mL, Overfør celler til det nødvendige antal rør og kombinere på trinnet farvning.
  5. Forsigtigt hæld supernatanten, og vaske de pelleted celler ved at tilføje 30 mL af FWB med en serologisk pipette. Der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min., og Gentag vask.
    Bemærk: Hvis høje celledød forventes, celler kan vaskes med FWB med så lav som 0.5% føtalt kalveserum (FCS). Dette forhindrer celle sammenklumpning.
  6. Suspendere og plette celler pr. antistof producentens anvisninger.
    1. Suspendere 5 x 107 celler i 1 mL af FWB og tilføje 2 µg af anti-Ly6C og anti-CD115 mærket med fluorophores (af forskerens valg). Hvis der yderligere skelnes CMP fra moDC (begge er Ly6C- og CD115-), tilføje 2 µg af anti-CD11c antistoffer (CMP er CD11c-; moDC er CD11c+). Inkuber i 30 min på is.
      Bemærk: Tallet 3 blev genereret ved hjælp af Ly6C-PE og CD115-APC.
  7. Ved hjælp af en serologisk pipette, der tilsættes 10 mL af FWB, og der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
  8. Forsigtigt hæld supernatanten, og vaske de pelleted celler ved at tilføje 30 mL af FWB med en serologisk pipette. Der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min., og Gentag vask.
  9. Før suspendere celler, svirp rør grundigt for at løsne pelleten. Brug en serologisk pipette til at suspendere celler ved 1 x 107 celler/mL af FWB, og filtreres gennem 35-µm celle filter. Brug en serologisk pipette til at overføre filtrerede celler ind i polypropylen rør, og Anbring på is indtil klar til at sortere.
    Bemærk: Hvis polypropylen er ikke tilgængelig, protein belagt (nonfat tørt mælk eller FCS) polystyren rør kan bruges til at reducere bindende.

5. Indstil Gates baseret på kontrolprøver

Bemærk: For at forhindre cell forstyrrelser på grund af presset fra high-speed strøm strøm, brug en 100-130 µm dyse til celle sortering.

  1. Opstille den unstained kontrol (Se trin 4.1) gennem celle sorteringsanlæg, og anvende en gate for at udelukke små vragrester (lav forward scatter; FSC) og stærkt kornet (høj side scatter; SSC) partikler.
    1. For at analysere Anvend kun de senere faser (monocytter, moMac/MoDP og MoDC), gating kun at inkludere større celler (høj FSC).
    2. Hvis levedygtighed pletter, der bruges, skal du bruge disse til at udelukke farvede, ikke-levedygtige begivenheder (et eksempel er illustreret i figur 1).
  2. Køre de enkelt fluorescerende kontrolprøver gennem celle sorteringsanlæg, og Juster kompensation efter behov.
  3. Kør en prøve af den multi-mærket prøve. Observere fire adskilte populationer: Ly6C + CD115-(GMPs), Ly6C + CD115 + (monocytter), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP), og Ly6C-CD115 - (Kystforvaltningsplaner/moDCs). Anvende en gate for at isolere hvert af de fire store befolkningsgrupper.
    Bemærk: Kystforvaltningsplaner og moDC dele Ly6C-CD115-fænotype. Men de kan differentieres baseret på CD11c udtryk: CMP mangler CD11c, hvorimod MoDCs express CD11c.

6. samling af isolerede befolkninger

  1. Forberede indsamling rør ved at tilføje nok FCS for at opnå mindst 20% endelige koncentration når fuld. Eksempelvis hvis du bruger 5 mL rør, tilsættes 1 mL af FCS før sorteringen, og fjerne røret, når den når 5 mL samlede volumen.
  2. For at forhindre membran omsætning og antistof optagelse, skal du holde alle prøver (blandet og sorterede) ved 4 ° C under hele sorteringen.
    1. Hvis dette ikke er muligt, holde røret der indeholder celler til at være sorteret på isen så meget som muligt og overføre delprøver til Sorteremaskine efter behov.
    2. Derudover overførsel sorteret prøver til is hver 20-30 min.
  3. Når det ønskede antal celler er blevet indsamlet, brug en serologisk pipette overførsel cellerne til en ny koniske rør. Der centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min.
    1. Bekræfte renhed med post slags analyse på små prøver fra hver indsamlet befolkning.
  4. Fjern supernatanten, suspendere i 10 mL af FWB og centrifugeres ved 250 x g ved 4 ° C i 10 min. Gentag i alt af to skylninger.
    Bemærk: Det kan være vanskeligt at fjerne alle supernatanten uden løs pellet. Montering en pipette tip til et vakuum linje kan hjælpe med fjernelse. Hvis dette ikke er tilgængelig, anbefales det, at supernatanten opsamles i en frisk rør ved pellet dissociation.
  5. Fjern supernatanten efter den anden vask.
  6. Hvis brugerens eksperimentelle design dikterer cellerne blive re kulturperler, Følg trin 2.12 – 2.14. Ellers, hvis celler vil blive brugt til øjeblikkelig analyse, forberede celler efter ønskede protokol.
    Bemærk: Et eksempel på typisk funktionalanalyse er inkluderet i figur 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

I et forsøg på at holde så mange kanaler til rådighed for analyse som muligt, levedygtige celler blev rutinemæssigt udvalgt baseret på frem og side scatter, bortset fra meget små og meget granulat begivenheder (en typisk gate anvendes til alle dot parceller i figur 1A). For at afgøre, om denne gating strategi pålideligt udelukket døde celler, plettet vi med 7-Amino actinomycin D (7-AAD) (figur 1B). 7AAD pletter DNA i døde og døende celler på grund af membran permeabilitet, og er omfattet af levedygtige celler. Levedygtighed af GM-CSF kulturperler knoglemarv celler blev analyseret straks efter høst (PH) og 1, 3 og 5 PH. celle analyseres straks PH havde ca 10% af 7-ald positive celler, da en typisk FSC/SSC gate blev udlignet med frisk isolerede celler fra knoglen marv (figur 1, efter høst). En lignende andel af døde celler var også til stede på dag 1 (~ 12%) og 3 (~ 11%) af kulturen (figur 1, 1 dag PH og 3 dage PH). Dag 5, blev antallet af døde celler inden for porten reduceret til ~ 5% (figur 1, 5 dage PH). Således, ved hjælp af sådan en levedygtighed gate er generelt velegnet til sortering på dag 5 og efter. Derfor, hvis brugere er begrænset i deres tilgængelige parametre, FSC/SSC gating er generelt egnede. Imidlertid til mere følsomme assays (især hvis de er afhængige af præcise celle numre), indarbejde en levedygtighed pletten (forslag).

Mange protokoller til formering af dendritiske celler anbefale nedbrydning lineage positive celler, især lymfocytter fra knoglemarven før kultur 11,17. Denne procedure menes at øge renheden af cellerne inddrives ved GM-CSF-medieret differentiering. Typisk, celler, der udtrykker markører af T-celler (CD3), B-celler (CD45R eller CD19), og NK celler (NK1.1) kan være udtømt ved positiv markering med magnetiske perler eller celle sortering 11,17,18. Men baseret på de dyrkningsbaserede system, lymfocytter var sjældent inddrives eller opdaget i disse assays. Dermed, vi forsøgt at vurdere levetiden af lymfocytter vedligeholdes i Ly6C-CD115-befolkningen blandt de GM-CSF-drevet celler (figur 2A). GM-CSF kulturperler knoglemarv celler (som ikke havde været lineage forarmet) var plettet med antistoffer mod CD3, CD45R og NK1.1 (i den samme fluorophore) og målt dagligt ved flowcytometri (figur 2B). Inden for Ly6C-CD115-befolkning varet CD3/CD45R positive celler kraftigt igennem dage 0-3 (figur 2B). På dag 4, kun et par CD3/CD45R positive celler forblev, og i dag 5 og 6, der var ingen CD3/CD45R udtrykker celler til stede. Således senest 4 dage efter kultur i GM-CSF, lineage positive celler var stort set fraværende og blev ikke fundet på alle dage 5 og 6 i kultur.

Sammensætningen af GM-CSF-drevet cellekultur ændringer dagligt i dette system som cellerne udvikle og differentiere (tabel 1; Figur 3). På tidlige tidspunkt punkter, de mest rigelige celler er ophav og prækursorer, og på tidspunkter fleste celler er senere mere differentieret 10. For at bestemme, hvordan sortering på forskellige dage i kultur kan påvirke den efterfølgende udviklingsmæssige sti eller kinetik, blev mulige udført 3, 5 og 7 dage PH (figur 3A). Udviklingen af MoMac befolkningen (Ly6C-CD115 +) blev derefter spores 2-3 yderligere dage i kultur (figur 3B-3D).

Når sorteret 3 dage PH, kun 40% af Ly6C-CD115 + celler var faldet CD115 udtryk inden for 24 timer efter form (PS) (figur 3B). Af 48 h PS, den brøkdel, som havde ned-regulerede CD115 var 66% og af 72 h, havde 70% af cellerne denne fænotype. Denne fænotypiske sammensætning blev opretholdt (~ 70-72% Ly6C - CD115-) selv efter yderligere dage af kultur (data ikke vist). Når sorteret 5 dage PH, ~ 75% af celler blev Ly6C - CD115-, har hurtigt nedreguleret CD115 inden for 24 h PS og ~ 80% var CD115 - efter kun 48 timer. Denne fordeling var vedligeholdes efter 72 h (figur 3 c). Endelig, når sorteret 7 dage PH, ned-regulering af CD115 var også ganske hurtig. Inden for 24 h PS, ~ 75% af celler var nedreguleret CD115 udtryk, og denne tendens blev opretholdt efter 48 h (figur 3D). Interessant, når sorteret på dag 7, var det samlede niveau for CD115 udtryk lavere på celler inden for befolkningens CD115 +.

Således, disse resultater tyder på, kinetik af udvikling er noget langsommere, når du sorterer på en tidlig dag, som dag 3 sorteret celler i forhold til den mere hurtige udvikling og differentiering observeret efter sortering på dag 5 eller 7. Baseret på disse resultater, brugeren søger større antal moDC bør sandsynligvis form på dag 5 eller 7.

Modning svar af DC er veletableret 6,7,12,14. Når behandlet med en bred vifte af patogen-associeret molekylære mønstre (PAMPs), umodne DC op-regulere udtryk af MHC, costimulatory molekyler og pro-inflammatoriske cytokiner, forbedre deres T-celle aktivering kapacitet 6. Det er imidlertid mindre tydelig når udvikle celler få kapacitet til at reagere på PAMP stimulation og som funktion af DC modning de kan udstille. For at afgøre, hvilke af de sorterede befolkningsgrupper vil reagere på modning stimuli, hver befolkning blev behandlet kort efter sortering med en cocktail af PAMPs herunder Poly: C, lipopolysaccharides (LPS), og CpG DNA til at udløse toll-lignende receptor (TLR) 3 (TLR3), TLR4 og TLR9, henholdsvis. Celler blev behandlet (eller ubehandlet) i 24 timer og udtryk af CD86 og MHCII blev målt ved flowcytometri (figur 4A-4B). Derudover blev produktionen af IL-12p 40/70 og IL-6 målt i analysere af cytokin array ELISA (figur 4 c-4D).

Kystforvaltningsplaner og GMPs udtrykt meget lave niveauer af MHC klasse II og CD86 i en unstimulated tilstand, og disse udtryk mønstre ikke ændre væsentligt ved udsættelse for Cocktailen af PAMPs (figur 4A og 4B). Ligeledes blev udtryk af MHC klasse II af monocytter også lav og ændret lidt ved PAMP eksponering (figur 4A). Dog udtryk for CD86 var moderat på monocytter 24 h efter sortering, og det steg yderligere efter 24 h stimulation. Højere basal udtryk af MHC klasse II og CD86 i MoMacs og MoDCs blev observeret, og begge befolkningsgrupper udstillede en stærk induktion af disse molekyler ved PAMP stimulation. Med hensyn til MHC klasse II udtryk efter stimulation, var der ingen statistisk forskel mellem Kystforvaltningsplaner, GMPs og monocytter, mens MoMacs og MoDCs udgjorde en særskilt gruppe. Endnu, med hensyn til CD86 udtryk, Kystforvaltningsplaner og GMPs cellerne var statistisk anderledes end MoMacs og MoDCs. Monocytter var dog ikke anderledes end MoMacs eller MoDCs.

Dernæst ønskede vi at vurdere den relative evne af hver af de fem befolkninger til at producere cytokiner som svar på TLR stimulation. Således, vi udført en cytokin assay på sorteret befolkningerne efter kultur i tilstedeværelse eller fravær af TLR agonist cocktail brugt ovenfor. Celler var kulturperler med stimuli i 24 timer, så supernatanter blev indsamlet. Vi observeret meget lidt IL - 12 p 40/70 eller IL-6 produktion af Kystforvaltningsplaner ved TLR stimulation (figur 4 c-4D). Befolkningens GMPs, var ikke i stand til at producere IL-12p 40/70 (figur 4 c), men disse celler producerede en lav mængde af IL-6 ved stimulation af PAMPs (figur 4D). De højeste niveauer af cytokin produktion blev observeret i de sidste tre populationer. Monocytter og MoMacs havde meget lignende mønstre og størrelser af cytokin produktion. Begge steget kraftigt IL - 12 p 40/70 og beskedent øget IL-6 produktion op stimulation (figur 4 c-4D). Interessant, i overværelse af PAMPs MoDCs ikke øge IL-12 p 40/70 sekretion; denne befolkning steg imidlertid kraftigt IL-6 produktion (figur 4 c-4D). Disse resultater viser, at de sorterede befolkninger efter isolation opretholdes deres immunologiske funktioner.

Figure 1
Figur 1: levedygtige celler inden for fremad versus Side Scatter gate. Musen knoglemarv var kulturperler i GM-CSF, og rentabiliteten blev målt ved hjælp af 7-ald (7-amino-actinomycin D) farvning efter høst (PH) og 1, 3 og 5 dage efter høst. (A) levedygtige celler blev udvalgt ved at anvende en gate (Viable) som udeladt små og stærkt kornet begivenheder på basis af FSC og SSC. (B) histogrammer af 7-ald farvning genereret fra begivenheder inden for Viable (FSC/SSC) gate. Begivenheder positive for 7-ald angive celler undergår apoptose. Pilene angiver levedygtige celle gating. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: lymfocytter inden for Ly6C-CD115-befolkning. Musen knoglemarv var kulturperler i GM-CSF og lymfocyt markører (CD3, CD145R og NK1.1) blev analyseret dagligt ved flowcytometri. (A) celle var farves med Ly6C-PE og CD115-APC at identificere Ly6C-CD115-celler. Quadrant gate blev anvendt baseret på single-farve kontrol. Pseudocolor dot plot genereret fra dag 0 (B) CD3, CD45R og NK1.1 udtryk for Ly6C-CD115-celler blev analyseret på dagen for høst (dag 0) indtil dag 6. Celletal var normaliseret til mode ved hjælp af en flow flowcytometri analyse software. Pilen angiver Ly6C-CD115 - gating. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kinetik af udvikling af Ly6C-CD115 + celler efter sortering på forskellige dage. (A) mus knoglemarv var høstet og kulturperler i GM-CSF. Delprøver af 1 x 107 celler blev høstet (B) 3, (C) 5, eller (D) 7 dage efter høst (PH). På de angivne dage PH, Ly6C-CD115 + celler blev sorteret fra blandet kultur (før sortering) og analyseres umiddelbart efter sortering (PS). Sorterede celler blev igen kulturperler i GM-CSF, og ændringer i Ly6C/CD115 udtryk blev analyseret dagligt ved flowcytometri. Boksen og pilen viser sortering gate. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: modning og cytokin udtryk efter TLR stimulation. Celler blev sorteret i 5 befolkninger på dag 3 af kultur i GM-CSF. De blev derefter behandlet med en cocktail af PAMPs (LP'ER, Poly jeg: C og CpG DNA) for 24 h. mener fluorescerende intensitet (MFI) af (A) MHC klasse II og (B) CD86 blev analyseret umiddelbart efter sortering (PS) og 24 h med og uden PAMPs af flow flowcytometri. Fejllinjer udgør standardafvigelse på 3-5 Repliker eksperimenter. (C) IL - 12 p 40/70 og (D) IL-6 i supernatanter fra 3 poolede prøver blev målt ved cytokin array dot skamplet ELISA efter 24 timer med og uden PAMPs. RLU; Relativ lys enheder; -/ + indikere tilstedeværelsen af celle overflade markør for den udpegede befolkning. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Dag 3 Dag 5 Dag 7
Fænotype Celletype Min Max Min Max Min Max
Ly6C-CD115-CD11c - CMP 3 x 106 4 x 106 5 x 105 1 x 106 Nielsen Nielsen
Ly6C + CD115- GMP 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 Nielsen Nielsen
Ly6C + CD115 + Mono 2 x 106 3 x 106 2 x 106 3 x 106 5 x 105 1 x 106
Ly6C-CD115 + MoMac 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106 3 x 106 4 x 106
Ly6C-CD115-CD11c + MoDC Nielsen Nielsen 5 x 105 1 x 106 3 x 106 4 x 106

Tabel 1: Forventes minimum og maksimum antal celler inddrives efter form pr. 1 x 107 celler. CMP (fælles myeloide stamceller); GMP (granulocyt-makrofag stamfader) Mono (monocytter); MoMac (monocyt-afledte makrofag); MoDC (monocyt-afledte dendritiske celle); Nielsen (ikke tilgængelig); Min (minimum celle udbytte fra 1 x 107 celler); Max (maksimal celle udbytte fra 1 x 107 celler).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne protokol letter dyrkning af GM-CSF-drevet Stamform og forløber celletyper i antal tilstrækkeligt for flere typer af analyser herunder biokemiske assays, assays af cellefunktion in vitroeller instillation in vivo. Denne metode repræsenterer et betydeligt fremskridt inden for monocyt-afledte dendritiske celle udvikling, således at pålidelige isolering og identifikation af celler tidligt i denne vej af udvikling samt de differentierede celletyper mere almindeligt isoleret i forudgående undersøgelser.

Tidligere protokoller til isolation af stamfaderen og prækursorer genereret fra knoglemarv i vitro har stolet på CFSE-farvning at identificere proliferativ stamfader celler 17 eller farvning med CD31 og Ly6C som markører af myeloide celler 18 . CFSE farvning protokollen beskrevet af Naik var designet til brug i generation af Flt3L-drevet DC ophav og prækursorer 17. Da vi forsøgte denne tilgang i GM-CSF kultur system, stødte vi på to hovedproblemer. CFSE var noget cytotoksiske til at udvikle celler og var så lyse (selv i opdelte celler), at det vanskeliggjorde kompensation. Denne tilgang viste sig for at være uegnet til vores mål om isolere tidlige celletyper (ophav), samt celler på tværs af udviklingsmæssige spektret, fra meget proliferativ (Kystforvaltningsplaner/GMPs) til højtudviklede (MoDC/MoMac). Vi har også prøvet den sortering strategi for GM-CSF-drevet celler beskrevet af Leenens gruppe, som var baseret på CD31 og Ly6C 18. Dog fandt vi, at CD31 var problematisk. Det blev udtrykt på et meget lavt niveau (gør det vanskeligt at løse befolkningerne til ren sortering) af en forsvindende lille delmængde af celler, og kun meget tidlig periode kultur. Faktisk, var CD31 udtryk ikke detectable forbi dag 2 af kultur i GM-CSF 10.

Ly6C, men var en meget nyttig molekyle til at adskille celler på forskellige udviklingstrin på grund af sin forbigående mønster af udtryk 10. Tilsætning af CD115 gjort det muligt at skelne mere tæt celler på mellemliggende og senere faser af udvikling, som ikke var muligt med CD31. Vi undersøgte også andre markører af stamfaderen CD34 og CD117 i håb om at isolere stort antal af disse tidlige celler 10. Men i modsætning til det rapporteres i Flt3L systemet, vi fandt at CD34 og CD117 kom også til udtryk på en meget lille delmængde af celler og var stort set fraværende ved dag 3 af kultur 17. Disse stamceller markører kan være nyttigt i fremtidige undersøgelser imidlertid at skelne delmængder inden for CMP eller GMP populationer.

Der er flere mulige ændringer i protokollen, der kan påvirke udbyttet af ønskede cellepopulationer. Første, brugeren kan vælge at anvende en levedygtighed pletten for at udelukke enhver døde celler. Baseret på observationer, antallet af døde celler i en typisk frem og side scatter gate er relativt lavt i almindelighed, og udgør problemer kun i de første par dage af kultur, sammenfaldende med fald i lineage positive lymfocytter. Dog til programmer i hvilke celle numre skal være præcis, vil en levedygtighed pletten sikre udelukkelse af døde celler.

En anden potentiel ændring er nedbrydningen af afstamning-positive lymfocytter før kultur. Vi har prøvet denne tilgang for at løse den lille population af lineage positive celler, der blev regelmæssigt observerede i Ly6C-CD115-celle population. Den overordnede celle udbytte var lidt lavere på dag 5 og 6, og renheden var ikke væsentligt højere (data ikke vist). Således, renheden ikke berettigede reducerede udbyttet. Ligeledes, hvis brugeren har planer om at sortere på dag 5 eller efter, hyppigheden af lymfocytter inden for kulturen er langt under 1% og bør ikke udgøre et problem.

Endelig, fordi denne strategi er designet til at isolere celler på tværs af en stor udviklingsmæssige spektrum brugeren skal skræddersy timing af deres slags til at indsamle så mange af de ønskede befolkninger som muligt. Denne sortering strategi udbytter trofast celletyper angivet uanset dag i kultur, cellerne er sorteret. For eksempel, celler med fænotype Ly6C + CD115-CD11c-er GMP fænotype og funktion på samme måde om de er sorteret og isoleret på dag 3 eller 5 i kultur. Hyppigheden af disse celler er dog langt større på dag 3 end 5, så hvis målet er dyrkning af denne celletype, sortering på dag 3 ville blive anbefalet. Det er også bemærkelsesværdigt, at celler sorteret på dag 3 fremskridt gennem de efterfølgende udviklingsstadier med langsommere kinetik end hvis de blev sorteret på dag 5 eller 7 (figur 3).

Mens denne metode giver mulighed for den klare afgrænsning og isolation af 5-6 forskellige populationer langs den udviklingsmæssige spektrum, er der sandsynligvis mange flere befolkningsgrupper eller overgangsfaserne langs denne vej. Inden for hver af de fem beskrevne befolkninger kan der være flere delpopulationer på lidt forskellige trin af udvikling. Vi har for eksempel observeret, "adskilt" befolkninger med mellemliggende niveauer af CD115 og Ly6C som lidt forskellige mønstre af udvikling med hensyn til hvor mange moMac og moDC er genereret (data ikke vist). Det er også sandsynligt, at befolkninger tidligere observeret i vivo er til stede i kultur og sorteringen systemet, men det har været svært at identificere på grund af deres meget lav frekvens. Befolkningsgrupper som cMOP 19, MDP 20eller CDP 21 er sandsynligvis øjeblikket, men kan skjules i de større populationer. Fremtidige undersøgelser vil være nødvendige for at yderligere at præcisere de talrige udviklingsstadier, der kan isoleres inden for denne sortering ramme med tilsætning af specifikke markører for differentiering. Værdien af denne sortering strategi er, at det giver konsekvent isolation i stort tal af udviklingshæmmede særskilte faser under DC Ontogeni.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke nogen konflikter til at videregive.

Acknowledgments

Vi er taknemmelige for teknisk bistand fra Alison kirke fugl på Auburn University School af veterinærmedicin Flow flowcytometri anlægget, for midler fra NIH EHS R15 R15 AI107773 og cellulær og molekylærbiologi Program på Auburn University for sommeren forskningsmidler til PBR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
RPMI 1640 Corning 15-040-CV
Fetal Calf Serum (FCS) HyClone SV30014.04 to supplement complete medium and FWB
GlutaMAX Gibco 35050 to supplement complete medium
2-mercaptoethanol (2-ME) MP Biomedical 190242 to supplement complete medium
75 mM Vacuum Filter Thermo Scientific 156-4045 to sterilize complete media
ACK Lysis Buffer Lonza 10-548E to lyse red blood cell
HBSS buffer Corning 21-020-CM to rescue leukocytes after red blood cell lysis
Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's Lonza 17-512F must be endotoxin free; chilled at 4 °C
35 µm Cell filter Falcon 352235 to break apart clumps before running through cytometer.
GM-CSF Biosource PMC2011 usable concentration of 10 ng/mL
Tissue cultured treated plate VWR 10062-896 for bone marrow cells after harvest
Anti-Ly6C, Clone HK1.4 Biolegend 128018
Anti-CD115, Clone AFS98 Tonbo Bioscience 20-1152-U100
Anti-CD11c, Clone HL3 BD Biosciences 557400 to differeniate CMP and MoDCs
MoFlo XPD Flow Cytometer Beckman Coulter ML99030
BD Accuri C6 BD Biosciences 660517
100% Ethanol Pharmco-Aaper 111000200CSPP
60 mm Petri Dish Corning, Inc 353002
50 mL Conical tube VWR 21008-242
C57BL/6 Mice The Jackson Laboratory 000664 Female; 10-20 weeks old
Biosafety Hood Thermo Scientific 8354-30-0011
10 mL Syringe BD Biosciences 301604
23 G needle BD Biosciences 305145
Centrifuge 5810 R eppendorf 22625501
FlowJo Software v10 BD Biosciences Version 10 flowjo.com

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhan, Y., Xu, Y., Lew, A. M. The regulation of the development and function of dendritic cell subsets by GM-CSF: more than a hematopoietic growth factor. Mol Immunol. 52, 30-37 (2012).
  2. Zhan, Y., et al. The inflammatory cytokine, GM-CSF, alters the developmental outcome of murine dendritic cells. Eur J Immunol. , (2012).
  3. van de Laar, L., Coffer, P. J., Woltman, A. M. Regulation of dendritic cell development by GM-CSF: molecular control and implications for immune homeostasis and therapy. Blood. 119, 3383-3393 (2012).
  4. Steinman, R. M., Inaba, K. Myeloid dendritic cells. J Leukoc Biol. 66, 205-208 (1999).
  5. Inaba, K., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. J Exp Med. 176, 1693-1702 (1992).
  6. Steinman, R. M., Pack, M., Inaba, K. Dendritic cell development and maturation. Adv Exp Med Biol. , 1-6 (1997).
  7. Pierre, P., et al. Developmental regulation of MHC class II transport in mouse dendritic cells. Nature. 388, 787-792 (1997).
  8. Steinman, R. M., Witmer-Pack, M., Inaba, K. Dendritic cells: antigen presentation, accessory function and clinical relevance. Adv Exp Med Biol. , 1-9 (1993).
  9. Na, Y. R., Jung, D., Gu, G. J., Seok, S. H. GM-CSF Grown Bone Marrow Derived Cells Are Composed of Phenotypically Different Dendritic Cells and Macrophages. Mol Cells. 39, 734-741 (2016).
  10. Rogers, P. B., Driessnack, M. G., Hiltbold Schwartz, E. Analysis of the developmental stages, kinetics, and phenotypes exhibited by myeloid cells driven by GM-CSF in vitro. PLoS One. 12, e0181985 (2017).
  11. Helft, J., et al. GM-CSF Mouse Bone Marrow Cultures Comprise a Heterogeneous Population of CD11c(+)MHCII(+) Macrophages and Dendritic Cells. Immunity. 42, 1197-1211 (2015).
  12. Alloatti, A., Kotsias, F., Magalhaes, J. G., Amigorena, S. Dendritic cell maturation and cross-presentation: timing matters! Immunol Rev. 272, 97-108 (2016).
  13. Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. Monocyte differentiation and antigen-presenting functions. Nat Rev Immunol. 17, 349-362 (2017).
  14. Mbongue, J. C., Nieves, H. A., Torrez, T. W., Langridge, W. H. The Role of Dendritic Cell Maturation in the Induction of Insulin-Dependent Diabetes Mellitus. Frontiers in immunology. 8, 327 (2017).
  15. Shortman, K., Naik, S. H. Steady-state and inflammatory dendritic-cell development. Nat Rev Immunol. 7, 19-30 (2007).
  16. Xu, Y., Zhan, Y., Lew, A. M., Naik, S. H., Kershaw, M. H. Differential development of murine dendritic cells by GM-CSF versus Flt3 ligand has implications for inflammation and trafficking. J Immunol. 179, 7577-7584 (2007).
  17. Naik, S. H. Generation of large numbers of pro-DCs and pre-DCs in vitro. Methods Mol Biol. 595, 177-186 (2010).
  18. Nikolic, T., de Bruijn, M. F., Lutz, M. B., Leenen, P. J. Developmental stages of myeloid dendritic cells in mouse bone marrow. Int Immunol. 15, 515-524 (2003).
  19. Hettinger, J., et al. Origin of monocytes and macrophages in a committed progenitor. Nat Immunol. 14, 821-830 (2013).
  20. Fogg, D. K., et al. A clonogenic bone marrow progenitor specific for macrophages and dendritic cells. Science. 311, 83-87 (2006).
  21. Traver, D., et al. Development of CD8{alpha}-Positive Dendritic Cells from a Common Myeloid Progenitor. Science. 290, 2152-2154 (2000).

Tags

Immunologi og infektion spørgsmålet 138 dendritiske celle udvikling GM-SCF fælles myeloide stamfader granulocyt-makrofag stamfader monocyt monocyt-afledte dendritiske celle monocyt-afledte makrofag høj hastighed celle sortering
Generation af stort antal myeloide stamceller og dendritiske celle prækursorer fra Murine knoglemarven ved hjælp af en roman celle sortering strategi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Rogers, P. B., Schwartz, E. H.… More

Rogers, P. B., Schwartz, E. H. Generation of Large Numbers of Myeloid Progenitors and Dendritic Cell Precursors from Murine Bone Marrow Using a Novel Cell Sorting Strategy. J. Vis. Exp. (138), e57365, doi:10.3791/57365 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter