Summary
Qui forniamo un metodo per identificare e isolare un numero elevato di GM-CSF guidato cellule mieloidi utilizzando l'ordinamento delle cellule ad alta velocità. Cinque popolazioni distinte (comune dei progenitori mieloidi, progenitori del granulocita/macrofago, monociti, macrofagi monocito-derivati e DCs monocito-derivato) possono essere identificati sulla base di Ly6C e CD115 espressione.
Abstract
Colture di cellule dentritiche monocito-derivate (moDC) generate dal midollo osseo di topo usando fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) recentemente sono stati riconosciuti per essere più eterogeneo quanto precedentemente apprezzato. Queste culture contengono ordinariamente moDC pure monocito-derivate macrofagi (moMac) e anche alcune cellule meno sviluppate come monociti. L'obiettivo del presente protocollo è quello di fornire un metodo coerente per l'identificazione e la separazione tra i molti tipi di cellule presenti in queste culture come si sviluppano, in modo che loro specifiche funzioni possono essere ulteriormente approfonditi. L'ordinamento strategia presentata qui separa cellule in primo luogo in quattro popolazioni basati sull'espressione di Ly6C e CD115, entrambi i quali sono espressi transitoriamente dalle cellule come si sviluppano nella cultura di GM-CSF-guidato. Questi quattro popolazioni includono comuni dei progenitori mieloidi o CMP (Ly6C-, CD115-), dei progenitori del granulocita/macrofago o GMP (Ly6C +, CD115-), monociti (Ly6C +, CD115 +) e macrofagi monocito-derivati o moMac (Ly6C-, CD115 +). CD11c viene aggiunto anche alla strategia di ordinamento per distinguere due popolazioni entro il Ly6C-, CD115-popolazione: CMP (CD11c-) e moDC (CD11c +). Infine, due popolazioni possono essere ulteriormente distinto all'interno del Ly6C-, CD115 + popolazione sulla base del livello di espressione II MHC di classe. MoMacs esprimere livelli più bassi di MHC di classe II, mentre un precursore di DC monocito-derivate (moDP) esprime maggiore MHC di classe II. Questo metodo consente l'isolamento affidabile delle diverse popolazioni inerente allo sviluppo distinte nei numeri sufficiente per una varietà di analisi funzionale e sviluppo. Evidenziamo una tale lettura funzionale, le risposte differenziali di questi tipi di cellule alla stimolazione con Pathogen-Associated Molecular Patterns (PAMPs).
Introduction
Coltura delle cellule del midollo osseo murino con la citochina fattore stimolante della Colonia del Granulocyte-macrofago (GM-CSF) è ampiamente usato come un metodo per generare cellule dentritiche monocito-derivate (moDC; anche conosciuto come infiammatorie DC) in gran numero 1, 2,3,4,5. Queste cellule sono stati estremamente utili in una varietà di studi di cellule dendritiche (DC) funzione 6,7,8. In genere, queste cellule del midollo osseo murino sono coltivate per 6-8 giorni e vengono quindi utilizzate per lo studio di cellule dendritiche funzione 5. Queste culture erano stato a lungo considerate per lo più omogenee, costituito da una maggioranza di moDC differenziato. Più recentemente, è diventato chiaro che alla fine di questo periodo di cultura di 6 – 8 giorni, ci sono infatti molti moDC, come pure un grande sottoinsieme di macrofagi monocito-derivati differenziati (moMacs) 9,10,11. Nostri studi hanno esteso ulteriormente questi risultati dimostrando che altri sottoinsiemi di meno cellule sviluppate, quali precursori moDC (moDP) e monociti, rimangono nelle culture a bassa frequenza anche dopo 7 giorni 10. Così, gli studi di funzione di cellule dendritiche (DC) utilizzando le cellule generate da questo sistema potrebbero riflettere le risposte di una coorte più ampia di tipi di cellule che precedentemente apprezzato.
Abbiamo imparato molto dallo studio di GM-CSF-generato moDC relativa alla funzione di queste cellule nelle fasi finali di differenziazione 12,13,14. Tuttavia, ci rendiamo conto significativamente meno circa la via dello sviluppo di queste cellule 2,15,16 e di come e quando essi presentano specifiche funzioni come: la risposta di Pathogen Associated Molecular Modelli (PAMPs), fagocitosi, antigene elaborazione e presentazione 13e attività anti-batterica. Un protocollo per l'isolamento di un gran numero di convenzionali basate su Flt3L DC progenitori e precursori è stato segnalato 17. Isolamento di queste popolazioni distinte è stata ottenuta utilizzando carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)-macchiato le cellule del midollo osseo (per tenere traccia di divisione delle cellule) e la cultura in Flt3L per 3 giorni. Le cellule erano quindi impoverite di cellule positive linage e ordinate in popolazioni progenitore e precursore basati su CD11c espressione 17. Un altro approccio di gruppo di vittoria per identificare i primi progenitori di DC in GM-CSF-driven cultura doveva ordinare celle basate su CD31 e Ly6C 18. L'obiettivo iniziale era quello di creare un metodo simile per l'ottenimento dei progenitori e precursori di GM-CSF-driven moDC. A causa dei tipi cellulari specifici generati da GM-CSF, abbiamo adattato l'approccio e l'ordinamento di strategia basata sull'espressione di molecole che sono state espresse alle fasi iniziali e successive di sviluppo. Abbiamo determinato in ultima analisi, che Ly6C, CD115 (recettore CSF-1), e CD11c erano i migliori marcatori per distinguere queste cellule tipi 10.
Qui, presentiamo un metodo per l'isolamento delle cellule alle diverse fasi di sviluppo lungo la via della differenziazione guidato da GM-CSF: monocito progenitore mieloide comune (CMP), progenitore del Granulocyte-macrofago (GMP), dei macrofagi monocito-derivati (MoMac) e monocito-derivate DC (MoDC). La popolazione di moMac possa essere ulteriormente suddivise basata sul livello di MHC classe espressione II, rivelando un moDC precursore della popolazione (moDP) 10. Utilizziamo una cella ad alta velocità di fluorescenza-attivato l'ordinamento di strategia (FACS) per isolare questi 5 popolazioni basate sull'espressione di Ly6C e CD115 CD11c. Dimostriamo quindi l'esame di queste cellule in saggi funzionali, rivelando le loro risposte alla stimolazione di PAMP.
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Protocol
Tutto il lavoro animale è stato approvato dal comitato di uso e Auburn University istituzionale Animal Care in conformità con le raccomandazioni descritte nella Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health.
1. preparazione per la raccolta del midollo osseo
- Preparare il supporto completo di 250 mL aggiungendo una soluzione di medium di Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 supplementato con 10% siero fetale del vitello, la glutamina 2mm e 50 µM 2-mercaptoetanolo alla parte superiore di un'unità di boccetta di 0,22 µm filtro del vuoto e applicare il vuoto.
Nota: Terreno completo possa essere memorizzato a 4 ° C fino a 2 mesi. - Preparare soluzione di etanolo 70% con 350 mL di etanolo al 100% con 150 mL sterile H2O in una beuta da 500 mL.
- Set centrifuga a 4 ° C.
- Sterilizzare pinze, bisturi e forbici in etanolo al 70%.
- Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 5 mL di multimediale completo a tre piastre di Petri da 60 mm.
- Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 30 mL di multimediale completo di una provetta conica da 50 mL.
2. raccolta di cellule del midollo osseo murino
- Eutanasia un mouse C57BL/6 di CO2 narcosi secondo le regole stabilite dalle linee guida della associazione medica veterinaria americana (AVMA) del 2013 sull'eutanasia.
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Rimuovere e zampe posteriori della striscia.
- Saturare le zampe posteriori e il torso con etanolo al 75% e fare tagli poco profondi attraverso la pelle intorno all'articolazione dell'anca con le forbici curve del tessuto. Usando il forcipe, tirare con forza la pelle dal fianco verso il basso verso la caviglia, rivelando il muscolo. Usare le forbici per rimuovere il lembo di pelle.
- Rimuovere il piedino posteriore intero tagliando attraverso l'osso appena sopra il femore/anca.
Nota: Oltre alla sterilizzazione della zona, l'etanolo sarà di aiuto nel fornire tagli puliti e impedire che capelli contaminare i campioni. - Se le gambe saranno trasferite in una nuova posizione per la raccolta del midollo osseo, immergere le gambe in completa per i media.
- Lavorando in una cappa di biosicurezza sterile, trasferire le gambe a uno dei piatti Petri precedentemente preparato.
- Usare le forbici per tagliare appena sotto la caviglia e attentamente rimuovere tanto del tessuto connettivo del muscolo ed elastico come possibile. Trasferire l'osso pulito di Petri preparate secondo.
Nota: Anche se non è necessario rimuovere tutti i muscoli, troppo tessuto rimanente può rendere difficile scovare il midollo osseo. -
Separare il femore, ginocchio e tibia.
- Usando il forcipe, tenere la gamba al ginocchio e individuare il midollo.
Nota: il midollo osseo dovrebbe essere visibile come una sottile linea rossa all'interno della cavità dell'osso nella parte superiore del femore e verso la fine della tibia.- Utilizzando le forbici, fare tre tagli come segue.
- Tagliare la tibia appena sopra dove il midollo viene visualizzata alla fine.
- Tagliare appena sotto l'articolazione del ginocchio.
- Taglio appena sopra l'articolazione del ginocchio.
- Nel caso in cui l'articolazione dell'anca è ancora collegato al femore, tagliare appena sotto l'articolazione dell'anca.
- Tornare i tre frammenti di Petri e ripetere questa procedura su altro braccio.
- Utilizzando le forbici, fare tre tagli come segue.
- Usando il forcipe, tenere la gamba al ginocchio e individuare il midollo.
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A livello del midollo osseo dal femore e la tibia.
- Riempire una siringa da 10 mL con completo supporto dalla provetta conica da 50 mL e tappo con ago 23G.
- Tenendo l'osso con forcipe sopra il terzo piatto di Petri preparato, inserire l'ago nel canale osseo e spingere media attraverso, vampate di calore fuori le cellule (che possono emergere come una "spina" intatta o come diversi cluster). Ripetere fino a quando nessun altro colore può essere visto attraverso l'osso. Riempire la siringa con media come necessario.
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Schiacciare l'epifisi.
- Mentre ancora la seconda capsula di Petri, tenere saldamente la protezione del ginocchio con il forcipe in poltiglia le ginocchia con la punta della siringa. Continuare fino a quando l'epifisi non sono più rosso.
- Usando la siringa, trasferire le cellule da di Petri seconda e la terza per il tubo da 50 mL. Rottura a ciuffi pipettando delicatamente su e giù. Cercate di non generare bolle. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
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Lisare cellule rosse del sangue
- Rimuovere il surnatante con una pipetta sierologica, sloggiare pellet scorrendo e lisare cellule di anima rosse incubando in 1 mL di tampone di lisi ACK (ammonio-cloruro-potassio) per 1 min a temperatura ambiente.
- Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 40 mL di tampone HBSS (soluzione salina bilanciata Hanks).
- Utilizzando una pipetta sierologica, filtrare le cellule anche se un colino di cella 70 µm in una nuova provetta conica 50 mL. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
- Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il surnatante e lavare le cellule con 40 mL di completa per i media. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
Nota: In questa fase, linfociti positivi lignaggio possono essere rimosso da FACS o purificazione colonna magnetica. Tuttavia, i linfociti non vengono mantenuti a lungo termine nella cultura. Anche se un gran numero di cellule positive lignaggio è presente nella Ly6C-CD115-popolazione in midollo osseo ex vivo, quasi tutti sono assenti dal giorno 5 (Figura 2). - Utilizzando una pipetta sierologica, rimuovere il supernatante e coltura di cellule del midollo osseo in multimediale completo con 10 ng/mL del mouse ricombinante GM-CSF ad una densità di 1 x 106 cellule/mL.
Nota: In genere, 4 x 107 cellule totali possono essere raccolto dopo la lisi delle cellule di anima rosse. Tuttavia, si aspettano appena 2 x 107 per i principianti e fino a 5 x 107 cellule per Mietitrebbie per esperti. - Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire le cellule alle piastre di coltura del tessuto e incubare a 37 ° C in 5% CO2. Se utilizzando una piastra a 24 pozzetti, sementi ogni bene con 2 mL di sospensione cellulare.
- Ogni 48 h, utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere la metà dei media e sostituire con fresco multimediale completo e GM-CSF.
Nota: Le culture possono essere conservate fino a 9 giorni. Tuttavia, la composizione cambia nel tempo. Per ulteriori informazioni, vedere la sezione 3.
3. scegliere il giorno di sorta
- Composizioni di popolazione delle cellule variano nel tempo, selezionare un giorno che produce il maggior numero di celle desiderate.
- Vedi tabella 1 per l'ordinamento di post di rendimento cella prevista per ciascuna delle popolazioni dopo 3, 5 e 7 giorni di cultura in GM-CSF per 1 x 107 cellule.
4. strategia di colorazione
- Utilizzare piccole aliquote di cellule per preparare campioni di controllo. Includere un controllo non macchia, campioni di controllo di compensazione macchiati con un solo anticorpo fluorescente ciascuno, e fluorescenza-minus-one controlla in quali tutti gli anticorpi vengono aggiunti tranne uno, al controllo per fluorescenza aspecifica in quel canale. Se usando etichettatura indiretta, includono primaria secondaria da solo, da solo e sia primario e secondario.
Nota: Ficoeritrina (PE) e gli anticorpi allophycocyanin (APC) etichettate forniscono distinta separazione con spurgo minimo sopra quando utilizzati insieme. Tuttavia, se fluorocromo opzioni sono limitate, CD115 è espresso ad un livello relativamente basso, mentre Ly6C è espressa a livelli molto elevati. Pertanto, più luminosi fluorocromi sono desiderabili per anti-CD115 e anti-Ly6C fluorocromi sono scelti per evitare sanguinare sopra. - Preparare 100 mL di FACS Wash Buffer (FWB) mescolando 97 mL di soluzione fisiologica tamponata con fosfato di Dulbecco refrigerati (DPBS) con 3 mL di siero fetale di vitello in una provetta conica da 50 mL e mettere in un bagno di ghiaccio.
- Utilizzare una pipetta per delicatamente, ma a fondo, pipettare cellule su e giù per rimuovere eventuali cellule senza bloccare aderenti.
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Utilizzando una pipetta sierologica, trasferire le cellule in una provetta conica da 50 mL. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
- Se il volume delle cellule supera i 50 mL, trasferire cellule il numero necessario di provette e combinare nella fase di colorazione.
- Delicatamente versare il sovranatante e lavare le cellule pellettate aggiungere 30 mL di FWB con una pipetta sierologica. Centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min e ripetere il lavaggio.
Nota: Se si prevede che la morte delle cellule di alta, le cellule possono essere lavate con FWB con à partir de 0,5% siero fetale di vitello (FCS). Ciò impedirà di agglutinamento delle cellule. -
Sospendere e macchia cellule per le istruzioni del produttore dell'anticorpo.
- Sospendere 5 x 107 cellule in 1 mL di FWB e aggiungere 2 µ g di anti-Ly6C e anti-CD115 etichettati con fluorofori (a scelta del ricercatore). Per distinguere ulteriormente CMP da moDC (entrambi sono Ly6C - e CD115-), aggiungere 2 µ g di anticorpi anti-CD11c (CMP sono CD11c-; moDC sono CD11c+). Incubare per 30 min in ghiaccio.
Nota: Nella figura 3 è stato generato utilizzando Ly6C-PE e CD115-APC.
- Sospendere 5 x 107 cellule in 1 mL di FWB e aggiungere 2 µ g di anti-Ly6C e anti-CD115 etichettati con fluorofori (a scelta del ricercatore). Per distinguere ulteriormente CMP da moDC (entrambi sono Ly6C - e CD115-), aggiungere 2 µ g di anticorpi anti-CD11c (CMP sono CD11c-; moDC sono CD11c+). Incubare per 30 min in ghiaccio.
- Utilizzando una pipetta sierologica, aggiungere 10 mL di FWB e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
- Delicatamente versare il sovranatante e lavare le cellule pellettate aggiungere 30 mL di FWB con una pipetta sierologica. Centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min e ripetere il lavaggio.
- Prima di sospendere le cellule, scatti la provetta accuratamente per sloggiare il pellet. Utilizzare una pipetta sierologica per sospendere le cellule a 1 x 107 cellule/mL di FWB e filtrare su filtro cella 35-µm. Utilizzare una pipetta sierologica per trasferire filtrate cellule in provetta in polipropilene e metterli su ghiaccio fino al momento di ordinare.
Nota: Se non è disponibile in polipropilene, provette di polistirene di proteina rivestita (latte in polvere senza grassi o FCS) possono essere usati per ridurre associazione.
5. impostare porte sulla base di campioni di controllo
Nota: Per evitare la rottura delle cellule a causa della pressione del flusso flusso ad alta velocità, utilizzare un ugello di 100 – 130 µm per l'ordinamento delle cellule.
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Eseguire il controllo senza macchia (Vedi punto 4.1) attraverso il classificatore celle e applicare un cancello per escludere piccoli detriti (minore dispersione avanti; FSC) e altamente granulare (dispersione di high-side; Particelle SSC).
- Per analizzare solo gli stadi (monociti, moMac/MoDP e MoDC), applicare gating per includere solo le più grandi cellule (alta FSC).
- Se vengono utilizzate attuabilità macchie, utilizzare questi per escludere eventi macchiati, non vitali (un esempio è illustrato nella Figura 1).
- Eseguire gli esempi di singolo controllo fluorescente attraverso il classificatore celle e regolare la compensazione come necessario.
- Eseguire un campione del campione multi-etichettati. Osservare quattro popolazioni distinte: Ly6C + CD115-(GMP), Ly6C + CD115 + (monociti), Ly6C-CD115 + (moMacs/moDP) e Ly6C-CD115 - (CMPs/MoDC). Applicare un cancello per isolare ciascuna delle quattro principali popolazioni.
Nota: CMPs e moDC condividono il Ly6C-CD115-fenotipo. Tuttavia, possono essere differenziati basato sull'espressione di CD11c: CMP mancanza CD11c, mentre MoDC esprimono CD11c.
6. raccolta di popolazioni isolate
- Preparare le provette di raccolta aggiungendo abbastanza FCS per raggiungere almeno il 20% concentrazione finale quando è pieno. Ad esempio, se utilizzando provette da 5 mL, aggiungere 1 mL di FCS prima dell'ordinamento e rimuovere il tubo quando raggiunge 5 mL di volume totale.
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Per evitare l'assorbimento di fatturato e dell'anticorpo di membrana, è possibile mantenere tutti i campioni (misto e ordinati) a 4 ° C in tutta la specie.
- Se questo non è possibile, mantenere la provetta contenente le cellule per essere ordinato su ghiaccio per quanto possibile e trasferire il sorter aliquote secondo le necessità.
- Inoltre, campioni di trasferimento ordinato per ghiaccio ogni 20 – 30 min.
- Dopo il numero desiderato di cellule è state raccolte, è possibile utilizzare una pipetta sierologica per trasferire le cellule ad un nuovo tubo conico. Centrifuga a 250 x g a 4 ° C per 10 min.
- Confermare la purezza con analisi post-ordinamento su piccole aliquote da ogni popolazione raccolti.
- Eliminare il surnatante, sospendere in 10 mL di FWB e centrifugare a 250 x g a 4 ° C per 10 min. Ripetere per un totale di due lavaggi.
Nota: Può essere difficile da rimuovere tutto il supernatante senza sloggiare il pellet. Allegando un puntale una linea del vuoto può aiutare con la rimozione. Se questo non è disponibile, è suggerito che il surnatante raccolti in una nuova provetta in caso di dissociazione di pellet. - Rimuovere il supernatante dopo il secondo lavaggio.
- Se il disegno sperimentale dell'utente detta nuovamente le cellule coltivate, passaggi 2.12 – 2,14. In caso contrario, se le cellule verranno utilizzate per l'analisi immediata, preparare cellule secondo protocollo desiderato.
Nota: Un esempio di analisi funzionale tipica è incluso nella Figura 4.
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Representative Results
Nel tentativo di mantenere il numero di canali disponibili per l'analisi come possibile, celle possibili sono stati selezionati ordinariamente basato su dispersione avanti e laterali, escluse eventi molto piccoli e molto granulari (un tipico cancello viene applicato a tutti il punto appezzamenti in Figura 1A). Per determinare se questa strategia di gating escluso in modo affidabile le cellule morte, abbiamo macchiato con 7-Amino actinomicina D (7-AAD) (Figura 1B). 7AAD macchie del DNA in cellule morte e morente a causa della permeabilità della membrana e viene escluso da cellule vitali. Redditività di GM-CSF cellule coltivate del midollo osseo è stata analizzata immediatamente dopo la raccolta (PH) e cellulari Ph. 1, 3 e 5 analizzati immediatamente PH aveva circa il 10% di cellule positive 7-AAD quando un tipico cancello FSC/SSC è stato applicato alle cellule di recente isolate dall'osso midollo osseo (Figura 1, post-raccolta). Una percentuale simile di cellule morte era anche presente al giorno 1 (~ 12%) e 3 (~ 11%) di cultura (Figura 1, giorno 1 PH e 3 giorni PH). Dal giorno 5, il numero di cellule morte all'interno del cancello era ridotto a ~ 5% (Figura 1, 5 giorni PH). Così, usando un cancello di attuabilità è in genere appropriato per l'ordinamento il giorno 5 e dopo. Pertanto, se gli utenti sono limitati nei loro parametri disponibili, FSC/SSC gating è generalmente appropriato. Tuttavia, per i test più sensibili (in particolare se si basano su numeri precisi delle cellule), incorporare una macchia di redditività (suggerimento).
Molti protocolli per la propagazione delle cellule dendritiche consiglia di deplezione di cellule positive di lignaggio, soprattutto linfociti, dal midollo osseo prima cultura 11,17. Questa procedura è pensata per aumentare la purezza delle cellule recuperato su differenziazione di GM-CSF-mediata. In genere, le cellule che esprimono i marcatori delle cellule T (CD3), cellule di B (CD45R o CD19) e cellule NK (NK1.1) potrebbero essere esaurite di selezione positiva utilizzando biglie magnetiche o cella ordinamento 11,17,18. Tuttavia, basato sul sistema di coltura, i linfociti erano raramente recuperati o rilevati in queste analisi. Così, abbiamo cercato di valutare la longevità dei linfociti mantenuto nella Ly6C-CD115-popolazione fra le cellule di GM-CSF-guidato (Figura 2A). GM-CSF coltivate del midollo osseo, cellule (che non erano stato il lignaggio impoverito) sono state macchiate con anticorpi anti-CD3, CD45R e NK1.1 (nel fluoroforo stesso) e misurata ogni giorno da citometria a flusso (Figura 2B). All'interno della Ly6C-CD115-popolazione, cellule positive CD3/CD45R persistito fortemente attraverso giorni 0 – 3 (Figura 2B). Il giorno 4, è rimasto solo poche cellule CD3/CD45R positive e di giorno 5 e 6, non c'erano nessun CD3/CD45R che esprimono le cellule presenti. Così, entro 4 giorni di cultura in GM-CSF, le cellule positive di lignaggio erano essenzialmente assenti e non sono state rilevate affatto ai giorni 5 e 6 della cultura.
La composizione della coltura delle cellule di GM-CSF-driven cambia giornalmente in questo sistema, come le cellule di sviluppano e di differenziano (tabella 1; Figura 3). Intervalli di tempo iniziale, le cellule più abbondanti sono i progenitori e precursori e a più tardi volte la maggior parte delle cellule sono più differenziati 10. Per determinare come l'ordinamento in diversi giorni della cultura potrebbe influenzare il successivo percorso inerente allo sviluppo o cinetica, i tipi sono stati effettuati 3, 5 e 7 giorni PH (Figura 3A). Lo sviluppo della popolazione MoMac (Ly6C-CD115 +) è stato quindi registrato sopra 2 – 3 giorni ulteriore nella cultura (Figura 3B-3D).
Quando ordinato 3 giorni PH, solo il 40% di Ly6C-CD115 + cellule erano diminuito CD115 espressione all'interno di post-ordinamento 24h (PS) (Figura 3B). Da 48 h PS, la frazione che aveva giù-regolato CD115 era 66% e di 72 h, 70% delle cellule ha avuto questo fenotipo. Questa composizione fenotipica è stata mantenuta (~ 70-72% Ly6C - CD115-) anche dopo ulteriori giorni di cultura (dati non mostrati). Quando ordinato 5 giorni PH, ~ 75% delle cellule sono stati Ly6C - CD115-, avendo CD115 rapidamente giù-regolato entro 24h PS e ~ 80% erano CD115 - dopo solo 48 h. Questa distribuzione è stata mantenuta dopo 72 h (Figura 3). Infine, quando ordinato 7 giorni PH, down-regulation di CD115 era anche abbastanza rapida. Entro 24 h PS, ~ 75% delle cellule ha avuto giù-ha regolato l'espressione CD115, e questa tendenza è stata mantenuta dopo 48 h (Figura 3D). È interessante notare che, quando ordinato al giorno 7, il livello generale di espressione CD115 era più basso sulle cellule all'interno della popolazione CD115 +.
Quindi, questi risultati indicano che la cinetica di sviluppo sono un po ' più lento quando si ordina a un giorno di anticipo, ad esempio giorno 3 ordinati cellule rispetto al più rapido sviluppo e differenziazione osservato dopo l'ordinamento il giorno 5 o 7. Basato su questi risultati, un utente alla ricerca di un numero maggiore di moDC dovrebbe probabilmente sorta il giorno 5 o 7.
La risposta di maturazione delle DC è affermata 6,7,12,14. Quando vengono trattati con una varietà di pattern molecolari associati (PAMPs), DC immature up-regolare l'espressione di MHC, molecole co-stimolatorie e citochine pro-infiammatorie, migliorare la loro capacità d'attivazione delle cellule T 6. Tuttavia, è meno chiaro quando le cellule di sviluppo acquisire la capacità di rispondere alla stimolazione PAMP e quali funzionalità di maturazione delle DC potrebbe esibiscono. Per determinare quale delle popolazioni ordinate risponderebbe agli stimoli di maturazione, è stato curato ogni popolazione poco dopo l'ordinamento con un cocktail di PAMPs compreso Poly sono: C, i lipopolisaccaridi (LPS) e CpG DNA per attivare recettori toll-like (TLR) 3 (TLR3), TLR4 e TLR9, rispettivamente. Le cellule sono state trattate (o non trattate) per 24 h ed espressione di CD86 e MHCII è stata misurata da citometria a flusso (Figura 4A-4B). Inoltre, produzione di IL-12p 40/70 e IL-6 è stata misurata nei surnatanti di matrice di cytokine ELISA (Figura 4-4D).
CMPs e PGM espresso livelli molto bassi di MHC classe II e CD86 in uno stato non stimolato e questi modelli non sono cambiato significativamente dopo l'esposizione al cocktail di PAMPs (Figura 4A e 4B) di espressione. Allo stesso modo, l'espressione di MHC di classe II di monociti era anche bassa e poco cambiati sopra l'esposizione PAMP (Figura 4A). Tuttavia, l'espressione di CD86 era moderata sui monociti 24 h dopo l'ordinamento, e ha aumentato ulteriormente dopo stimolazione h 24. Più alta espressione basale di MHC classe II e CD86 nel MoMacs e MoDC è stata osservata, ed entrambe le popolazioni hanno esibito una forte induzione di queste molecole attraverso la stimolazione di PAMP. In termini di espressione di MHC classe II dopo stimolazione, non c'era differenza statistica tra la CMPs, GMPs e monociti, mentre il MoMacs e MoDC formavano un gruppo distinto. Eppure, in termini di espressione CD86, le cellule CMPs e PGM erano statisticamente diverse da MoMacs e MoDC. Tuttavia, i monociti non erano diversi da MoMacs o MoDC.
Successivamente, abbiamo voluto valutare la relativa capacità di ciascuna delle cinque popolazioni di produrre citochine in risposta alla stimolazione dei TLR. Così, abbiamo effettuato un'analisi di cytokine sulle popolazioni ordinate dopo coltura in presenza o in assenza dell'agonista TLR cocktail usato sopra. Le cellule sono state coltivate con gli stimoli per 24 h, quindi i surnatanti sono stati raccolti. Abbiamo osservato molto poco IL - 12 p 40/70 o produzione di IL-6 da CMPs alla stimolazione dei TLR (Figura 4-4D). La seconda popolazione, PGM, era in grado di produrre IL-12p 40/70 (Figura 4), ma queste cellule prodotte una bassa quantità di IL-6, su stimolo di PAMPs (Figura 4). I più alti livelli di produzione di citochina sono stati osservati in tre popolazioni di quest'ultime. Monociti e MoMacs aveva molto simili modelli e grandezze della produzione di citochine. Sia notevolmente aumentato IL - 12 p 40/70 e modestamente aumentata produzione di IL-6 a stimolazione (Figura 4-4D). È interessante notare che, in presenza di MoDC PAMPs non aumenta la secrezione di IL-12p 40/70; Tuttavia, questa popolazione notevolmente aumentata produzione di IL-6 (Figura 4-4D). Questi risultati indicano che le popolazioni ordinate mantenuto loro funzioni immunologiche dopo l'isolamento.
Figura 1: cellule vitali in avanti rispetto al cancello Side Scatter. Midollo osseo del topo è stato coltivato in GM-CSF e redditività è stata misurata utilizzando 7-AAD (7-ammino-actinomicina D) colorazione post-raccolta (PH) e 1, 3 e 5 giorni dopo la raccolta. Cellule vitali (A) sono state selezionate applicando un cancello (vitali) che omesso altamente granulari e piccoli eventi basati su FSC e SSC. (B) gli istogrammi di macchiatura 7-AAD generati da eventi all'interno del cancello di vitali (FSC/SSC). Eventi positivi per 7-AAD indicano le cellule che subiscono gli apoptosi. Le frecce indicano cellule vitali gating. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: linfociti all'interno della popolazione-CD115-Ly6C. Midollo osseo del topo è stato coltivato in GM-CSF e marcatori dei linfociti (CD3, CD145R e NK1.1) sono stati analizzati tutti i giorni tramite flusso cytometry. (A) cella erano macchiati con Ly6C-PE e CD115-APC per identificare cellule-CD115-Ly6C. Cancello del quadrante è stata applicata basata su controlli di singolo-colore. Trama di dot PseudoColor generato dal giorno 0 (B) CD3, CD45R e NK1.1 l'espressione di Ly6C-CD115-cellule è stato analizzato il giorno di raccolta (giorno 0) fino al giorno 6. I conteggi delle cellule sono stati normalizzati alla modalità utilizzando un software di analisi di citometria a flusso. Freccia indica Ly6C-CD115 - gating. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: cinetica di sviluppo del Ly6C-CD115 + cellule dopo la cernita in giorni diversi. Mouse (A) del midollo osseo è stato raccolto e coltivato in GM-CSF. Le aliquote di 1 x 107 cellule sono state raccolte (B) 3, (C), 5, o (D) 7 giorni dopo la raccolta (PH). Nei giorni indicati PH, Ly6C-CD115 + cellule sono state ordinate da coltura mista (pre-ordinamento) e analizzate immediatamente post-ordinamento (PS). Ordinato le cellule erano ri-colture in GM-CSF e cambiamenti nell'espressione Ly6C/CD115 sono stati analizzati tutti i giorni tramite flusso cytometry. Casella e freccia indicano ordinamento cancello. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: espressione di citochine e di maturazione dopo stimolazione dei TLR. Le cellule sono state ordinate in 5 popolazioni il giorno 3 di cultura in GM-CSF. Venivano poi trattati con un cocktail di PAMPs (LPS, Poly sono: C e CpG DNA) per 24 h. dire intensità di fluorescenza (MFI) di (A) MHC di classe II e CD86 (B) è stata analizzata immediatamente post-ordinamento (PS) e 24 h con e senza PAMPs da citometria a flusso. Barre di errore rappresentano la deviazione standard di 3-5 replicati esperimenti. (C) IL - 12 p 40/70 e (D) IL-6 in surnatanti da 3 campioni riuniti sono stati misurati dalla macchia di cytokine matrice dot ELISA dopo 24 h con e senza PAMPs. RLU; Unità relative di luce; -/ + indicano la presenza dell'indicatore della superficie delle cellule per la popolazione designata. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| 3 ° giorno | Giorno 5 | Giorno 7 | |||||
| Fenotipo | Tipo di cella | Min | Max | Min | Max | Min | Max |
| Ly6C-CD115-CD11c - | CMP | 3 x 106 | 4 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115- | GMP | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | N/a | N/a |
| Ly6C + CD115 + | Mono | 2 x 106 | 3 x 106 | 2 x 106 | 3 x 106 | 5 x 105 | 1 x 106 |
| Ly6C-CD115 + | MoMac | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
| Ly6C-CD115-CD11c + | MoDC | N/a | N/a | 5 x 105 | 1 x 106 | 3 x 106 | 4 x 106 |
Tabella 1: Previsto un numero minimo e massimo delle cellule recuperate post-ordinamento per 1 x 107 cellule. CMP (progenitore mieloide comune); GMP (progenitore del granulocita/macrofago) Mono (monociti); MoMac (macrofagi monocito-derivati); MoDC (cellule dendritiche monocito-derivato); N/a (non disponibile); Min (minimo cella resa fuori da 1 x 107 cellule); Max (massima della cella resa fuori da 1 x 107 cellule).
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Discussion
Questo protocollo facilita l'isolamento di tipi GM-CSF-driven progenitore e precursore delle cellule in numero sufficiente per diversi tipi di analisi tra cui analisi biochimiche, analisi di funzione cellulare in vitroo in vivodi instillazione. Questo metodo rappresenta un significativo passo avanti nel campo dello sviluppo delle cellule dendritiche monocito-derivate, consentendo l'affidabile isolamento e identificazione di cellule presto in questa via di sviluppo, come pure quei tipi di cellula differenziata più comunemente isolato in studi precedenti.
Precedenti protocolli per l'isolamento dei progenitori e precursori generati dal midollo osseo in vitro hanno fatto affidamento sulla CFSE-macchiatura per identificare di cellule progenitrici proliferativa 17 o sulla macchiatura con CD31 e Ly6C come marcatori di cellule mieloidi 18 . Il CFSE protocollo descritto da Naik di colorazione è stato progettato per l'uso nella generazione di DC Flt3L-driven progenitori e precursori 17. Quando abbiamo tentato di questo approccio nel sistema cultura GM-CSF, abbiamo incontrato due problemi principali. Il CFSE era un po ' citotossico per le cellule in via di sviluppo ed era così luminosa (anche nelle celle divise) che ha reso difficile la compensazione. Questo approccio si è rivelato per essere inadatto per i nostri obiettivi di isolamento dei primi tipi di cellule (progenitori), così come le cellule attraverso lo spettro inerente allo sviluppo, da altamente proliferative (CMPs/GMP) a altamente sviluppato (MoDC/MoMac). Abbiamo anche provato la strategia di ordinamento per le celle di GM-CSF-driven descritto dal gruppo di vittoria che si basava su CD31 e Ly6C 18. Tuttavia, abbiamo trovato che CD31 era problematico. Si è espressa a livelli molto bassi (rendendo difficile risolvere le popolazioni per l'ordinamento pulito) da un infinitamente piccolo sottoinsieme delle cellule e solo molto presto durante il periodo di coltura. Infatti, CD31 espressione non era rilevabile passato giorno 2 della cultura in GM-CSF 10.
Ly6C, tuttavia, era una molecola molto utile per la separazione di cellule a diversi stadi di sviluppo dovuto il relativo modello transitoria di espressione 10. L'aggiunta di CD115 permesso di discernere più strettamente le cellule intermedie e successive fasi di sviluppo che non era possibile con CD31. Inoltre abbiamo esaminato altri marcatori dei progenitori come CD34 e CD117 nella speranza di isolare un numero elevato di queste cellule iniziali 10. Tuttavia, a differenza di quello segnalato nel sistema Flt3L, abbiamo trovato CD34 e CD117 sono stati espressi anche su un piccolo sottoinsieme delle cellule che erano praticamente assenti dal giorno 3 di cultura 17. Questi marcatori di cellule staminali possono essere utili negli studi futuri, tuttavia, distinguere sottoinsiemi nell'ambito delle popolazioni CMP o GMP.
Ci sono diverse potenziali modifiche al protocollo che possono influenzare la resa delle popolazioni di cella desiderata. In primo luogo, l'utente può scegliere di applicare una macchia di attuabilità per escludere eventuali cellule morte. Basato sulle osservazioni, il tasso di cellule morte all'interno di un tipico avanti e cancello di dispersione laterale sono relativamente basso in generale e pongono problemi solo durante i primi giorni di cultura, coincida con le diminuzioni nei linfociti positivi lignaggio. Tuttavia, per applicazioni in cui la cellula numeri devono essere precisi, una macchia di attuabilità assicurerà l'esclusione delle cellule morte.
Una seconda modifica potenziale è deplezione selettiva dei linfociti di lignaggio-positivi prima della coltura. Abbiamo provato questo approccio per affrontare la piccola popolazione di cellule positive lignaggio che regolarmente sono stati osservati all'interno della popolazione Ly6C-CD115-cellula. La resa delle cellule è stato leggermente inferiore a giorni 5 e 6, e la purezza non era significativamente più alti (dati non mostrati). Così, la purezza non giustificava la resa. Allo stesso modo, se l'utente intende ordinare il giorno 5 o dopo, la frequenza dei linfociti all'interno della cultura è ben di sotto di 1% e non dovrebbe costituire un problema.
Infine, poiché questa strategia è progettata per isolare le cellule attraverso un ampio spettro di inerente allo sviluppo l'utente dovrebbero adeguare i tempi della loro specie per raccogliere il maggior numero delle popolazioni desiderate come possibile. Questa strategia ordinamento produce fedelmente i tipi di cella indicati indipendentemente dal giorno della cultura in cui le cellule sono ordinate. Ad esempio, cellule con il fenotipo Ly6C + CD115-CD11c-sono fedele al fenotipo di GMP e funzione allo stesso modo se sono ordinati e isolati il giorno 3 o 5 della cultura. Tuttavia, la frequenza di queste cellule è molto maggiore il giorno 3 di 5, quindi se l'obiettivo è l'isolamento di questo tipo di cella, sarebbe consigliabile l'ordinamento il giorno 3. È inoltre notabile che celle ordinate sui progressi di giorno 3 attraverso le successive fasi di sviluppo con la cinetica più lenta rispetto se essi sono stati ordinati il giorno 5 o 7 (Figura 3).
Mentre questo metodo permette la chiara distinzione e l'isolamento di 5 – 6 distinte popolazioni lungo lo spettro inerente allo sviluppo, ci sono probabilmente molte altre popolazioni o fasi di transizione lungo questa via. All'interno di ciascuna delle cinque popolazioni descritte ci possono essere diverse sottopopolazioni a incrementi leggermente diversi di sviluppo. Ad esempio, abbiamo osservato "distinti" popolazioni con livelli intermedi di CD115 e dei Ly6C che subiscono leggermente differenti modelli di sviluppo, in termini di quanti moMac e moDC sono generati (dati non mostrati). È anche probabile che popolazioni precedentemente osservata in vivo sono presenti nella cultura e sistema di smistamento, ma questi sono stati difficili da identificare a causa della loro frequenza molto bassa. Popolazioni come cMOP 19, MDP 20o CDP 21 sono probabilmente presente, ma possono essere nascosto all'interno di più grandi popolazioni. Futuri studi saranno necessari per chiarire ulteriormente le numerose fasi di sviluppo che possono essere isolate all'interno di questo quadro di smistamento con l'aggiunta di specifici marcatori di differenziazione. Il valore di questa strategia di ordinamento è che permette l'isolamento coerenza di un gran numero di stadi distinti inerente allo sviluppo durante l'ontogenesi di DC.
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Disclosures
Gli autori non hanno nessun conflitto di divulgare.
Acknowledgments
Siamo grati per l'assistenza tecnica da Alison Chiesa uccello alla Auburn University scuola di medicina veterinaria flusso Cytometry Facility, per finanziamenti dal NIH per EHS R15 R15 AI107773 e per il cellulare e il programma di biologia molecolare all'Università di Auburn di estate finanziamento della ricerca di PBR.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI 1640 | Corning | 15-040-CV | |
| Fetal Calf Serum (FCS) | HyClone | SV30014.04 | to supplement complete medium and FWB |
| GlutaMAX | Gibco | 35050 | to supplement complete medium |
| 2-mercaptoethanol (2-ME) | MP Biomedical | 190242 | to supplement complete medium |
| 75 mM Vacuum Filter | Thermo Scientific | 156-4045 | to sterilize complete media |
| ACK Lysis Buffer | Lonza | 10-548E | to lyse red blood cell |
| HBSS buffer | Corning | 21-020-CM | to rescue leukocytes after red blood cell lysis |
| Phosphate Buffered Saline (PBS), Dulbecco's | Lonza | 17-512F | must be endotoxin free; chilled at 4 °C |
| 35 µm Cell filter | Falcon | 352235 | to break apart clumps before running through cytometer. |
| GM-CSF | Biosource | PMC2011 | usable concentration of 10 ng/mL |
| Tissue cultured treated plate | VWR | 10062-896 | for bone marrow cells after harvest |
| Anti-Ly6C, Clone HK1.4 | Biolegend | 128018 | |
| Anti-CD115, Clone AFS98 | Tonbo Bioscience | 20-1152-U100 | |
| Anti-CD11c, Clone HL3 | BD Biosciences | 557400 | to differeniate CMP and MoDCs |
| MoFlo XPD Flow Cytometer | Beckman Coulter | ML99030 | |
| BD Accuri C6 | BD Biosciences | 660517 | |
| 100% Ethanol | Pharmco-Aaper | 111000200CSPP | |
| 60 mm Petri Dish | Corning, Inc | 353002 | |
| 50 mL Conical tube | VWR | 21008-242 | |
| C57BL/6 Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | Female; 10-20 weeks old |
| Biosafety Hood | Thermo Scientific | 8354-30-0011 | |
| 10 mL Syringe | BD Biosciences | 301604 | |
| 23 G needle | BD Biosciences | 305145 | |
| Centrifuge 5810 R | eppendorf | 22625501 | |
| FlowJo Software v10 | BD Biosciences | Version 10 | flowjo.com |
References
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