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Immunology and Infection

एक सरल प्रवाह Cytometry आधारित परख में निर्धारित करने के लिए इन विट्रो एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि डेंगू के वायरस का उपयोग Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम

Published: April 10, 2018 doi: 10.3791/57371
Automatic Translation
1, 1
1Department of Microbiology and Immunology, Uniformed Services University

Summary

हम Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम द्वारा संक्रमण के एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि को मापने के लिए एक सरल और आसान प्रोटोकॉल का वर्णन डेंगू वायरस रिपोर्टर वायरल कणों का उपयोग कर ।

Abstract

संक्रमण के एंटीबॉडी आश्रित बढोतरी को डेंगू वायरल रोगजनन में प्रमुख भूमिका निभाते दिखाया गया है । पारंपरिक परख कि एंटीबॉडी या सीरम की क्षमता को मापने के लिए अनुचित सेल लाइनों में संक्रमण को बढ़ाने के लिए पट्टिका परख के बाद मीडिया में वायरल उत्पादन का उपयोग करने पर भरोसा किया है संक्रमण । हाल ही में, इन परख फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी का उपयोग कर सेल लाइनों में डेंगू वायरस (देंव) संक्रमण की जांच की है । इन दोनों तरीकों सीमाएं है कि इन तकनीकों का व्यापक उपयोग सीमित है । यहां, हम इन विट्रो में एक सरल वर्णन डेंगू वायरस रिपोर्टर वायरल कणों (RVPs) का उपयोग कर कि ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन और K562 कोशिकाओं एक्सप्रेस एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि की जांच करने के लिए (ADE) देंव से प्राप्त किया गया था सीरम का उपयोग संक्रमण रीसस मकाक Zika वायरस (ZIKV) के साथ संक्रमण के बाद 16 सप्ताह. इस तकनीक विश्वसनीय है, कोशिकाओं के ंयूनतम हेरफेर शामिल है, जीना प्रतिकृति सक्षम वायरस का उपयोग शामिल नहीं है, और एक उच्च प्रवाह प्रारूप में किया जा सकता है एक मात्रात्मक readout प्रवाह cytometry का उपयोग कर पाने के लिए । इसके अतिरिक्त, इस परख को आसानी से एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है (ADE) ऐसे पीत ज्वर वायरस (YFV), जापानी घोड़े इन्सेफेलाइटिस वायरस (JEEV), पश्चिम नील नदी वायरस (WNV) आदि जहां RVPs उपलब्ध है के रूप में अंय flavivirus संक्रमण के । ऊपर परख की स्थापना की आसानी, डेटा का विश्लेषण, और परिणाम की व्याख्या यह उच्च सबसे प्रयोगशाला सेटिंग्स के लिए उत्तरदाई बनाता है ।

Introduction

संक्रमण के एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि (ADE) एक प्रक्रिया है जिससे आंशिक रूप से पार प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी वायरस के एक सीरोटाइप द्वारा प्रेरित प्रतिक्रियाओं वायरस के एक अन्य सीरोटाइप के आगे बढ़ाती है, वृद्धि हुई वायरल प्रतिकृति और viremia के लिए अग्रणी. ADE में डेंगू वायरस (देंव) संक्रमण बड़े पैमाने पर प्रलेखित किया गया है जहां चार प्रमुख serotypes प्रचलित हैं । रोगियों के एक सबसेट में, ADE डेंगू रक्तस्रावी बुखार (DHF) के साथ जुड़ा हुआ है । हम हाल ही में दिखाया गया है कि Zika वायरस (ZIKV) संक्रमण देंव पार-प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं के काफी उच्च स्तर प्रेरित है कि ADE के कारण देंव इन विट्रो में और संभावना vivo मेंदेंव viremia की वृद्धि करने के लिए योगदान1 , 2. एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि परख एक महत्वपूर्ण उपकरण के लिए एंटीबॉडी की क्षमता का आकलन करने के लिए संबंधित वायरस के साथ माध्यमिक संक्रमण बढ़ाने और flavivirus संक्रमण के रोगजनन में बहुमूल्य अंतर्दृष्टि प्रदान कर रहे है और सूचित टीकों का विकास ।

यहां वर्णित परख K562 कोशिकाओं है कि आम तौर पर संक्रमण के लिए अनुचित है के साथ साथ देंव RVPs का उपयोग करता है । RVPs संरचनात्मक रूप से बरकरार प्रतिकृति अक्षम देंव वायरल कण है कि एक उप सांकेतिक शब्दों में बदलना-जीनोमिक ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) replicon कि प्रतिकृति के एक दौर के बाद व्यक्त किया जाता है3। जैसे, कोशिकाओं है कि RVPs fluoresce हरी से संक्रमित हो जाते हैं और आसानी से प्रवाह cytometry या माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर पाया जा सकता है. इस परख में प्रयुक्त RVPs वाणिज्यिक स्रोतों से प्राप्त किया गया । वे, तथापि, अंय वायरस के खिलाफ उत्पंन किया जा सकता है और इस पांडुलिपि में वर्णित परख में इस्तेमाल किया । इस बीच, K562 कोशिकाओं एक FcγIII-रिसेप्टर-ल्यूकेमिया कोशिका लाइन कि एंटीबॉडी के एफसी क्षेत्र के लिए बाध्य व्यक्त कर रहे हैं और उप की उपस्थिति में संक्रमित हो जाते हैं-एंटीबॉडी4की सांद्रता बेअसर,5.

ADE परख गंभीर डेंगू के लिए जोखिम वाले कारकों की जांच और के तंत्र चित्रित करने के लिए बड़े पैमाने पर अध्ययन में इस्तेमाल किया गया है इन विट्रो ADE6,7,8. ADE परख यहां वर्णित जल्दी और आसानी से सीरम की क्षमता का निर्धारण करने के लिए इन विट्रो RVPs और प्रवाह cytometry का उपयोग कर संक्रमण में वृद्धि कर सकते हैं, के रूप में अंय परख वर्तमान में इस्तेमाल किया, जो या तो पट्टिका के निर्धारण की आवश्यकता की तुलना में वीरो कोशिकाओं में इकाइयों (pfu) या संक्रमित कोशिकाओं के एंटीबॉडी धुंधला6,7,8,9,10,11, जिनमें से दोनों समय लेने और परिश्रम कर रहे है गहन.

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Protocol

सीरम यहां वर्णित प्रोटोकॉल प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया नमूनों रीसस मकाक से प्राप्त किए गए थे कि और के अनुसार स्थानीय, राज्य और संघीय नीतियों के मूल्यांकन और प्रयोगशाला पशु देखभाल के प्रत्यायन के लिए एक संघ में के साथ देखभाल इंटरनेशनल (AAALAC)-मान्यता प्राप्त सुविधा. सभी पशु प्रयोगों की समीक्षा की और संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और नमूने एक ऊतक साझा प्रोटोकॉल के माध्यम से अधिग्रहीत किया गया ।

1. दिन 1

नोट: में नीचे वर्णित सभी चरणों का प्रदर्शन एक बाँझ लामिना प्रवाह एक बीएसएल प्रयोगशाला में ऊतक संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया सुरक्षा कैबिनेट मंत्रिमंडल.

  1. गल सीरम नमूने कमरे के तापमान पर और प्रत्येक सीरम नमूने के 100 µ एल एक बाँझ ट्यूब के लिए स्थानांतरण. गर्मी में 56 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए निष्क्रिय या तो एक पानी के स्नान या एक तापमान-समायोज्य thermomixer में । बनाने के 10-गुना के सीरियल कमजोर पड़ने सीरम नमूने के 1:1 से लेकर 1:1000 शीत RPMI-10 का उपयोग (RPMI के साथ 10% भ्रूण गोजातीय सीरम).
  2. एक बाँझ 96 अच्छी तरह से वी नीचे थाली के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए प्रश्नपत्र पतला सीरम नमूना के 10 µ एल स्थानांतरण । नियंत्रण कुओं के दो सेट शामिल हैं, केवल और बिना सीरम का नमूना RVPs के साथ RPMI-10, और RPMI-10 केवल RVPs के बिना और सीरम नमूने के बिना. प्रत्येक सीरम नमूना और RPMI-10 नियंत्रण triplicates में सेट करें ।
  3. -80 ° c फ्रीजर से डेंगू-1, 2, 3 और 4 RVPs निकालें और एक 37 ° c पानी स्नान में उन्हें गल । गल RVPs को तुरंत बर्फ में ट्रांसफर कर दें । प्रत्येक सीरम के नमूने के लिए लगभग 170 µ l RVPs प्राप्त करें (10 µ एल के RVPs x 3 कुओं के प्रत्येक सीरम कमजोर पड़ने के लिए (1:1, 1:10, 1:100, 1:1000) और µ के 10 RVPs एल के प्रत्येक RPMI एक्स के लिए 3 वेल्स-10 RVP केवल नियंत्रण कुओं के साथ) ।
  4. पिपेट के 10 µ एल RVPs के प्रत्येक कुआं में 96-well V-नीचे की थाली सीरम नमूना युक्त और RVPs (कोई सीरम) नियंत्रण कुओं के साथ RPMI-10 के लिए । RPMI-10 केवल (कोई सीरम नमूना और कोई RVP) कुओं के लिए RVPs मत जोड़ें । ऊपर और नीचे 5 – 10 बार pipetting करके अच्छी तरह से मिलाएं । प्रत्येक शीत RPMI को RVPs के एवज में 10 µ l cold RPMI-10 जोड़ें-10 केवल (कोई सीरम नमूना और कोई RVP) नियंत्रण कुओं.
  5. एक मशीन के लिए 96-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट स्थानांतरण और 5% CO2की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए थाली मशीन । जबकि 96-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट, मशीन है 70% इथेनॉल के साथ और 15 मिनट के लिए यूवी प्रकाश चलाने के साथ सुरक्षा कैबिनेट की सतह को साफ ।
  6. मशीन से K562 कोशिकाओं की एक पूरी तरह से धाराप्रवाह T75 कुप्पी निकालें, अच्छी तरह से एक बाँझ 5 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर कोशिकाओं को मिला, और एक बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब करने के लिए कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर हस्तांतरण.
    नोट: K562 कोशिकाओं RPMI-10 में बनाए रखा है और 1 x 106/mL. पर उपसंस्कृत
  7. बाँझ 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब से 10 µ एल कोशिकाओं को हटाने और 10 µ एल tryphan नीले रंग के साथ मिश्रण से कोशिकाओं की संख्या की गणना । 15 मिलीलीटर शंकु ट्यूब में कक्षों की कुल संख्या निर्धारित करने के लिए किसी hemocytometer का उपयोग करके कक्षों की गणना करें ।
  8. 15 मिलीलीटर शंकु में कोशिकाओं के साथ 10 मिनट के लिए ~ 1,200 x g केंद्रापसारक, supernatant, और गर्म RPMI में कोशिकाओं को फिर से स्थगित 80,000 कोशिकाओं की एकाग्रता पर-10/मीडिया के 30 µ l (२.६६ x 106 कक्ष/mL) ।
  9. (कदम 1.6), K562 कोशिकाओं के 96-अच्छी तरह से v-नीचे प्लेट के प्रत्येक अच्छी तरह से करने के लिए 30 µ एल हस्तांतरण, और ऊपर और नीचे 5 – 10 बार pipetting द्वारा अच्छी प्रकार से मिश्रण, मशीन से 96-नीचे प्लेट निकालें । एक मशीन के लिए 96-अच्छी तरह से वी नीचे प्लेट स्थानांतरण और 5% CO2की उपस्थिति में 37 डिग्री सेल्सियस पर 1 hr के लिए थाली मशीन ।
  10. 1 एच के लिए मशीन के बाद, 96-मशीन से अच्छी तरह से वी नीचे की थाली को हटा दें और 5 मिनट के लिए ~ 1,200 x g पर केंद्रापसारक । केंद्रापसारक के बाद, प्लेट उल्टा एक 10% ब्लीच युक्त कंटेनर में बदल द्वारा कुओं से मीडिया खिचड़ी भाषा ।
  11. एक अच्छी तरह से उंहें गर्म RPMI के 125 µ एल में reसस्पैंड द्वारा कोशिकाओं-10 धोने, एक पिपेट के साथ अच्छी तरह से मिश्रण है, और 5 मिनट के लिए ~ 1,200 x g पर थाली केंद्रापसारक । प्लेट उल्टा कर 10% ब्लीच युक्त कंटेनर में बंद करके मीडिया को नीचा दिखा । इस वॉश स्टेप को दो बार दोहराएं ।
  12. धोने के बाद, एक अच्छी तरह से गर्म RPMI-10 के 100 µ एल जोड़ने के लिए, ऊपर और नीचे प्लास्टिक के साथ मिश्रण, और 48 के लिए थाली मशीन 37 ° c 5% CO2की उपस्थिति में ।

2. Day 3

  1. 96-well V-नीचे प्लेट से युक्त 100 µ एल कोशिकाओं और मीडिया/साथ ही मशीन से निकालें और यह एक सुरक्षा कैबिनेट के लिए कदम । एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग करना, एक अच्छी तरह से मिश्रण की सामग्री और कोशिकाओं और एक 96 अच्छी तरह से U-नीचे की थाली या पूर्व के लिए मीडिया स्थानांतरण 5 एमएल के ट्यूब लेबल ।
  2. 1% Paraformaldehyde (पीएफए) के 100 µ एल के साथ 96 अच्छी तरह से V-नीचे थाली में प्रत्येक अच्छी तरह से कुल्ला 1x फास्फेट में खारा (पंजाब) और 96 अच्छी तरह से U-नीचे प्लेट में संबंधित कुओं को हस्तांतरण या 5 एमएल के लिए स्थानांतरण-2.1 कदम से एक अंतिम उपज के लिए ट्यूबों 0.5% पीएफए/अच्छी तरह से या ट्यूब की एकाग्रता । मिश्रण अच्छी तरह से एक मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग कर, एल्यूमीनियम पंनी के साथ प्लेट को कवर, और यह 30 मिनट के लिए मशीन में बैठने के लिए कोशिकाओं को ठीक ।
  3. प्रतिदीप्ति सेटिंग्स के साथ साइड और आगे तितर बितर करने के लिए दाग K562 कोशिकाओं को चलाने के द्वारा प्रवाह cytometer (उदाहरण के लिए सामग्री की तालिका देखें) तैयार. केवल प्रतिदीप्ति चैनल आवश्यक FL1 है, के रूप में GFP केवल प्रतिदीप्ति कोशिकाओं से उत्सर्जित है । प्रत्येक नमूने से ~ 30000-50000 कोशिकाओं का अधिग्रहण ।
    नोट: किसी भी प्रवाह cytometer एक एकल प्रतिदीप्ति पढ़ने में सक्षम डेटा प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, RVPs से संक्रमित कोशिकाओं केवल GFP की उपस्थिति के कारण हरी प्रतिदीप्ति उत्सर्जन करेगा, और कोई अन्य प्रतिदीप्ति चैनल की जरूरत है.

3. डेटा विश्लेषण

  1. किसी भी प्रवाह cytometry विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर cytometer प्रवाह पर अधिग्रहीत डेटा का विश्लेषण (सामग्री की तालिका देखें) ।
    1. FSC के आधार पर पहला गेट सेट-एक (फॉरवर्ड तितर-बितर क्षेत्र) बनाम FSC-एच (फॉरवर्ड तितर-बितर-ऊंचाई) एकल कोशिकाओं को शामिल करने और ऑटो-फ्लोरोसेंट दोहरी से12विश्लेषण से बाहर । फिर, गेट स्वेटर-gated कोशिकाओं पर आधारित SSC-a (साइड स्कैटर – क्षेत्र) बनाम FSC-a किसी भी फ्लोरोसेंट मलबे को बाहर करने के लिए.
    2. विश्लेषण ssc-a vs FSC-ssc-a vs GFP-a पर आधारित GFP की अभिव्यक्ति के लिए एक gated कोशिकाएं । सीरम के प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए GFP + कोशिकाओं के प्रतिशत का निर्धारण और GFP + कोशिकाओं के आसपास एक गेट की स्थापना द्वारा नमूनों को नियंत्रित.
  2. प्रत्येक सीरम नमूना कमजोर पड़ने के लिए GFP + कोशिकाओं के औसत प्रतिशत का निर्धारण और तपसिल वेल्स में GFP + कोशिकाओं के कुल प्रतिशत विभाजित करके कुओं को नियंत्रित 3.
  3. RVPs (कोई सीरम नमूना) नियंत्रण कुओं के साथ RPMI-10 में GFP + कोशिकाओं के औसत प्रतिशत से विभाजित प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए सीरम नमूनों में GFP + कोशिकाओं के औसत प्रतिशत विभाजित करके संक्रमण की गुना-वृद्धि की गणना.
  4. ग्राफ गुना वृद्धि (y-अक्ष) बनाम कमजोर पड़ने (x-अक्ष), और सांख्यिकीय विश्लेषण करने के बाद ANOVA का उपयोग कर Tukey के बाद कई तुलना के लिए हॉक परीक्षण ।

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Representative Results

4 रीसस मकाक से सीरा ZIKV के साथ संक्रमण के बाद 16 सप्ताह एकत्र किए गए थे और देंव-1, 2, 3 और K562 कोशिकाओं में 4 संक्रमण को बढ़ाने के लिए अपनी क्षमता के लिए परीक्षण किया । जानवरों के पीक viremia था ~ 1 x 10 की प्रतियां ZIKV आरएनए के 3 दिन तक संक्रमण के बाद कि स्तर है कि संक्रमण के बाद 7 दिनों से पता लगाने की सीमा से नीचे थे करने के लिए मना कर दिया । प्लाज्मा में 16 सप्ताह बाद संक्रमण होने पर कोई viremia नहीं पाया गया । फिर, RVP परख और प्रदर्शन किया था एकत्र डेटा विश्लेषण किया गया, के रूप में उपर्युक्त प्रोटोकॉल में वर्णित है ।

GFP + कक्षों को पहचानने के लिए उपयोग की गई गेटिंग कार्यनीति आरेख 1में दिखाई जाती है । प्रारंभिक गेट को फ्लोरोसेंट दोहरी बाहर सेट और केवल FSC के आधार पर एकल कोशिकाओं को शामिल किया गया-A बनाम FSC-एच । अगले भूखंड एकल सेल गेट से केवल कोशिकाओं को दर्शाता है; वहां, एक गेट एसएससी के आधार पर तैयार किया गया था-a vs FSC-a किसी भी फ्लोरोसेंट मलबे को बाहर करने के लिए । ये gated कोशिकाएँ तब एसएससी-ए vs FL1-ए के आधार पर एक तीसरे भूखंड में GFP + कोशिकाओं की पहचान के लिए प्रदर्शित की गई थीं. RVPs एक्सप्रेस GFP से संक्रमित कोशिकाओं, और GFP + कोशिकाओं का प्रतिशत इन कोशिकाओं के आसपास एक गेट की स्थापना द्वारा निर्धारित किया गया था. लगभग 12.2% GFP + कोशिकाओं के ZIKV संक्रमित सीरम नमूने में detectable हैं, के रूप में कोई GFP + कोशिकाओं की तुलना में नियंत्रण नमूना है । इस गेटिंग रणनीति प्रत्येक सीरम कमजोर पड़ने और नियंत्रण नमूना परख में शामिल के लिए पीछा किया है ।

GFP + कोशिकाओं का प्रतिशत प्रत्येक नमूना कमजोर पड़ने और ऊपर वर्णित के रूप में नियंत्रण नमूना के लिए निर्धारित किया गया था (चित्रा 1) । देंव-1 RVPs का उपयोग कर एक प्रतिनिधि जानवर से डेटा चित्रा 2में दिखाया गया है । के रूप में कोई सीरम नियंत्रण नमूना है कि ०.२५३% GFP + कोशिकाओं था की तुलना में, GFP + कोशिकाओं का प्रतिशत पतला नमूना में २.५८% थे, 1:10 पर 12.8%, ०.७३५% 1:100 पर, और ०.०२२% पर 1:1000 कमजोर पड़ने । सीरम के नमूने में एंटीबॉडी के घटते सांद्रता के कारण पतला है के रूप में GFP + कोशिकाओं का प्रतिशत बदल जाएगा ।

संक्रमण की वृद्धि के रूप में एंटीबॉडी एकाग्रता है कि वायरस की वृद्धि के लिए आदर्श है के साथ जुड़ा हुआ है, हम 1:10 कमजोर पड़ने पर GFP + कोशिकाओं के प्रतिशत में एक नाटकीय वृद्धि के रूप में या तो पतला नमूना या अन्य कमजोर पड़ने की तुलना में मनाया, सुझाव है कि unपतला नमूना 1:100 और 1 जबकि एंटीबॉडी के उच्च सांद्रता था: 1000 कमजोर पड़ने एंटीबॉडी के निचले स्तर कि संक्रमण के ADE प्रेरित करने के लिए पर्याप्त नहीं था । यदि एंटीबॉडी सांद्रता काफी अधिक है, तो सीरम के अतिरिक्त कमजोर पड़ने पर कमजोर पड़ने जो ADE स्पष्ट हो जाता है निर्धारित करने के लिए शामिल किया जाना चाहिए । हम जांच सीरम नमूनों में, हम 1:10 के एक कमजोर पड़ने पर ADE मनाया । दूसरी ओर, ADE कम कमजोर पड़ने पर मनाया जा सकता है अगर सीरम में एंटीबॉडी एकाग्रता काफी अधिक है ।

अगला, हम तपसिल वेल्स में GFP + कोशिकाओं के औसत प्रतिशत GFP + कोशिकाओं के तपसिल कुओं में कोई सीरम नियंत्रण के लिए के साथ प्रत्येक कमजोर पड़ने के लिए के लिए विभाजित करके संक्रमण के गुना-वृद्धि की गणना । देंव-1, 2, 3 और 4 serotypes के खिलाफ ADE के कैनेटीक्स y-अक्ष और x-अक्ष पर सीरम कमजोर पड़ने पर गुना-वृद्धि रेखांकन द्वारा निर्धारित किया गया था (चित्रा 3) । डेटा से पता चलता है कि सीरम पर एकत्र 16 सप्ताह के बाद संक्रमण काफी बढ़ाया देंव द्वारा K562 कोशिकाओं के संक्रमण-1, 2, 3 और 4 serotypes 1:10 के एक कमजोर पड़ने पर.

Figure 1
चित्र 1: प्रवाह cytometry द्वारा प्राप्त करने और विश्लेषण के लिए गेटिंग कार्यनीति. K562 कोशिकाओं देंव RVPs एक्सप्रेस GFP है कि एक प्रवाह cytometer का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था से संक्रमित । (क) कोई सीरम नियंत्रण और (ख) 16 सप्ताह के बाद ZIKV संक्रमित सीरम । कोशिकाओं को पहले gated के आधार पर आगे तितर बितर क्षेत्र (FSC-a) बनाम आगे तितर बितर ऊंचाई (FSH-एच) के लिए एक तरफ तितर बितर (एसएससी-ए) बनाम FSC-एक मलबे को बाहर निकालने के बाद दोहरी बाहर । एसएससी-ए vs FSC-ए gated सेल तब एसएससी-ए vs GFP-ए (ग्रीन प्रतिदीप्ति प्रोटीन-एरिया) पर आधारित gated था । काले आयतों और अंडाकार फाटकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, और फाटकों के ऊपर की संख्या है कि गेट के भीतर गिरने कोशिकाओं का प्रतिशत है । FACS भूखंडों के बीच काले तीर का उपयोग गेट्स के अनुक्रम से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रतिनिधि डॉट भूखंडों देंव RVP + कोशिकाओं की आवृत्ति दिखा. देंव-1 RVPs से संक्रमित K562 कोशिकाओं का प्रतिशत प्रवाह cytometry द्वारा निर्धारित किया गया था । सीरम एक प्रतिनिधि रीसस से एकत्र पर 16 सप्ताह के अंत में समूल संक्रमण देंव-1 RVPs के साथ या तो पतला या एक 1:10, 1:100, और 1:1000 कमजोर पड़ने पर और कोई सीरम नियंत्रण नमूनों की तुलना में मशीन था । सीरम के प्रत्येक एकाग्रता पर GFP + कोशिकाओं का प्रतिशत दिखाया गया है. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: डेंगू की महत्वपूर्ण वृद्धि-1, 2, 3 और 4 संक्रमण के लिए एक 1:10 कमजोर पड़ने पर मनाया जाता है सीरम । 4 देंव serotypes के लिए एक्स-अक्ष पर सीरम कमजोर पड़ने की साजिश रचने और गुना-वृद्धि (कोई सीरम नमूना नियंत्रण के सापेक्ष) y-अक्ष पर एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि डेंगू संक्रमण की जांच की गई थी । सीरा से एकत्र 4 ZIKV प्रतिरक्षा रीसस मकाक 16 सप्ताह में संक्रमण के बाद इस परख में इस्तेमाल किया गया था । त्रुटि पट्टियां मानक त्रुटि दर्शाती है और * का प्रतिनिधित्व करता है p < 0.05 । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Flaviviruses जैसे देंव और ZIKV दोनों अपने संरचनात्मक और गैर संरचनात्मक प्रोटीन है कि एंटीबॉडी कि पार-एक दूसरे के साथ प्रतिक्रिया13,14उत्पंन में समरूपता के महत्वपूर्ण सबूत साझा करें । इन क्रॉस-प्रतिक्रियाशील एंटीबॉडी प्रतिक्रियाओं दोनों vivo में और या तो एक heterologous सीरोटाइप या अन्य संबंधित flaviviruses1,2के साथ इन विट्रो में संक्रमण की वृद्धि करने के लिए दिखाया गया है । क्षमता को बढ़ाने के संक्रमण को पार रोग के प्रबंधन के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है और वैक्सीन के विकास के लिए भी ।

पारंपरिक संस्कृति आधारित परख गैर स्वतंत्र कोशिकाओं है कि सीरम की उपस्थिति में संक्रामक लाइव देंव से संक्रमित हैं का उपयोग करें । संक्रमण की वृद्धि मानक पट्टिका परख11का उपयोग कर supernatant में वायरस की मात्रा को बढ़ाता है द्वारा मापा जाता है । इस परख दो सेल लाइनों में वायरस की संस्कृति की आवश्यकता है और समय की काफी लंबी अवधि के लिए प्रदर्शन की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, नहीं सभी देंव serotypes उसी तरह पट्टिका, इन परख करने के लिए जटिलता का एक और स्तर को जोड़ने ।

अंय परख पट्टिका परख प्रोटोकॉल आधारित संशोधित किया है देंव के लिए intracellular धुंधला के संयोजन से सेल लाइनों के संक्रमण को मापने के लिए फ्लोरोसेंट लेबल एंटीबॉडी और प्रवाह cytometry9,10,14का उपयोग कर । हालांकि इस समय के लिए संक्रमण के स्तर को निर्धारित करने की आवश्यकता के रूप में पट्टिका आधारित परख वहां अनुकूलन इन परख के लिए आवश्यक कदम के एक नंबर के लिए लगातार काम कर रहे है की तुलना में कम कर देता है । Intracellular धुंधला प्रोटोकॉल समय लेने वाले हैं, क्योंकि वे फिक्सिंग और Intracellular धुंधला और अच्छी तरह से titrated देंव विशिष्ट एंटीबॉडी कि स्पष्ट रूप से प्रत्येक सीरोटाइप भेदभाव कर सकते है की आवश्यकता के बाद कोशिकाओं के permeabilizing की आवश्यकता है । इसके अतिरिक्त, इन परख आसानी से एक उच्च प्रवाह प्रारूप के लिए उत्तरदाई नहीं है और अंतर-परख परिवर्तनशीलता के उच्च स्तर से ग्रस्त हैं ।

ऊपर वर्णित परख के विपरीत, देंव RVPs आधारित परख स्थापित करने के लिए आसान है, संक्रामक वायरस का उपयोग नहीं करता है, और उच्च प्रवाह है कि आसानी से सीरम की क्षमता को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता संक्रमण को बढ़ाने के लिए अत्यधिक उत्तरदाई है । इसके अतिरिक्त, इस परख के रूप में अंय परख के रूप में गहन श्रम नहीं है, और 2-3 दिनों के भीतर पूरा किया जा सकता है, जो वर्तमान ADE परख प्रोटोकॉल पर एक प्रमुख लाभ प्रदान करता है । हालांकि जांच पांडुलिपि में वर्णित परख ZIKV संक्रमित सीरम की क्षमता देंव-1, 2, 3 और 4 serotypes के संक्रमण को बढ़ाने के लिए, परख आसानी से दोनों प्रयोगात्मक और नैदानिक अंय से प्राप्त नमूनों से सीरम की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता flavivirus संक्रमण जैसे पीत ज्वर वायरस (YFV), जापानी घोड़े का इन्सेफेलाइटिस वायरस (JEEV), और पश्चिम नील नदी वायरस (WNV) यदि RVPs उपलब्ध हैं, और अंय सेल लाइनों के साथ । यह है, तथापि, RVP की मात्रा, कोशिकाओं की संख्या/अच्छी तरह से titrating द्वारा परख का अनुकूलन करने के लिए महत्वपूर्ण है, और मशीन की अवधि पृष्ठभूमि धुंधला के बिना कोशिकाओं के इष्टतम धुंधला अनुमति देने के लिए ।

Titrations लक्ष्य कोशिकाओं की एक निर्धारित संख्या की मशीन द्वारा प्रदर्शन किया जाना चाहिए (उदाहरण के लिए, 80,000 K562 कोशिकाओं या एक सेल लाइन का परीक्षण किया जा रहा) RVPs के चर संस्करणों के साथ (उदाहरण के लिए, 2.5 µ एल, 5 µ एल, 7.5 µ एल, 10 µ एल, 20 µ एल, आदि). एक बार एक RVPs के लिए सही titer प्राप्त की है, गर्मी की अवधि के कोशिकाओं की परिभाषित संख्या के साथ प्राप्त titer का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है और उंहें मशीन के रूप में समय की चर अवधि के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित (उदाहरण के लिए, 24 ज, 48 ज , 72 ज, आदि।

हम 1:10 के एक कमजोर पड़ने पर देंव के सभी 4 serotypes द्वारा संक्रमण के ADE मनाया, सुझाव है कि सीरम में एक एंटीबॉडी का स्तर 10 पतला होने की जरूरत को संक्रमण की वृद्धि का पता लगाने के गुना । दूसरी ओर, अंय अध्ययनों से कम कमजोर पड़ने पर वृद्धि की सूचना दी है, जो संकेत मिलता है कि सीरम नमूने में एंटीबॉडी की सांद्रता की संभावना बहुत अधिक थे, कम कमजोर पड़ने की जरूरत के लिए इन विट्रो मेंADE का पता लगाने । के रूप में ADE सीरम नमूने में एंटीबॉडी की सही एकाग्रता पर निर्भर करता है, ज्यादातर नमूनों पतला सीरम से कम कमजोर पड़ने पर ADE दिखाने की संभावना है.

अंत में, इस पांडुलिपि में वर्णित प्रोटोकॉल सरल और अपनाने के लिए आसान है, और एक छोटी अवधि के समय सीमा में नमूनों की एक बड़ी संख्या के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग को सक्षम करने के लिए उच्च गुणवत्ता डेटा है कि आसानी से विश्लेषण किया जा सकता है उपज के लिए अनुमति देता है और व्याख्या.

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

वर्णित परियोजना स्वास्थ्य विज्ञान के वर्दीधारी सेवा विश्वविद्यालय से JJM को निधियों द्वारा समर्थित किया गया था. राय या दावों निहित इस के साथ साथ लेखकों के निजी लोगों रहे है और सरकारी या रक्षा विभाग के विचारों को प्रतिबिंबित करने के लिए नहीं कर रहे हैं, वर्दीधारी सेवा स्वास्थ्य विज्ञान या अमेरिका के किसी अंय एजेंसी के विश्वविद्यालय सरकार.

WGV सभी प्रयोगों का प्रदर्शन किया और डेटा का विश्लेषण; JJM डिजाइन और अध्ययन की निगरानी; WGW और JJM ने पेपर लिखा ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DENV 1-4 RVP Integral Molecular RVP-501
K562 cells ATCC CCL-243
RPMI Corning 10-040-CV
FBS GE lifesceinces SH 30910.03 10% FBS in RPMI-10
Penicillin-Streptomycin MP biomedicals 1670049 100 IU Pen/mL, 100 ug Strep/mL in RPMI-10
HEPES Cellegro 25-060-Cl 0.025M in RPMI-10
MEM Non-essential Amino Acid Solution (100×) Sigma M7145 1x in RPMI-10
Sodium Pyruvate Cellegro 25-000-Cl 1mM in RPMI-10
L-glutamine Fisher Scientific MT25005CI 
Sterile V-bottom plates Thomas Scientific 333-8001-01V
BD Falcon Polypropylene 5 ml FACS tubes VWR 60819-728
Non-sterile U-bottom plates Falcon Ref 353910 A high throughput alternative to FACS tubes
5mL, sterile, serological pipette Denville P7127
200uL sterile pipette tips Denville P3020 CPS
20uL sterile pipette tips Denville P1121
50-200uL multichannel pipette Denville P3975-8-B
5-50uL multichannel pipette Denville P3975-9-B
20% formadehyde Tousimis  #1008B
Water Bath ThermoFisher TSCOL35
thermomixer Eppendorf 2231000387 An alternative to a waterbath for heat inactivation
CO2 Incubator ThermoFisher 13-998-213
Ethanol Sigma Aldrich E7023
Liquid Bleach Fisher Scientific NC9724348
Flowjo 9.8 TreeStar, Inc. Flow cytometry analysis software
BD FACSDiva 6.1.2 Becton Dikinson
BD LSR II flow cytometer Becton Dikinson
Liquid Bleach Fisher Scientific NC9724348

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References

  1. George, J., et al. Prior exposure to zika virus significantly enhances peak dengue-2 viremia in rhesus macaques. Sci Rep. 7 (1), 10498 (2017).
  2. Stettler, K., et al. Specificity, cross-reactivity, and function of antibodies elicited by Zika virus infection. Science. 353 (6301), 823-826 (2016).
  3. Mattia, K., et al. Dengue reporter virus particles for measuring neutralizing antibodies against each of the four dengue serotypes. PLoS One. 6 (11), e27252 (2011).
  4. Chiofalo, M. S., Teti, G., Goust, J. M., Trifiletti, R., La Via,, F, M. Subclass specificity of the Fc receptor for human IgG on K562. Cell Immunol. 114 (2), 272-281 (1988).
  5. Klein, E., et al. Properties of the K562 cell line, derived from a patient with chronic myeloid leukemia. Int J Cancer. 18 (4), 421-431 (1976).
  6. Kliks, S. C., Nisalak, A., Brandt, W. E., Wahl, L., Burke, D. S. Antibody-dependent enhancement of dengue virus growth in human monocytes as a risk factor for dengue hemorrhagic fever. Am J Trop Med Hyg. 40 (4), 444-451 (1989).
  7. Littaua, R., Kurane, I., Ennis, F. A. Human IgG Fc receptor II mediates antibody-dependent enhancement of dengue virus infection. J Immunol. 144 (8), 3183-3186 (1990).
  8. Wang, T. T., et al. IgG antibodies to dengue enhanced for FcgammaRIIIA binding determine disease severity. Science. 355 (6323), 395-398 (2017).
  9. Dejnirattisai, W., et al. Cross-reacting antibodies enhance dengue virus infection in humans. Science. 328 (5979), 745-748 (2010).
  10. Kawiecki, A. B., Christofferson, R. C. Zika virus-induced antibody response enhances dengue virus serotype 2 replication in vitro. J Infect Dis. 214 (9), 1357-1360 (2016).
  11. Morens, D. M., Halstead, S. B. Measurement of antibody-dependent infection enhancement of four dengue virus serotypes by monoclonal and polyclonal antibodies. J Gen Virol. 71 (Pt 12), 2909-2914 (1990).
  12. Perfetto, S. P., et al. Amine reactive dyes: an effective tool to discriminate live and dead cells in polychromatic flow cytometry. J Immunol Methods. 313 (1-2), 199-208 (2006).
  13. Priyamvada, L., et al. B Cell responses during secondary dengue virus infection are dominated by highly cross-reactive, memory-derived plasmablasts. J Virol. 90 (12), 5574-5585 (2016).
  14. Priyamvada, L., et al. Human antibody responses after dengue virus infection are highly cross-reactive to Zika virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (28), 7852-7857 (2016).

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इम्यूनोलॉजी और इंफेक्शन इश्यू 134 Zika वायरस डेंगू वायरस एंटीबॉडी निर्भर बढोतरी रिपोर्टर वायरल कण स्वास्थ्य लाभ सीरम Flavivirus
एक सरल प्रवाह Cytometry आधारित परख में निर्धारित करने के लिए <em>इन विट्रो</em> एंटीबॉडी निर्भर वृद्धि डेंगू के वायरस का उपयोग Zika वायरस स्वास्थ्य लाभ सीरम
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Valiant, W. G., Mattapallil, J. J. A … More

Valiant, W. G., Mattapallil, J. J. A Simple Flow Cytometry Based Assay to Determine In Vitro Antibody Dependent Enhancement of Dengue Virus Using Zika Virus Convalescent Serum. J. Vis. Exp. (134), e57371, doi:10.3791/57371 (2018).

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