إدارة بسيطة وفعالة والتصور من المجهرية الدقيقة في الدورة الدموية للأسماك الصغيرة باستخدام الحقن الكلي
Summary
يوضح هذا المقالة مبادئ حقن سريعة، وكسبها من الفلورسنت المجهرية الدقيقة في circulatory system الأسماك الصغيرة والتصور في فيفو من المجهرية الدقيقة في دم الأسماك.
Abstract
ويمكن تطبيق الإدارة النظامية للجسيمات الصغيرة الحجم في حي للتصور المفرج، العقاقير واللقاحات، زرع الخلايا المحورة وراثيا وأجهزة الاستشعار البصرية صغيرة. ومع ذلك، ميكروينجيكشنز عن طريق الحقن الوريدي في الحيوانات الصغيرة، والتي تستخدم في الغالب في المختبرات البيولوجية والبيطرية، صعبة جداً وتتطلب موظفين مدربين. هنا، نحن تثبت طريقة قوية وفعالة لإدخال المجهرية الدقيقة في نظام الدورة الدموية للكبار الزرد (دانيو rerio) بحقن في الكلي الأسماك. تصور المجهرية الدقيقة أدخلت في المفرج، نقترح تقنية تصوير إينترافيتال بسيطة في الخياشيم السمكية. في فيفو رصد درجة الحموضة الدم الزرد كان إنجازه باستخدام الفلورية المغلف حقن التحقيق، سنارف-1، لإثبات واحدة من التطبيقات الممكنة لوصف تقنية. هذا المقال يقدم وصفاً مفصلاً لتغليف صبغة حساسة لدرجة الحموضة ويوضح مبادئ حقن سريعة والتصور كبسولات رقيقة جداً التي تم الحصول عليها في فيفو تسجيل إشارة الفلورسنت. تتميز الطريقة المقترحة لحقن بمعدل وفيات منخفض (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما. يمكن تنفيذ جميع الإجراءات الموصوفة في أنواع الأسماك الصغيرة الأخرى، مثل أسماك الغابى والميداكا.
Introduction
إدارة الجسيمات الصغيرة الحجم في جسم حيوان مهمة هامة في مجالات مثل المخدرات و تسليم اللقاحات1والمفرج التصور2و زرع الخلايا المحورة وراثيا3وزرع أجهزة الاستشعار البصرية صغيرة 4 , 5-إجراءات غرس جسيمات microscale في نظام الأوعية الدموية في الحيوانات المختبرية الصغيرة غير صعبة، خاصة بالنسبة للكائنات المائية الحساسة. لعينات البحث شعبية مثل الزرد، فإنه ينصح أن يكون توضيح هذه الإجراءات باستخدام بروتوكولات الفيديو.
ميكروينجيكشنز إينتراكاردياك والشعرية تتطلب موظفين مدربين ومرافق الجراحة فريدة لتقديم ميكروبجيكتس في الدم الزرد. سابقا، قد اقترح حقن يدوي الرجعية-المداري3 كطريقة سهلة وفعالة لإدارة كل الخلايا. ومع ذلك، في تجربتنا، بسبب صغر مساحة الشبكة الشعرية العين، يستغرق الكثير من الممارسات لتحقيق النتيجة المرجوة من هذا الأسلوب.
هنا، نحن تصف طريقة لغرس يمثل قوية وفعالة في نظام الدورة الدموية عن طريق الحقن اليدوي مباشرة في أنسجة الكلي الزرد الكبار، وغنية بالشعيرات الدموية والأوعية الكلوية. يستند هذا الأسلوب على البروتوكول الفيديو لزرع الخلايا في الكلي الزرد6، ولكن تم القضاء على الخطوات microsurgical مؤلمة وتستغرق وقتاً طويلاً. الطريقة المقترحة تتسم بانخفاض معدل الوفيات (0-20 في المائة) وكفاءة عالية (النجاح 70-90 ٪)، وأنه من السهل أن المعهد باستخدام المعدات المتاحة عموما.
جزء هام من البروتوكول المقترح هو التصور من مزروع المجهرية الدقيقة (إذا كانوا الفلورسنت أو الملونة) في الشعيرات الدموية الخيشومية، مما يسمح لتحقق نوعية الحقن، وإجراء تقييم نسبي تقريبي لعدد حقن الجسيمات، والكشف عن إشارة الطيفية للقياسات الفسيولوجية مباشرة من الدم الجائل. كمثال للتطبيقات الممكنة لوصف تقنية، نبدي البروتوكول في فيفو قياسات pH دم الزرد استخدام مجس فلورسنت المغلف، سنارف-1، اقترح أصلاً في بورفينسكايا وآخرون. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
وللتدليل على الحقن المجهرية الدقيقة في الكلي الزرد، استخدمنا شبه نفاذية كبسولات رقيقة جداً محملة صبغ مؤشر. وهكذا، يتضمن البروتوكول إرشادات لتصنيع كبسولات رقيقة جداً استخدام الجمعية طبقة بطبقة polyelectrolytes المشحونة معاكس7،8،،من15<sup clas…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
المؤلف الاعتراف إلى حد كبير مساعدة بوغدان أوسادتشيي وقد بروتاسوف (جامعة ولاية إيركوتسك، روسيا) في إعداد البروتوكول الفيديو. وأيد هذا البحث “المؤسسة الروسية” للعلوم (#15-14-10008) و “مؤسسة روسية” عن “البحوث الأساسية” (#15-29-01003).
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. . ImageJ User Guide – Version 1.44. , (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
