Amministrazione semplice ed efficace e la visualizzazione di microparticelle nell'apparato circolatorio di piccoli pesci mediante l'inserimento di rene
Summary
Questo articolo illustra i principi di un’iniezione rapida, come minimo dilagante di microparticelle fluorescenti in circulatory system di piccoli pesci e la visualizzazione in vivo delle microparticelle in sangue di pesce.
Abstract
La somministrazione sistemica di particelle micro-dimensione in un organismo vivente può essere applicata per la visualizzazione del sistema vascolare, droga e distribuzione del vaccino, l’impianto di cellule transgeniche e piccoli sensori ottici. Tuttavia, microiniezioni endovenosa in piccoli animali, che sono principalmente utilizzati nei laboratori biologici e veterinari, sono molto difficili e richiedono personale qualificato. Qui, dimostriamo un metodo robusto ed efficiente per l’introduzione di microparticelle nell’apparato circolatorio di adulto zebrafish (Danio rerio) tramite l’iniezione nel rene pesce. Per visualizzare le microparticelle introdotte nel sistema vascolare, vi proponiamo una semplice tecnica di imaging videomicroscopia nelle branchie di pesce. In vivo monitoraggio del pH del sangue di zebrafish è stato compiuto usando un fluorescente microincapsulati iniettato sonda, SNARF-1, per dimostrare una delle possibili applicazioni della tecnica descritta. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di incapsulamento di pH sensibili colorante e dimostra i principi dell’iniezione rapida e la visualizzazione di microcapsule ottenute per registrazione in vivo del segnale fluorescente. Il metodo proposto di iniezione è caratterizzato da un tasso di mortalità basso (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili. Tutte le procedure descritte possono essere eseguite su altre specie di piccoli pesci, come i guppies e medaka.
Introduction
La somministrazione di particelle micro-dimensione in un organismo animale è un compito importante in tali zone come droga e vaccino consegna1, sistema vascolare visualizzazione2, cellula transgenica impianto3e l’impianto piccolo sensore ottico 4 , 5. Tuttavia, la procedura di impianto per le particelle di Microscala nel sistema vascolare di piccoli animali da laboratorio è difficile, soprattutto per gli organismi acquatici delicati. Per campioni di ricerca popolari come zebrafish, è consigliabile che queste procedure essere chiarita mediante protocolli dei video.
Microiniezioni intracardiache e capillare richiedono personale qualificato e servizi di microchirurgia unico per la consegna dei microobjects nel sangue di zebrafish. In precedenza, un’ iniezione manuale retro-orbitale3 è stato suggerito come un metodo facile ed efficace per la somministrazione di cellule intere. Tuttavia, nella nostra esperienza, a causa della piccola zona della rete capillare occhio, ci vuole molta pratica per ottenere il risultato desiderato da questa tecnica.
Qui, descriviamo un metodo per l’impianto di microparticelle solide ed efficienti nell’apparato circolatorio di iniezione manuale direttamente nel tessuto del rene di zebrafish adulto, che è ricca di vasi capillari e vasi renali. Questa tecnica si basa sul protocollo dei video per trapianto di cellule in zebrafish rene6, ma sono stati eliminati i passaggi di microsurgical traumatici e che richiede tempo. Il metodo proposto è caratterizzato da bassa mortalità (0-20%) e ad alta efficienza (70-90% di successo) ed è facile da Istituto utilizzando attrezzature comunemente disponibili.
Una parte importante del protocollo proposto è la visualizzazione delle impiantato microparticelle (se sono fluorescenti o colorato) nei capillari gill, che permette di verificare la qualità di iniezione, una valutazione relativa approssimativa del numero di particelle iniettate e la rilevazione del segnale spettrale per misurazioni fisiologiche direttamente dal sangue circolante. Come esempio delle possibili applicazioni della tecnica descritta, dimostriamo il protocollo per in vivo misure di pH del sangue di zebrafish usando una sonda fluorescente microincapsulata, SNARF-1, originariamente suggerito nel Borvinskaya et al. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per dimostrare l’iniezione di microparticelle in zebrafish rene, abbiamo usato semipermeabile microcapsule caricati con un colorante indicatore. Così, il protocollo contiene le istruzioni per la fabbricazione di microcapsule usando l’Assemblea strato dopo strato di carica opposta polielettroliti7,8,15,16,17 ,18 (<strong cla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autori riconoscono notevolmente l’aiuto di Bogdan Osadchiy ed Evgenii Protasov (Università statale di Irkutsk, Russia) in preparazione del protocollo dei video. Questa ricerca è stata sostenuta dalla Fondazione scienza russa (n. 15-14-10008) e dalla Fondazione russa per la ricerca di base (n. 15-29-01003).
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. . ImageJ User Guide – Version 1.44. , (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
