Einfache und effektive Verwaltung und Visualisierung von Mikropartikeln im Herz-Kreislauf-System von kleinen Fischen mit Niere Injektion
Summary
Dieser Artikel beschreibt die Grundsätze der eine schnelle, minimal-invasive Injektion von fluoreszierenden Mikropartikel in der Circulatory system von kleinen Fischen und in Vivo Visualisierung von Mikropartikeln Fisch im Blut.
Abstract
Die systemische Gabe von Mikro-Größe Partikel in einem lebenden Organismus kann zur Gefäßsystem Visualisierung, Drogen und Impfung, Implantation von transgenen Zellen und kleine optische Sensoren eingesetzt werden. Jedoch intravenöse Mikroinjektionen in kleine Tiere, die meist in biologischen und veterinärmedizinischen Laboratorien verwendet werden, sind sehr schwer und erfordert geschultes Personal. Hier zeigen wir eine robuste und effiziente Methode für die Einführung von Mikropartikeln in das Kreislaufsystem der Erwachsenen Zebrafisch (Danio Rerio) durch Injektion in die Fisch-Niere. Um die eingeführten Mikropartikel in das Gefäßsystem zu visualisieren, schlagen wir eine einfache intravitalen bildgebende Verfahren in Kiemen. Überwachung von Zebrafisch-Blut-pH in Vivo wurde erreicht mit einem injizierten mikroverkapselte Leuchtstofflampen Sonde, SNARF-1, eine der möglichen Anwendungen von der beschriebenen Technik demonstrieren. Dieser Artikel enthält eine ausführliche Beschreibung der Kapselung des pH-sensitiven Farbstoffs und zeigt die Grundsätze der schnelle Injektion und Visualisierung der erhaltenen Mikrokapseln für in Vivo Aufnahme das Fluoreszenzsignal. Die vorgeschlagene Methode der Injektion zeichnet sich durch eine niedrige Sterblichkeitsrate (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten. Alle beschriebene Verfahren können auf anderen kleinen Fischarten wie Guppys und Medaka durchgeführt werden.
Introduction
Die Verwaltung der Mikro-Größe Partikel in den tierischen Organismus ist eine wichtige Aufgabe in Bereichen wie Drogen und Impfstoff Lieferung1, Gefäßsystem Visualisierung2, transgenen Zelle Implantation3und winzigen optischen Sensor implantation 4 , 5. der Implantation für Microscale Partikel in das Gefäßsystem von kleinen Labortieren ist jedoch schwierig, vor allem für empfindliche Wasserorganismen. Für populäre Forschung Exemplare wie Zebrafisch, ist es ratsam, die diese Verfahren mit Videoprotokolle geklärt werden.
Intrakardialen und Kapillare Mikroinjektionen erfordert geschultes Personal und einzigartige Mikrochirurgie Einrichtungen für die Lieferung von Microobjects in Zebrafisch Blut. Zuvor wurde ein Retro-Orbital manuelle Injektion3 als eine einfache und effektive Methode für die Verwaltung ganzer Zellen vorgeschlagen. Aber nach unserer Erfahrung dauert wegen der kleinen Fläche des Auges Kapillaren Netzes, es viel Übung, um das gewünschte Ergebnis von dieser Technik zu erreichen.
Hier beschreiben wir eine Methode für die robuste und effiziente Mikropartikel Implantation in das Herz-Kreislauf-System durch manuelle Injektion direkt in das nierengewebe Erwachsenen Zebrafisch, die ist reich an Kapillaren und renaler Gefäße. Diese Technik basiert auf dem video-Protokoll für Stammzelltransplantation in der Zebrafisch Niere6, aber die traumatischen und zeitraubende mikrochirurgische Schritte wurden beseitigt. Die vorgeschlagene Methode zeichnet sich durch geringe Mortalität (0-20 %) und hohe Effizienz (70-90 % Erfolg), und es ist leicht, Institut, mit handelsüblichen Geräten.
Ein wichtiger Teil des vorgeschlagenen Protokolls ist die Visualisierung der implantierten Mikropartikel (wenn sie fluoreszierende oder eingefärbte) in den Kapillaren der Kieme, ermöglicht eine Überprüfung der Injektion Qualität, eine grobe relative Bewertung der Anzahl der injizierten Partikel und die Erkennung des spektralen Signals für physiologische Messungen direkt aus dem zirkulierenden Blut. Als ein Beispiel für die Einsatzmöglichkeiten von der beschriebenen Technik demonstrieren wir das Protokoll für in Vivo Messungen von Zebrafisch-Blut-pH mittels mikroverkapselte fluoreszierende Sonde, SNARF-1, ursprünglich vorgeschlagenen in Borvinskaya Et Al. 2017-5.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um die Injektion von Mikropartikeln in der Zebrafisch-Niere zu demonstrieren, haben wir semipermeable Mikrokapseln mit einem indikatorfarbstoff geladen. Das Protokoll enthält Anweisungen für die Herstellung der Mikrokapseln mit der Schicht für Schicht Versammlung von entgegengesetzt geladenen Polyelektrolyten7,8,15,16,17 ,18</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Autoren erkennen stark Hilfe von Bogdan Osadchiy und Evgenii Protasov (staatliche Universität Irkutsk, Russland) in Vorbereitung des video-Protokolls. Diese Forschung wurde von der russischen Science Foundation (#15-14-10008) und der Russischen Stiftung für Grundlagenforschung (#15-29-01003) unterstützt.
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. . ImageJ User Guide – Version 1.44. , (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
