Este artigo demonstra os princípios de uma injeção rápida, minimamente invasiva de micropartículas fluorescentes para a circulatory system de peixes pequenos e a visualização na vivo das micropartículas em sangue de peixe.
A administração sistémica de tamanho micro partículas em um organismo vivo pode ser aplicada para a visualização da vasculatura, drogas e entrega de vacina, implantação de células transgénicas e pequenos sensores ópticos. No entanto, microinjeções intravenosas em animais de pequenos porte, que são principalmente usados em laboratórios biológicos e veterinários, são muito difíceis e exigem pessoal treinado. Aqui, vamos demonstrar um método robusto e eficiente para a introdução de micropartículas no sistema circulatório do adulto peixe-zebra (Danio rerio) por injeção para o rim de peixe. Para visualizar as micropartículas introduzidas na vasculatura, propomos uma técnica simples de intravital imagem em guelras de peixe. In vivo , monitoramento do zebrafish pH sangue foi realizada utilizando um fluorescente microencapsulado injetado sonda, SNARF-1, para demonstrar uma das possíveis aplicações da técnica descrita. Este artigo fornece uma descrição detalhada do encapsulamento do corante sensíveis ao pH e demonstra os princípios da injeção rápida e visualização das microcápsulas obtidas para in vivo de gravação do sinal fluorescente. O método proposto de injeção é caracterizado por uma taxa de mortalidade baixa (0-20%) e alta eficiência (70-90% de sucesso) e é fácil de instituir utilizando equipamentos comumente disponíveis. Todos os procedimentos descritos podem ser executados em outras espécies de peixes pequenos, tais como guppies e medaka.
A administração de microtamanho de partículas em um organismo animal é uma tarefa importante em áreas como a droga e vacina entrega1, vasculatura visualização2, implantação de célula transgénicos3e implantação minúsculo sensor óptico 4 , 5. no entanto, o procedimento de implantação para microescala partículas dentro do sistema vascular dos animais de laboratório pequeno é difícil, especialmente para os organismos aquáticos delicados. Para amostras de pesquisa populares como zebrafish, aconselha-se que estes procedimentos ser esclarecido usando protocolos de vídeo.
Microinjeções intracardíacos e capilares exigem microcirurgia únicas instalações e pessoal treinado para a entrega de microobjects em sangue de zebrafish. Anteriormente, uma retro-orbital injeção manual3 foi sugerido como um método fácil e eficaz para a administração de células toda. No entanto, em nossa experiência, por causa da pequena área da rede capilar de olho, é preciso muita prática para alcançar o resultado desejado desta técnica.
Aqui, descrevemos um método para implantação de micropartículas robusta e eficiente para o sistema circulatório por injeção manual diretamente no tecido renal de zebrafish adulto, que é rica em capilares e vasos renais. Esta técnica baseia-se no protocolo de vídeo para transplante de células para o zebrafish rim6, mas foram eliminados os passos microcirúrgicos traumáticos e demorados. O método proposto é caracterizado por baixa mortalidade (0-20%) e alta eficiência (70-90% de sucesso) e é fácil de instituir utilizando equipamentos comumente disponíveis.
Uma parte importante do protocolo proposto é a visualização das implantado micropartículas (se eles são colorida ou fluorescente) nos capilares de gill, que permite a verificação da qualidade da injeção, uma áspera avaliação relativa do número de injetados de partículas e a deteção do sinal espectral para medições fisiológicas diretamente do sangue circulante. Como um exemplo das possíveis aplicações da técnica descrita, demonstramos o protocolo para medições em vivo do pH do sangue zebrafish usando uma sonda fluorescente microencapsulada, SNARF-1, originalmente sugerido em Borvinskaya et al. 20175.
Para demonstrar a injeção de micropartículas no rim zebrafish, usamos semi-permeável microcápsulas carregadas com um corante indicador. Assim, o protocolo contém instruções para a preparação das microcápsulas usando o assembly de camada por camada de polieletrolitos oposta carregado7,8,15,16,17 ,18 (<strong class=…
The authors have nothing to disclose.
Autores grandemente reconhecem a ajuda de Bogdan Osadchiy e Evgenii Protasov (Universidade Estatal de Irkutsk, Rússia) em preparação do protocolo de vídeo. Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação de ciência russo (#15-14-10008) e a Fundação russo de pesquisa básica (#15-29-01003).
SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |