Summary
小型魚の circulatory system と魚血微粒子の体内可視化に蛍光微粒子の低侵襲、迅速注入の原理を説明します。
Abstract
生きている有機体にマイクロ サイズ粒子の全身投与は血管可視化薬とワクチンの配信、トランスジェニック細胞と小型の光学センサーの適用できます。しかし、生物学・獣医研究所の使用が多い、小動物に静脈内の薬剤が非常に困難な訓練された人員を必要とします。ここで、我々 は魚の腎臓への注入による微粒子のアダルト ゼブラフィッシュ (動脈分布) の循環系への導入のため堅牢で効率的なメソッドを示します。血管系で導入された微粒子を可視化、魚のえらに単純な生体イメージング手法を提案する.注入されたマイクロ カプセル化蛍光を使用して達成された体内監視ゼブラフィッシュ血液 pH のプローブ、パク-1、記載した技術の可能なアプリケーションの 1 つであります。この記事は、pH 感受性色素のカプセル化の詳細な説明し、迅速な注入の原理と体内蛍光信号の録音のための得られたマイクロ カプセルの可視化を示します。インジェクションの手法は低い死亡率率によって特徴付けられる (0-20%) と高効率 (70-90% 成功)、それは一般に利用できる機器を使用して研究所に簡単。グッピーやメダカなど、他の小さな魚の種にすべて記載されている手順を実行できます。
Introduction
動物有機体にマイクロ サイズ粒子の管理は小さな光学センサー注入およびトランスジェニック細胞注入3、血管可視化2ワクチン配信1医薬品などの分野で重要な課題4,5します。 ただし、実験小動物の血管系へのマイクロ粒子の注入手順は難しい、特に繊細な水生生物です。ゼブラフィッシュのような人気のある研究標本のお勧めビデオ プロトコルを使用してこれらの手順を明らかにすること。
心内及びキャピラリーのマイクロインジェクション ゼブラフィッシュ血に microobjects の配信するためスタッフとユニークな手術設備が必要です。以前は、レトロな軌道手動注入3がセルを全体を管理するための簡単で効果的な方法として示唆されました。しかし、我々 の経験で目の毛細血管網の小さい区域のためかかりますこの手法から目的の結果を達成するために多くの練習。
本明細書で述べる循環系への堅牢で効率的な微粒子注入法大人ゼブラフィッシュの腎臓組織に直接手動注入による腎血管と毛細血管が豊富であります。この手法は、ゼブラフィッシュの腎臓6に細胞移植ビデオ プロトコルに基づいていますが、外傷性および時間のかかる顕微鏡手順が排除されました。提案手法は低死亡率によって特徴付けられる (0-20%) と高効率 (70-90% 成功)、それは一般に利用できる機器を使用して研究所に簡単。
提案プロトコルの重要な一部が注入された微粒子の (蛍光灯や色付きのもの) 場合ギル毛細血管でインジェクションの品質、数の大まかな相対評価の検証を可能にする可視化注入された粒子、循環血液から直接生理学的な測定のためスペクトル信号の検出。パク-1、最初に提案された Borvinskaya マイクロ カプセル化蛍光プローブを用いたゼブラフィッシュ血液 pH の生体内測定のためのプロトコルを示す記載した技術の可能なアプリケーションの例としてら。2017年5。
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Protocol
すべての実験手順、動物実験のための EU 指令 2010年/63/EU に従い行った動物科目研究委員会の研究所の生物学イルクーツク州立大学によって承認されています。
1. マイクロ カプセルの作製
注: 蛍光染料を運ぶカプセルは帯電凝集沈殿処理7,8層によってアセンブリを使用して準備されます。すべてのプロシージャは、室温で行われました。
- 蛍光染料を囲む多孔性の CaCO3 microcores を合成するには、ミックス (FITC BSA などほとんどの高分子と結合蛍光染料を使用できます) パク-1-デキストラン溶液 2 mL ~ 2 Mg/ml の濃度で 0.6 ml 各 CaCl 2溶液 1 mol/L のと高速攪拌下で Na2CO3 。
注: は、退色; に蛍光染料の別の感度に注意を払う(パク-1) のような光に敏感な蛍光プローブを使用すると場合、は、可能な限り小さな光として微粒子の操作・と実行する必要があります。 - 撹拌の 5-10 秒後に転送懸濁液 2 mL マイクロ遠心チューブ用と 15 の遠心載荷 CaCO3 microcores をペレットに 10,000-12,000 g で s。
- 上澄みを廃棄し、〜 2 ml の脱イオン水のコアを洗浄し、揺れでペレットを再懸濁します。
- 合計で 3 回遠心洗浄手順を繰り返します。最後の遠心分離後、上清を破棄します。
- Microcores、凝集を抑える超音波風呂で 1 分間、インキュベートします。
注意: は、ヘッドフォンで耳を保護するために忘れないでください。 - テンプレートの第 1 のポリマー層をデポジットするには、2 〜 4 mg/mL の溶液 1 mol/l 塩化ナトリウム poly(allylamine hydrochloride) (PAH) の mL でコアを再懸濁します。
- 一定の揺れと ~ 5 分のためのソリューションに、microcores をしてください。
- 15 日以降後の遠心分離、s は非連結の PAH を持つ上澄みを廃棄します。少なくとも 3 回複数の遠心分離、洗浄手順を脱イオン水で覆われた microcores を洗ってください。最後の遠心分離後、上清を破棄します。
- Microcores、凝集を抑える超音波風呂で 1 分間、インキュベートします。
注: 適用される蛍光色素がカチオンの場合ポリ (スチレンスルホン酸ナトリウム 4-) から開始 (PSS) 1 mol/l 塩化ナトリウム (1.7 の手順を参照してください)。
- テンプレートに第 2 のポリマー層を堆積させるため手順 1.6 〜 2 mL (1 mol/L 塩化ナトリウムとも含んでいる) PSS の 4 mg/mL の溶液を繰り返します。
- 12 高分子層を堆積させるため、1.6 と 1.7 の 6 倍の手順を繰り返します。
注: 勧めできません (〜 12 h 以上) 長い休憩を取るに 3 〜 5 までの手順でレイヤーを報道せず CaCO3 microcores が recrystallize する傾向があるために寄託されています。PSS カバレッジにより、microcores の高い集計の長い一時停止 (PLL-g-PEG) は一番外側の層で PAH またはポリ L リジンはポリエチレング リコールをグラフトした場合にのみお勧めに注意してください。 - 少なくとも 2 時間 PLL-g-ペグ (〜 1 mL マイクロ チューブごと) を 2 mg/mL で覆われた microcores を孵化させなさい。
- 連続遠心分離と再懸濁の手順を介して水と microcores を洗ってください。最後の遠心分離後、上清を破棄します。
- 中空マイクロ カプセルを得るためには、屋根付きの microcores に (NaOH で ph 7.1 調整) 0.1 mol/L エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) 溶液 2 mL を追加して CaCO3テンプレートを溶解します。
- 45 s と破棄のマイクロ カプセルを遠心培養 〜 5 分後、EDTA と上清。
- 1.10 1.10.1 の手順を 2 回繰り返します。
- 0.9 %nacl を通じて複数の遠心分離、3 回ステップ 45 内にマイクロ カプセルを洗う洗浄手順が続く s。最後の遠心分離のステップ後上澄みを廃棄します。
メモ: 最終的なマイクロ カプセル注射剤保管され滅菌 (たとえばアンピシリン、0.1 mg/mL を加えること) で、メディアは、生体適合性調査 (中性等張性メディア) の対象とする必要があります。 - 蛍光顕微鏡下で検定の準備のマイクロ カプセルの濃度を推定します。マイクロ カプセルの写真のシリーズを取る、ImageJ の9またはそれと同等のソフトウェアを使用して 100 マイクロ カプセルについての直径を測るし、ヒストグラムを使用してサイズの分布を調査します。
- 得られた店は、暗闇の中でプローブをカプセル化します。
注: 滅菌 0.9% でいくつか洗濯後塩化ナトリウム、4 ° C で数ヶ月保存できるマイクロ カプセル貯蔵中のマイクロ カプセルの完全乾燥はお勧めしません。
2 光のセットアップと調整のマイクロ カプセル化パク-1 の準備
注: マイクロ カプセル化パク - 1 大まかな pH 測定 1 ch 蛍光顕微鏡接続ファイバー分光器にこのプロトコルでが適用されたが蛍光顕微鏡の7の 2 つのチャンネルのイメージを使用して行うことができます。
- 必要な応用の蛍光染料の特性に応じて蛍光顕微鏡に蛍光フィルターのセットを置き、蛍光ランプをオンにします。
- 接眼レンズにレバーを引いてください。
注意: 余分な光は、分光器マトリックスを損傷します。したがって、分光計を使用しない場合で、レバーが「接眼レンズ」モードにあることを確認します。 - 分光計とのコリメーターをもう一方の端に光ファイバーの一方の端を接続します。アダプターを使用して、撮像管の焦点または蛍光顕微鏡の他の利用可能なポートにコリメータを配置します。
- 分光計を入れます。分光器制御プログラムを実行し、測定分光計を準備します。
- 接眼レンズにレバーを引いてください。
- マイクロ カプセル バッチの校正顕微鏡スライドの上 ~ 5 μ L マイクロ カプセル懸濁液 (脱イオン水で μ L あたり 〜 10 000 カプセル) を置き、(たとえば、35 ° C でサーモスタット) で暗い場所でドロップを乾燥します。
- 、マイクロ カプセル化パク-1 のスペクトル特性を調整するには、異なる pH 値が 6 ~ 9 の範囲内の一連のバッファーを使用します。パク-1-デキストランと乾燥マイクロ カプセルにバッファーの ~ 10 μ L をドロップして、coverslip でそれをカバーします。
- 顕微鏡ステージ上にスライド ガラスを配置します。× 40 目的を使用してカプセルを探します。
- カメラのポートに顕微鏡レバーを回します。分光計、蛍光に登録します。接眼レンズに戻ってレバーを回します。
注: スペクトル信号はバック グラウンドのレベルをはるかに超えていることを確認、ビューのフィールドにマイクロ カプセルがされないように泡で (必要な場合は低倍率に切り替え) で。同じマイクロ カプセルの長時間光照射は避けてください。パク-1 は、光に敏感です。 - 異なるマイクロ カプセル 10-15 倍の 2.2.3 のステップを繰り返します。
- すべての登録されているスペクトルの (たとえば、R または Scilab を使用して) 蛍光ピーク比を計算し、(各バッファー) の中央値の比と培地の pH は次の式を使用しての間の回帰線を決定します。
注: パク-1 は、プロトン化や脱プロトン化した色素の排出に対応する 2 つのピークを持つスペクトルを持ち、培地の pH に応答のピークの間の比率。本研究では 605 と 660 nm の蛍光強度比が使用されます。これらの波長は使用するフィルター セットによって選ばれます。aとbは、(たとえば、R を使用して)、非線形回帰によって決定される係数です。0.15 と 1.1 の値が、それぞれの最小値と最大値私605/I660キャリブレーション時に観測されました。 - 約 5 大人動物から魚血の約 10 μ L を収集します。1 μ L/mL をシャーレに場所の魚麻酔のクローブ オイルの懸濁液を水し、動物が横向きになりフィンのつまみに応答を停止するを待ちます (通常 2 〜 3 分)。ガラス スライド上には、魚を転送します。ランセットで魚の尾を切断し、尾静脈から魚血の約 2 μ L を収集します。
注: 血液凝固を防ぐため、ヘパリン (5000 U/mL) を使用して切開を治療し、血液を収集するヘパリン ガラス管および遠心管を使用します。- 電極の先端にピペットで血の約 10 μ L を滴下し、pH 計を用いて pH を決定します。
- 乾燥マイクロ カプセルとスライドに血をドロップし、校正バッファー (手順 2.2 2.3) のとおり、蛍光強度の比を登録します。
- 曲線の一致 (のより多くの詳細を参照してください Borvinskayaら20175) 魚の血液で測定する検量線の直線の係数を調整します。
3. 注射の準備
- 鋭いランセットとプラスチックを除去することによってインスリンのペン (または注射器) の先端から鉄の針をリリースします。
注: 任意の細い針 (Ø0.33 mm 以下) またはガラス毛細管 (通常 Ø1 mm) マイクロインジェクション10,11準備できます。 - 途中で針を挿入ガラス マイクロキャピ ラリー;ゆっくりとすぐにガスのトーチを使用してそれをはんだ付けします。
- ガラスシリンジにガラス マイクロキャピ ラリーを接続し、滅菌水で 3 回フラッシュします。とおしての液体が流れることを確認します。
- 蒸留水には、システムを入力します。
メモ: システムに気泡がないことを確認します。
4. 注入
- マイクロ カプセルの準備の懸濁液を再懸濁します (無菌の 0.9% の塩化ナトリウム、またはその他のメディアに使用 1 マイクロリットルあたり 0.5 に 600 万マイクロ カプセルの濃度の注射) 1 分間超音波洗浄器を使用して。
注: マイクロ カプセルの注射の中に沈殿する傾向があるので振るマイクロ カプセルで機械的に (ロータを使用して) またはそれらを再懸濁します、その凝集を予防し、数分ごと手動で。 - 2 〜 3 の麻酔 (水で中断クローブ オイルの 0.1 mL/L) とシャーレに魚を配置分魚はその側になりフィンの光のピンチに応答を停止するまで待ちます。
- スプーンを使用して、転送、麻酔から魚と軽く側臥位で左 (右利きの人) の方または (左利きの人) のための権利の方の頭で湿ったスポンジの上に置きます。
- 注入直前マイクロインジェクターと接続されているガラス管への空気の 1-2 mm を吸います。その後、分散型マイクロ カプセルの約 2 μ L でそれを読み込みます。
注意: 注入前にマイクロ カプセル ソリューションは魚を保存する温度に調整する必要があります。 - 優しく非支配的な手でスポンジに魚体を安定させます。
- 魚の側線を見つけます。精神的腹部キャビティの端に、蓋から拡張するセグメントを選択します。このセグメントの中央を見つけます。腹側方向に針 1 mm を下に置きます。
- こする動きで優しく魚はさておき、スケールし、パンクを移動します。テーブル面に 45 ° の角度で体に針を挿入します。
- 脊椎に向かって針を押して、それは慎重にそれに合わせます。
- 腎臓に約 1 μ L マイクロ カプセルの懸濁液を解放し、ゆっくりと針を撤回します。
注: 適切な穿刺部位を検索するには、より簡単に便利です図 2 a と 2 bに示すように、下のライトを使用して魚を transilluminating によってトランク腎臓を見つける練習します。
- 注射部位、こぼれたカプセルを削除する水の流れの末尾に頭から魚をすすいでください。
5.生体内可視化
- 解剖はさみを使用して魚の頭から鰓蓋を削除し、魚のえらをはぎ取る。水で顔をすすいでください。
- スプーンを使用して、顕微鏡のスライドに魚を転送し、蛍光顕微鏡のステージの上に置きます。
注: 魚の鰓が連続したプロシージャ中の乾燥しないでくださいことを確認します。これを避けるには、パスツール ピペット (約 1-2 分毎) を使用して水で潤した定期的に。 - 部屋を暗くと蛍光マイクロ カプセルを見つけるためエラを検査 (10 の目的) x の低倍率を使用しています。
注: いくつかの蛍光粒子の魚の循環系への導入の手順を使用すると、お勧めの注射する前に予期しない蛍光粒子のいくつかの個人のえらを検査します。野生型のゼブラフィッシュのえらを蛍光、持っていないが、いくつかのケースで (のような食品の部分または単細胞共生) 散発的な蛍光粒子鰓に存在します。かどうか、必要に応じてそのような粒子認識できる彼らの特定の形状に基づいて (たとえば、品ある不規則な形状、球形マイクロ カプセルとは異なり) または蛍光スペクトル測定 (すなわち色)。- 高い大きさ (40 × 目標) に、レンズを切り替える、ビューのフィールドの中央にカプセルまたはマイクロ カプセルのグループを配置します。
- 接続されている装置のポートにレバーを回します。スペクトルの信号を記録します。
- 接眼レンズに戻ってレバーを回します。
- マイクロ カプセルの異なる複数回の測定を繰り返します。
- 回復のための適切なエアレーションで水槽に魚を転送します。
注: 最小限の練習だ注射し、魚あたり 2 〜 3 分のおおよその速度で記録する信号を実行することが可能。麻酔の繰り返された低、無害な線量または固定の別の方法を使って 1 つ個々 数回測定を繰り返すことができます。長期的な観測は、連続麻酔12システムを使用します。
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Representative Results
得られた結果は、提案するプロトコルの 3 つの主要なカテゴリのいずれかから来る: 蛍光色素 (図 1)、さらに可視化とマイクロ カプセルの腎臓射出カプセル化による蛍光微粒子の形成(図 2 および 3) 毛細血管を鰓と、最後に、生体内でスペクトルの記録を監視するパク-1 蛍光血液の pH のレベル (図 4)。
逆に複数の層で染料を囲むテンプレート CaCO3コアのコーティングを使用して層によってアプローチ荷電高分子鎖 (PSS および PAH) と生体適合性高分子 (PLL-g-PEG) の最も外側の層は、シンプルでコスト効果の高い方法パク-1-デキストラン、FITC BSA 他 (図 1 a) など異なる蛍光プローブをカプセル化することができます。その結果、安定した半透性弾性殻のサイズと蛍光色素を読み込まれているミクロの中空マイクロ カプセルには、(図 1 b) が得られます。この手法により作製したマイクロ カプセルが通常不均一な粒子サイズと各バッチ (図 1С) に特徴的な中間サイズの正規分布。
図 1: 層によって中空高分子電解質マイクロ カプセルのの合成とキャラクタリゼーション、蛍光色素を搭載しました。(A) (Gurkov et al. 20164で公開された同様のスキームから描画) マイクロ カプセル アセンブリのスキーム。(B)蛍光色素 FITC BSA を中空マイクロ カプセルの画像が読み込まれます。(C)の図 1 bからマイクロ カプセルのバッチのをサイズします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
魚の腎臓に直接手動注入による小型魚の循環系への堅牢で効率的な微粒子注入が行えます。魚体 (腎) の適切なサイトで穿刺は、手動噴射による微粒子の迅速な配信のため重要です。魚の腎臓造血臓器し、したがって、それはまあ色は色素胞が含まれています。泳ぐ膀胱の透明チャンバーを挟まれ、ので弱い色素沈着、透視図 2Aおよび 2Bのように、下部の光源を用いた小型の魚のままの動物の器官を識別するために簡単です。
図 2: 腎臓注射の適切なサイトのローカリゼーション。(A) 、ゼブラフィッシュの透過照明トランク腎臓 (矢印) の局在化を示します。(B)方式は適切な穿刺部位を特定する方法を示しています。白の点線は、魚の腹部のセグメントの側線を示します。矢印は、穿刺や脊椎に向かって射出の適切な方向のサイトを示します。泳ぐ膀胱は、緑の線で示されます。(C)ゼブラフィッシュ腎臓器官や体壁の除去に続いての可視化。トランク腎臓の中央のふくらみを指す矢印。(D) D. 学の矢状組織切片を示しています大人の魚の内臓の解剖学一般(H & E 染色).(E) (D) から後の枢機卿の静脈の内腔を指す矢印の付いたスケール (点線) 魚の腎臓の顕微鏡写真。アスタリスクは、浮袋を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
注入のプロシージャの成功を確認するには、低倍率 (x10 20 目的) でエラの迅速な検査が魚の鰓蓋 (図 3 a) を切断した後にすべきであります。注射部位の残りまたは体腔 (図 3 b) にこぼれるマイクロ カプセルのほとんどにもかかわらず注射を正しく実行すると、ギル毛細血管で自由に浮かぶ蛍光マイクロ カプセルを観察することが可能だ、(図 3) 注入後すぐに、裸の魚のエラします。えらの蛍光粒子を検出されない場合同じ穿刺注入を繰り返すことは不可能です。総注入された魚の約 70-90% の血流への配信成功を取得必要があります。
図 3: さらに鰓毛細血管の可視化とマイクロ カプセルの腎臓注入。(A)ゼブラフィッシュ血流にマイクロ カプセル配信の全体的なスキーム。(B)マイクロ カプセル (穿刺部位は矢印によって示されます) 緑の FITC BSA 色素を注射後のゼブラフィッシュの蛍光イメージ。(C) (B) からスケール、魚のえらのこの絵は腎臓注入によるマイクロ カプセルを正常に配信を示します (野生型ゼブラフィッシュのえらがある蛍光なし)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
魚トランク腎臓に直接注入中を穿刺部位の下に実質毛細血管や腎の血管への損傷を示す形成通常豊富なあざです。穿刺はすぐに契約に表示されますので、体外血液の漏出は無い。内部出血にもかかわらず手順 (表 1) を存続およそ 80-90% と個人を回復できます。魚種傷害13,14後ネフロンde novoで再生できることをまた知られています。魚の 20% 以上が死んでいる場合、anesthetization が適切に行われる必要があります。
| カプセル化された蛍光色素 | n | 濃度、μ L あたりカプセル | 注入量、μ L | マイクロ カプセル、μ m の平均粒径 | 魚の血流に配信の成功 % | 注入後、死亡率 % | |
| 1 h | 1 日 | ||||||
| トランク腎臓への注入 | |||||||
| FITC BSA | 36 | 4 x 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| パク-1-デキストラン | 29 | 10 x 3 65 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC デキストラン | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0.9 %nacl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| レトロな軌道注入 | |||||||
| FITC BSA | 9 | 1 x 10 の5 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC デキストラン | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
テーブル 1。安全性とゼブラフィッシュ血流へのマイクロ カプセルの配達の効率です。プロシージャの成功は、魚の鰓毛細血管の蛍光物質の存在によって決定されます。
注入された微粒子の濃度は十分ですが、少なすぎる粒子は魚のえらで視覚化する急速にあります。同時にあまりにも高濃度懸濁液は針を詰まらせることが。メジアン径 2 ~ 5 μ m 層によって組み立てられたマイクロ カプセルの場合 μ L あたり約 4 * 105-6 * 106マイクロ カプセルの濃度は魚の腎臓 (テーブル注入後魚のえらの楽な検出に最適2)。
| 濃度、μ L あたりカプセル | 異なる個人のえらの顕微鏡フィールドのビュー (× 20 の目的) にマイクロ カプセルの数 (n = 濃度あたり 7) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 × 10 の4 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
表 2。FITC BSA 含有マイクロ カプセルの visual カウントの記録 D. 学後鰓注入 (1.6 μ) トランク腎臓に。
パク-1 (図 4)、マイクロ カプセル化蛍光プローブによるゼブラフィッシュ血液 pH の体内を監視するため魚の循環系への微粒子の注入の手法を適用できます。パク-1 (図 4 a) プロトン化や脱プロトン化した色素の排出に対応する 2 つのピークを持つスペクトルには、このようにメディアの異なる pH でのピーク間の比率の曲線は、校正印刷 (図 4 b)。カプセル化されたパク - 1 (図 4 b)、マイクロ カプセルとガラス電極 pH 計、血液 pH の同時測定による実験的評価可能な読み出し、血液の成分に影響を与えます。係数の実験的測定 pH 差に等しいによってバッファーの曲線をシフトすることによってゼブラフィッシュ血液中のマイクロ カプセルの推定較正曲線をプロットするか (詳細については Borvinskayaら20175参照)。
ゼブラフィッシュ ギル毛細血管で血液の pH は、マイクロ カプセル (図 4) の投与後、少なくとも数時間の間安定したままになります。同時に招来、短期暴露は生体内で小さな魚研究法の適用性を示して、動脈血 pH の統計的に有意な減少に します。
図 4: ゼブラフィッシュ血液モニタリングの代表的な例マイクロ カプセル化染料パク-1 の蛍光スペクトルの登録によって рН です。(A)準備のマイクロ カプセルのスペクトル パク - 1 異なる ph ナトリウム リン酸バッファーに読み込まれます。(B)ナトリウム リン酸バッファーで抽出されたゼブラフィッシュの血と準備された pH 敏感なマイクロ カプセルの較正曲線。すべての測定値の平均 ± 標準偏差が描かれています。(C) 体内の監視のゼブラフィッシュ血 рН ゼブラフィッシュ ギル毛細血管でカプセル化された色素パク-1 に代表的な例。制御条件 5 分厳しい炭酸ガス (溶存の CO2の 900-1000 mg/L) の下で露出を引き起こす魚血液の酸性化をマイクロ カプセルの投与後 4 時間の間に安定して血液 pH が残っています。アスタリスクは、 p < 0.01 (マン ・ ホイットニーの U 検定) と並列制御グループから統計的に有意な差を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ゼブラフィッシュ腎臓の微粒子による注入を示すためには、インジケーター染料搭載半透過性マイクロ カプセルを使用しました。したがって、プロトコルを含む逆荷電高分子電解質7,8,15,16,17 の層によってアセンブリを使用してマイクロ カプセルの作製について ,18 (図 1 a)。この技術の利点は容易に利用可能な実験装置を実行します。条件、使用される化合物によっては、100 ナノメートル厚高分子シェル15μ m、0.5 から作製したマイクロ カプセルをわたります。合成パラメーターは約 2-6 μ m サイズ (図 1 bと 1 C) ポリマーの (最終的な生体適合性層) に加え 12 層から成る弾性マイクロ カプセルでこの原稿の結果で説明します。マイクロ カプセルのサイズを決定する最も重要なステップ テンプレート microcores の形成であります。このプロセスは、炭酸カルシウム結晶の自発の形成としたがって、得られた粒子が均一ではないです。したがって、マイクロ カプセルの粒の特性は、バッチごとに行わなければなりません。
このプロトコルの重要な段階は、マイクロマニピュレーション技術を使用せずゼブラフィッシュ循環系への微粒子の配信の最適化です。レトロな軌道注入によるセルを全体の管理は、以前詳細3に記載されています。しかし、我々 の経験では難しいレトロ軌道洞は非常に小さく、近くに咽頭、鰓弓を誤って針で怪我しやすいので、著者の説明注入効率を得るために初心者向け。1 ミリ以下から精度が必要な注射、正しく注入は大変な作業。同様に迅速かつより効率的な代替 (表 1) は、魚腎実質に直接注入することです。注入中針機械的損傷腎の毛細血管と血管を (例えば、最大後枢機卿静脈)、循環システム (図 2 e) に微粒子の入口を可能にします。最後に、大人のゼブラフィッシュのトランク腎臓の中央のふくらみが大きい顕微鏡装置なし手動注入のため十分な (2 mm アップ)。
注射針の適切な位置は、マニュアル運営の成功にとって重要です。図 2 aと 2 bに示すように、下のライトを使用して透の魚がそのまま動物のトランク腎臓を見つける練習ができます。図 2 bのスキームは、正しく注射を実行する方法を示します。血流に微粒子を管理するための手順が失敗すると、個人の生存率にほとんど影響しないと短時間フレーム内で同じ穿刺で再注入が可能です。
(大人のグッピーグッピーではテストも正常に) 大人のゼブラフィッシュのトランク腎臓への注入は許容される動物の死亡率; 魚の血流に微粒子配信の効果的な方法ただし、完全に噴射量の変化による薬剤管理に適してはありません。この手法の弱点は急速な管理のため、腹部に腎臓からソリューションの重要な漏れです。それにもかかわらず、相対的な血流に注入物質量概算できますギル毛細血管 (表 2) の可視化を使用しています。注入量の厳密な制限はありませんが、効果を発揮するサスペンションの以上 1 μ L の管理が表示されます。マイクロインジェクション; の最高級のガラス管を適用ことができます。ただし、マイクロ カプセルの数が多いは、集約を扇動する傾向がある、ので我々 は 31-29 G の使用を推奨 (Ø 0.33 0.25 mm) 鋼の針針の内腔に下駄を避けるために。
腎血流注入によるマイクロ カプセル配信の成功は、えらの蛍光粒子の存在を迅速検査を使用して監視する必要があります。えらが体内観察のしやすい臓器です。鰓は、特に便利なえらの流れ血の生体イメージングになります呼吸器上皮の薄い層で覆われて毛細血管 (自然光学窓の一種) のネットワークです。観測を実行するには、フィラメントを公開するカバー鰓軟骨を切ることができます。この手順は、魚の寿命を損なうことがなくよく曝気水の裸鰓と一緒に暮らすことができるため安全です。また、大型魚のエラは方法19外蓋を押すだけで顕微鏡下で調べることができます。成功した注入の場合、蛍光微粒子はすぐにエラ (図 3) に表示されます。注入された微粒子が循環血液量にかなり溶けると粒子数が減りギル毛細血管に到達、後魚のえらの検出のための十分な微粒子濃度の選定に注意してください。魚の腎臓 (表 2) に注入します。
注入のための手法は、小さな魚の種を含む研究の広い範囲で適用できます。技術開発・循環系への蛍光微粒子の注入用に最適化されて、にもかかわらずそれは非色マイクロ/ナノ粒子の移植への適用もできますまたは溶存物質;ただし、この場合いくつかの他の方法では注射の有効性を確認する必要があります。現在説明されている手順が最適でそのような目的のためいくつかの光学的に見えるキャリアの注入で異なる光マイクロ ・ ナノセンサー、血管の可視化、ワクチンや薬の配達を使用として生理学的監視遺伝子組み換え細胞。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
著者は大幅ビデオ プロトコルの準備のために Bogdan Osadchiy とエヴゲニイ Protasov (ロシア、イルクーツク国立大学) の助けを認めます。この研究は、基礎研究 (#15-29-01003) ロシア科学財団 (#15-14-10008) とロシア財団によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
