Une Administration simple et efficace et la visualisation de microparticules dans l’appareil circulatoire des petits poissons à l’aide d’Injection de rein

Summary

Cet article illustre les principes d’une injection rapide et mini-invasive de microparticules fluorescentes dans le circulatory system de petits poissons et de la visualisation en vivo des microparticules dans le sang du poisson.

Abstract

L’administration systémique de taille micro particules dans un organisme vivant peut être appliquée pour la visualisation du système vasculaire, drogue et administration de vaccins, implantation de cellules transgéniques et de minuscules capteurs optiques. Toutefois, des microinjections intraveineuse en petits animaux, qui sont principalement utilisés dans les laboratoires biologiques et vétérinaires, sont très difficiles et nécessitent un personnel formé. Ici, nous démontrons une méthode robuste et efficace pour l’introduction de microparticules dans le système circulatoire du adult poisson zèbre (Danio rerio) par injection dans le rein de poissons. Pour visualiser les microparticules introduites dans le système vasculaire, nous proposons une technique d’imagerie intravitale simple dans les branchies des poissons. Surveillance in vivo du poisson-zèbre pH sanguin a été accompli à l’aide d’une injection fluorescentes microencapsulés probe, SNARF-1, afin de démontrer une des applications possibles de la technique décrite. Cet article fournit une description détaillée de l’encapsulation de colorant sensibles au pH et illustre les principes de l’injection rapide et visualisation des microcapsules obtenues pour in vivo d’enregistrement du signal fluorescent. La méthode proposée d’injection se caractérise par un taux de mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible. Toutes les procédures décrites peuvent être exécutées sur d’autres espèces de petits poissons, comme les guppys et chez les sujets exposés.

Introduction

L’administration de taille micro particules dans l’organisme animal est une tâche importante dans des domaines tels que la drogue et vaccin livraison¹, système vasculaire visualisation², implantation de cellules transgéniques³et implantation de minuscules capteurs optiques ^{4 , 5}. Toutefois, la procédure d’implantation pour les particules de micro-échelle dans le système vasculaire des petits animaux de laboratoire est difficile, surtout pour les organismes aquatiques sensibles. Pour les échantillons de recherche populaires comme le poisson-zèbre, il est conseillé que ces procédures de préciser à l’aide de protocoles vidéo.

Microinjections intracardiaques et capillaires nécessitent un personnel formé et des installations de microchirurgie unique pour la livraison de microobjects dans le sang du poisson-zèbre. Auparavant, un rétro-orbitaire injection manuelle³ a été proposé comme une méthode simple et efficace pour l’administration de cellules entières. Cependant, dans notre expérience, à cause de la petite surface du réseau capillaire oeil, il faut beaucoup de pratique pour atteindre les résultats escomptés de cette technique.

Ici, on décrit une méthode pour l’implantation de microparticules robustes et efficaces dans le système circulatoire par injection manuelle directement dans le tissu rénal du poisson-zèbre adulte, qui est riche en capillaires et de vaisseaux rénaux. Cette technique est basée sur le protocole vidéo greffe de cellules dans le poisson-zèbre rein⁶, mais les opérations microchirurgicales traumatiques et beaucoup de temps ont été éliminées. La méthode proposée se caractérise par une mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible.

Une partie importante du protocole proposé est la visualisation de l’implanté microparticules (s’ils sont fluorescents ou colorisée) dans les capillaires de gill, qui permet la vérification de la qualité de l’injection, une évaluation approximative relative du nombre de injection de particules et la détection du signal spectral pour mesures physiologiques directement à partir de la circulation sanguine. Par exemple des applications possibles de la technique décrite, nous démontrons le protocole pour des mesures in vivo du poisson-zèbre pH du sang à l’aide d’une sonde fluorescente microencapsulée, SNARF-1, initialement suggéré dans Borvinskaya et al. 2017⁵.

Protocol

Toutes les procédures expérimentales ont été menées conformément à la Directive européenne 2010/63/UE pour l’expérimentation animale et ont été approuvés par l’Animal sujets recherche Comité d’Institut de biologie à l’Université d’état d’Irkoutsk. 1. fabrication de Microcapsules Remarque : Les Microcapsules transportant un colorant fluorescent sont préparés à l’aide d’une couche par couche de charge opposée polyélectrolytes<sup cl…

Representative Results

Les résultats obtenus proviennent d’un des trois principales catégories du protocole présenté : la formation de microparticules fluorescentes par encapsulation d’un colorant fluorescent (Figure 1), l’injection de rein de microcapsules avec davantage de visualisation dans branchies capillaires (Figure 2 et 3) et, enfin, l’in vivo spectrale enregistrement de fluorescence SNAR…

Discussion

Pour illustrer l’injection de microparticules dans les reins de poisson-zèbre, nous avons utilisé semi-perméable microcapsules chargées avec un colorant indicateur. Ainsi, le protocole contient des instructions pour la fabrication de microcapsules à l’aide de l’Assemblée de couche par couche de charge opposée polyélectrolytes^{7,8,15,16,17 ,<…}

Materials

SNARF-1-dextran, 70000 MW	Thermo Fisher Scientific	D3304	Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA)	SIGMA	A9771	Fluorescent probe
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran)	SIGMA	R9379	Fluorescent probe
Calcium chloride	SIGMA	C1016	CaCO3 templates formation
Sodium carbonate	SIGMA	S7795	CaCO3 templates formation
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH)	SIGMA	283215	Cationic polymer
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS)	SIGMA	243051	Anionic polymer
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG)	SuSoS	PLL(20)-g[3.5]-PEG(5)	Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules
Sodium chloride	SIGMA	S8776	To dissolve applied polymers
Water Purification System	Millipore	SIMSV0000	To prepare deionized water
Magnetic stirrer	Stegler		For CaCO3 templates formation
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL	Eppendorf		Dosing solutions
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL	F.L. Medical	28093	Dosing solutions
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL	Eppendorf	Z640069	Dosing solutions
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed	BioSan		For microcapsule centrifugation-washing procedure
Microcentrifuge tubes, 2 mL	Eppendorf	Z666513	Microcapsule synthesis and storage
Shaker Intelli-mixer RM-1L	ELMY Ltd.		To reduce microcapsule aggregation
Ultrasonic cleaner			To reduce microcapsule aggregation
Head phones			To protect ears from ultrasound
Ethylenediaminetetraacetic acid	SIGMA	EDS	To dissolve the CaCO3 templates
Monosodium phosphate	SIGMA	S9638	Preparation of pH buffers
Disodium phosphate	SIGMA	S9390	Preparation of pH buffers
Sodium hydroxide	SIGMA	S8045	To adjust the pH of the EDTA solution and buffers
Thermostat chamber			To dry microcapsules on glass slide
Hemocytometer blood cell count chamber			To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules
Fluorescent microscope Mikmed 2	LOMO		In vivo visualization of microcapsules in fish blood
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided)	Chroma	79010	Visualization of microcapsules with fluorescent probes
Fiber spectrometer QE Pro	Ocean Optics		Calibration of microcapsules under microscope
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m	Ocean Optics		To connect spectrometer with microscope port
Collimator F280SMA-A	Thorlabs		To connect spectrometer with microscope port
Glass microscope slide	Fisherbrand	12-550-A3	Calibration of microcapsules under microscope
Coverslips, 22 x 22 mm	Pearl	MS-SLIDCV	Calibration of microcapsules under microscope
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL	Blaubrand	BR708709	To collect fish blood
Clove oil	SIGMA	C8392	Fish anesthesia
Lancet No 11	Apexmed international B.V.	P00588	To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector
Heparin, 5000 U/mL	Calbiochem	L6510-BC	For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode	Mettler Toledo		To determine fish blood pH
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm	Becton, Dickinson and Company		For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate
Glass capillaries, 1 x 75 mm	Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co	9201075	For injection procedure
Gas torch			To solder steel needle to glass capillary
Microinjector IM-9B	NARISHIGE		For precise dosing of microcapsules suspension
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene	SIGMA	P5481	For manipulations with fish under anesthesia
Plastic spoon			For manipulations with fish under anesthesia
Damp sponge			For manipulations with fish under anesthesia
Dissection scissors	Thermo Scientific	31212	To remove the gill cover from the fish head
Pasteur pipette, 3.5 mL	BRAND	Z331767	To moisten fish gills