Simple y eficaz administración y visualización de micropartículas en el sistema circulatorio de peces pequeños con inyección de riñón
Summary
Este artículo demuestra los principios de una inyección rápida, mínimamente invasiva de micropartículas fluorescentes en el circulatory system de peces pequeños y la visualización en vivo de las micropartículas en sangre de peces.
Abstract
La administración sistémica de tamaño de micro partículas en un organismo vivo puede aplicarse para la visualización de la vasculatura, drogas y vacunas entrega, implantación de células transgénicas y diminutos sensores ópticos. Sin embargo, microinyecciones intravenosa en animales pequeños, que se utilizan principalmente en laboratorios biológicos y veterinarios, son muy difíciles y requieren de personal capacitado. Aquí, demostramos un método robusto y eficiente para la introducción de micropartículas en el sistema circulatorio del adulto pez cebra (Danio rerio) por inyección en el riñón de peces. Para visualizar las micropartículas introducidas en la vasculatura, proponemos una simple técnica de imagen intravital en branquias de peces. En vivo monitoreo del pH de sangre del pez cebra se logró mediante un fluorescente microencapsulado inyectado sonda, SNARF-1, para demostrar una de las posibles aplicaciones de la técnica descrita. Este artículo proporciona una descripción detallada de la encapsulación de tinte pH-sensible y demuestra los principios de la inyección rápida y visualización de las microcápsulas obtenidas para la grabación en vivo de la señal fluorescente. El método de inyección propuesto se caracteriza por una tasa de mortalidad baja (0-20%) y alta eficiencia (70-90% de éxito) y es fácil de Instituto con equipamiento disponible comúnmente. Pueden realizarse todos los procedimientos descritos en otras especies de peces pequeños, como lebistes y medaka.
Introduction
La administración de partículas micro-tamaño en un organismo animal es una tarea importante en áreas tales como drogas y vacunas entrega1, vasculatura visualización2, célula transgénica implantación3e implantación minúsculo sensor óptico 4 , 5. sin embargo, el procedimiento de implantación para las partículas de la microescala en el sistema vascular de los animales de laboratorio pequeños es difícil, especialmente para los organismos acuáticos delicados. Para muestras de investigación populares como el pez cebra, se recomienda que estos procedimientos aclararse utilizando protocolos de videos.
Intracardiacos y capilares microinjertos requieren microcirugía únicas instalaciones y personal capacitado para la entrega de microobjects en sangre de pez cebra. Previamente, una inyección manual retro orbital3 fue sugerido como un método fácil y eficaz para la administración de células enteras. Sin embargo, en nuestra experiencia, debido a la pequeña área de la red capilar del ojo, toma mucha práctica para lograr el resultado deseado de esta técnica.
Adjunto, describimos un método para la implantación de micropartículas sólidas y eficientes en el sistema circulatorio por inyección manual directamente en el tejido del riñón del pez cebra adulto, que es rico en capilares y los vasos renales. Esta técnica se basa en el protocolo de video para la célula en el pez cebra riñón6, pero fueron eliminados los pasos microcirugía traumáticos y requiere mucho tiempo. El método propuesto se caracteriza por la baja mortalidad (0-20%) y alta eficiencia (70-90% de éxito) y es fácil de Instituto con equipamiento disponible comúnmente.
Una parte importante del protocolo propuesto es la visualización de las implantados micropartículas (si son fluorescentes o coloreada) en los capilares branquiales, que permite la verificación de la calidad de la inyección, una evaluación relativa aproximada del número de las partículas inyectadas y la detección de la señal espectral para medidas fisiológicas de la sangre circulante. Como ejemplo de las posibles aplicaciones de la técnica descrita, demostramos el protocolo para la medición en vivo de pH de la sangre del pez cebra con una sonda fluorescente microencapsulada, SNARF-1, originalmente sugerido en Borvinskaya et al. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para demostrar la inyección de micropartículas en el riñón del pez cebra, utilizamos microcápsulas semipermeables cargadas con un colorante indicador. Así, el protocolo contiene las instrucciones para la fabricación de las microcápsulas con el conjunto de capa por capa de polielectrolitos cargados opuestamente7,8,15,16,17 ,<sup class="xref"…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores reconocen grandemente la ayuda de Bogdan Osadchiy y Evgenii Protasov (Universidad Estatal de Irkutsk, Rusia) en la preparación del Protocolo de video. Esta investigación fue apoyada por la Fundación rusa de la ciencia (#15-14-10008) y la Fundación rusa de investigación básica (#15-29-01003).
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
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