Простое и эффективное управление и визуализация микрочастиц в системе кровообращения малых рыб с помощью инъекций почек
Summary
Эта статья демонстрирует принципы быстро, миниинвазивная инъекции флуоресцентные микрочастиц в circulatory system рыбки и визуализации в vivo микрочастиц в крови рыб.
Abstract
Системного администрирования микро размера частиц в живой организм может применяться для визуализации сосудистую, наркотиков и вакцинации, имплантации крошечные оптических датчиков и трансгенных клеток. Однако внутривенного введения микроинъекций в мелких животных, которые в основном используются в биологических и ветеринарных лабораторий, очень сложны и требуют квалифицированного персонала. Здесь мы демонстрируем надежный и эффективный метод для введения микрочастиц в кровеносную систему взрослых рыбок данио (Danio рерио) путем инъекций в рыбы почек. Чтобы визуализировать введено микрочастиц в сосудистую, мы предлагаем простой метод прижизненной визуализации в жабры рыбы. В естественных условиях мониторинг pH крови данио рерио была выполнена с использованием вводят Микрокапсулированный флуоресцентный зонд, SNARF-1, чтобы продемонстрировать один из возможных применений описанные методики. Эта статья содержит подробное описание инкапсуляции рН чувствительных красителя и демонстрирует принципы быстрой инъекции и визуализации полученных микрокапсулы для записи в vivo флуоресцентного сигнала. Предложенный метод впрыска характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования. Все описанные процедуры можно выполнять на других мелких рыб, таких как гуппи и оризии.
Introduction
Администрация микро размера частиц в организм животных является одной из важных задач в таких областях, как наркотиков и доставки вакцины1, сосудистую визуализации2, трансгенными ячейку имплантации3и имплантации крошечные оптический датчик 4 , 5. Однако, трудно процедура имплантации микромасштабной частиц в сосудистой системе мелких лабораторных животных, особенно для деликатной водных организмов. Для популярных исследований образцов как данио рерио, он сообщил, что эти процедуры необходимо уточнить с помощью видео протоколов.
Внутрисердечной и капиллярной микроинъекций требуют квалифицированного персонала и уникальных микрохирургии зал для доставки microobjects в zebrafish кровь. Ранее ретро орбиталь ручной инъекций3 было предложено как простой и эффективный метод для управления всей клетки. Однако по нашему опыту, из-за небольшой площади глаз капиллярной сети, это занимает много практики для достижения желаемых результатов от этого метода.
Здесь мы описываем метод для надежной и эффективной микрочастица имплантации в кровеносную систему путем ручной инъекции непосредственно в ткани почек взрослых рыбок данио, который богат капилляров и почечных сосудов. Эта техника основана на протоколе видео для трансплантации клеток в zebrafish почек6, но болезненным и длительным микрохирургическое шаги были ликвидированы. Предложенный метод характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования.
Важной частью предлагаемого протокола является визуализация имплантированных микрочастиц (если они флуоресцентные или раскрашенная) в капиллярах Гилл, который позволяет для проверки качества инъекции, грубый относительной оценки числа вводят частицы и обнаружение спектрального сигнала для физиологических измерений непосредственно из циркулирующей крови. В качестве примера возможных применений описаны методики, мы демонстрируем протокол для измерений в vivo данио рерио рН крови с помощью Микрокапсулированный флуоресцентного зонда, SNARF-1, первоначально предложенных в Borvinskaya и др. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чтобы продемонстрировать инъекции микрочастиц в почках данио рерио, мы использовали полупроницаемой микрокапсулы, загружен с красителем индикатора. Таким образом в протоколе содержатся инструкции для изготовления микрокапсулы, используя слой за слоем Ассамблея противоположно заря?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы признают значительно помощью Богдан Осадчий и Евгений Протасов (Иркутский государственный университет, Россия) в рамках подготовки видео протокола. Это исследование было поддержано Российского научного фонда (#15-14-10008) и российского фонда фундаментальных исследований (#15-29-01003).
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. . ImageJ User Guide – Version 1.44. , (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
