Summary
Эта статья демонстрирует принципы быстро, миниинвазивная инъекции флуоресцентные микрочастиц в circulatory system рыбки и визуализации в vivo микрочастиц в крови рыб.
Abstract
Системного администрирования микро размера частиц в живой организм может применяться для визуализации сосудистую, наркотиков и вакцинации, имплантации крошечные оптических датчиков и трансгенных клеток. Однако внутривенного введения микроинъекций в мелких животных, которые в основном используются в биологических и ветеринарных лабораторий, очень сложны и требуют квалифицированного персонала. Здесь мы демонстрируем надежный и эффективный метод для введения микрочастиц в кровеносную систему взрослых рыбок данио (Danio рерио) путем инъекций в рыбы почек. Чтобы визуализировать введено микрочастиц в сосудистую, мы предлагаем простой метод прижизненной визуализации в жабры рыбы. В естественных условиях мониторинг pH крови данио рерио была выполнена с использованием вводят Микрокапсулированный флуоресцентный зонд, SNARF-1, чтобы продемонстрировать один из возможных применений описанные методики. Эта статья содержит подробное описание инкапсуляции рН чувствительных красителя и демонстрирует принципы быстрой инъекции и визуализации полученных микрокапсулы для записи в vivo флуоресцентного сигнала. Предложенный метод впрыска характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования. Все описанные процедуры можно выполнять на других мелких рыб, таких как гуппи и оризии.
Introduction
Администрация микро размера частиц в организм животных является одной из важных задач в таких областях, как наркотиков и доставки вакцины1, сосудистую визуализации2, трансгенными ячейку имплантации3и имплантации крошечные оптический датчик 4 , 5. Однако, трудно процедура имплантации микромасштабной частиц в сосудистой системе мелких лабораторных животных, особенно для деликатной водных организмов. Для популярных исследований образцов как данио рерио, он сообщил, что эти процедуры необходимо уточнить с помощью видео протоколов.
Внутрисердечной и капиллярной микроинъекций требуют квалифицированного персонала и уникальных микрохирургии зал для доставки microobjects в zebrafish кровь. Ранее ретро орбиталь ручной инъекций3 было предложено как простой и эффективный метод для управления всей клетки. Однако по нашему опыту, из-за небольшой площади глаз капиллярной сети, это занимает много практики для достижения желаемых результатов от этого метода.
Здесь мы описываем метод для надежной и эффективной микрочастица имплантации в кровеносную систему путем ручной инъекции непосредственно в ткани почек взрослых рыбок данио, который богат капилляров и почечных сосудов. Эта техника основана на протоколе видео для трансплантации клеток в zebrafish почек6, но болезненным и длительным микрохирургическое шаги были ликвидированы. Предложенный метод характеризуется низкой смертности (0-20%) и высокая эффективность (70-90% успеха) и это легко институт с помощью обычно доступных оборудования.
Важной частью предлагаемого протокола является визуализация имплантированных микрочастиц (если они флуоресцентные или раскрашенная) в капиллярах Гилл, который позволяет для проверки качества инъекции, грубый относительной оценки числа вводят частицы и обнаружение спектрального сигнала для физиологических измерений непосредственно из циркулирующей крови. В качестве примера возможных применений описаны методики, мы демонстрируем протокол для измерений в vivo данио рерио рН крови с помощью Микрокапсулированный флуоресцентного зонда, SNARF-1, первоначально предложенных в Borvinskaya и др. 20175.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры были проведены в соответствии с директивой ЕС 2010/63/ЕС для экспериментов на животных и были одобрены животное темам исследований Комитета из Института биологии Иркутского государственного университета.
1. Изготовление микрокапсулы
Примечание: Микрокапсулы, ношение флуоресцентные краски готовятся с использованием слой за слоем Ассамблеи противоположно заряженных полиэлектролитов7,8. Все процедуры были выполнены при комнатной температуре.
- Для синтеза пористых СаСО3 microcores, включающего Люминесцентную краску, смешайте 2 мл раствора SNARF-1-декстрана (большинство полимер прыгните Люминесцентную краску например FITC-BSA могут использоваться) в концентрации ~ 2 мг/мл с 0,6 мл каждого из решений CaCl2 1 моль/Л и Na2CO3 под быстро помешивая.
Примечание: Обратить внимание на различные чувства флуоресцентных красителей в Фотообесцвечивание; Если используется светочувствительные флуоресцентного зонда (как SNARF-1), манипулирования и хранения микрочастиц должны выполняться с как мало света как можно скорее. - После 5-10 s агитации, передать подвеска 2 мл microcentrifuge трубы и центрифуги для 15 s на 10000-12000 g для пеллет СаСО3 microcores.
- Отменить супернатанта, мыть ядер с ~ 2 мл деионизированной воды и Ресуспензируйте гранулы путем встряхивания.
- Повторите процедуру центрифугирования промывание три раза в общей сложности. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
- Инкубируйте microcores за 1 мин в ультразвуковой ванне для уменьшения их агрегирования.
Предупреждение: Не забудьте защитить уши с наушниками. - Внести первый полимерный слой на шаблоны, Ресуспензируйте ядер в ~ 2 мл 4 мг/мл раствора poly(allylamine hydrochloride) (ПАУ) в 1 моль/Л NaCl.
- Держите microcores в растворе для ~ 5 мин при постоянном встряхивании.
- После 15 s центрифугирования, удалить супернатант с несвязанных ПАУ. Вымойте покрыты microcores с дейонизированной водой по крайней мере 3 раза через несколько центрифугирования и мытье шаги. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
- Инкубируйте microcores за 1 мин в ультразвуковой ванне для уменьшения их агрегирования.
Примечание: Если прикладной флуоресцентного красителя катионного, начните с поли (натрия 4-styrenesulfonate) (PSS) в 1 моль/Л NaCl (см. шаг 1.7).
- Повторите шаг 1.6 с ~ 2 мл 4 мг/мл раствора PSS (также содержащие 1 моль/Л NaCl) для депозита второй полимерный слой на шаблоны.
- Повторите шаги 1.6 и 1.7 шесть раз депозита 12 полимерные слои.
Примечание: Не рекомендуется сделать длинный перерыв (~ 12 ч или больше) в процедуре до ~ 3-5 слоев сдали потому что СаСО3 microcores без покрытия могут, как правило, recrystallize. Обратите внимание, что PSS покрытие вызывает выше агрегации microcores, и долгой паузы рекомендуется только тогда, когда ПАУ или поли L-лизин привитый с полиэтиленгликоля (PLL-g-PEG) является исключительно слой. - Проинкубируйте покрыты microcores в 2 мг/мл PLL-g ПЭГ (~ 1 мл микропробирок) для по крайней мере 2 ч.
- Мыть microcores с водой через последовательные центрифугирования и ресуспендирования шаги. После последнего центрифугирования удалить супернатант.
- Чтобы получить полые микрокапсулы, Растворите СаСО3 шаблоны, добавив 2 мл раствора 0,1 моль/Л Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) (с учетом рН 7,1 с NaOH) покрыты microcores.
- После ~ 5 минут инкубации, центрифуга микрокапсулы для 45 s и удалить супернатант с ЭДТА.
- Повторите шаги 1.10-1.10.1 дважды.
- Вымойте микрокапсулы с 0,9% NaCl три раза через несколько центрифугирования шаги в пределах 45 s следуют мытья шаги. После последнего шага центрифугирования удалить супернатант.
Примечание: Окончательный микрокапсульная раствор для инъекций должны храниться стерильные (например, путем добавления ампициллин, 0,1 мг/мл), и средства массовой информации должны быть биологически совместимого с целью расследования (изотонические СМИ с нейтральным pH). - Оценки концентрации подготовленных микрокапсулы в Горяева под флуоресцентным микроскопом. Сделать серию фотографий микрокапсулы, измерить диаметр о ста микрокапсулы, используя ImageJ9 или эквивалент программного обеспечения и исследовать распределение по размерам, с помощью гистограммы.
- Хранилища, полученные инкапсулированные зонд в темноте.
Примечание: после нескольких стирок в стерильного 0,9% NaCl, микрокапсулы могут храниться месяцами при 4 ° C. Полного высыхания микрокапсулы во время хранения не рекомендуется.
2. Подготовка оптические установки и калибровки Микрокапсулированный SNARF-1
Примечание: Грубая рН измерения с микрокапсулами SNARF-1 могут быть сделаны с использованием изображений в двух каналах флуоресцентный Микроскоп7, но в настоящем Протоколе, один одноканальной флуоресцентный Микроскоп связаны волоконно-спектрометр был применен.
- Установите необходимый набор фильтров флуоресценции флуоресцентный Микроскоп согласно характеристикам применяемых Люминесцентную краску и включите люминесцентных ламп.
- Вытяните рычаг окуляры.
Предупреждение: Избыток света может повредить спектрометр матрицы. Таким образом убедитесь, что рычаг находится в режиме «окуляр», когда не используется спектрометр. - Подключите один конец волоконно-оптических спектрометр и другой конец к коллиматора. С помощью адаптеров, место коллиматор в фокус камеры трубки или другой доступный порт флуоресцентный Микроскоп.
- Включите спектрометр. Запустите программу управления спектрометр и подготовить спектрометр для измерений.
- Вытяните рычаг окуляры.
- Для калибровки микрокапсульная партии место ~ 5 мкл микрокапсульная подвески (~ 10 000 микрокапсулы за мкл в деионизированной воде) на слайде микроскопа и сухой капли в темном месте (например, в термостат при температуре 35 ° C).
- Для калибровки спектральные характеристики Микрокапсулированный SNARF-1, используйте серию буферов с различными pH в диапазоне ~ 6-9. Падение ~ 10 мкл буфера на сушеные микрокапсулы с SNARF-1-декстран и покрывают его с coverslip.
- Место стеклянное скольжение на микроскопа. Найдите микрокапсулы, используя × 40 цель.
- Поверните рычаг Микроскоп к порту камеры. Зарегистрируйте их флуоресценции с помощью спектрометра. Поверните рычаг обратно в окуляры.
Примечание: Убедитесь, что спектральная сигнал выходит далеко за рамки фонового уровня и убедитесь что микрокапсулы в поле зрения не в пузырь (путем переключения на нижней увеличение при необходимости). Избегайте длительного освещения же микрокапсулы. SNARF-1 чувствителен к Фотообесцвечивание. - Повторите шаг 2.2.3 для различных микрокапсулы 10 - 15 раз.
- Рассчитать коэффициенты пика флуоресценции (например, с помощью R или Scilab) для всех зарегистрированных спектров и определить линии регрессии между средний коэффициент (для каждого буфера) и Средний рН, по следующей формуле:
Примечание: SNARF-1 имеет спектр с двумя пиками, соответствующих выбросов протонированных и депротонированная красителя, и соотношение между пиками реагировать рН среды. В этом исследовании используется соотношение между интенсивностью флуоресценции для 605 и 660 нм. Эти длины волн выбираются в зависимости от используемых набор фильтров. и b являются коэффициенты определяются нелинейной регрессии (например, с помощью R). Значения, 0,15 и 1.1 являются, соответственно, минимальное и максимальное значения я605/iий660 наблюдается во время калибровки. - Соберите около 10 мкл крови рыб от приблизительно 5 взрослых животных. Место рыбы в чашке Петри с 1 мкл/мл воды подвеска гвоздичное масло для анестезии и подождать до тех пор, пока животное оказывается на его стороне и перестает отвечать на щепотки плавника (обычно ~ 2-3 мин). Передача рыбы на стеклянное скольжение. Отрезать хвост рыбы с стрельчатые и собирать примерно 2 мкл крови рыб из Вены хвост.
Примечание: Для предотвращения свертывания крови, лечить разрез с гепарином (5000 ед/мл) и использовать гепаринизированным стеклянные капилляры и microcentrifuge трубки для сбора крови.- Капельного около 10 мкл крови с пипеткой на кончик микроэлектродные и определить с помощью рН метр pH.
- Капля крови на слайд с микрокапсулами сушеные и зарегистрировать отношение интенсивности флуоресценции, как описано для калибровки буферов (шаги 2.2-2.3).
- Отрегулируйте коэффициент линейной калибровочной кривой сделать кривой соответствуют измерениям в крови рыбы (для более подробную информацию см. Borvinskaya et al. 20175).
3. подготовка для инъекций
- Выпуск стальной иглой от кончика инсулина пера (или шприц), удалив пластиковые с острым Ланцет.
Примечание: Любой тонкой иглой (Ø0.33 мм или меньше) или стеклянные капиллярные (обычно Ø1 мм) могут быть подготовлены для микроинъекции10,11. - Вставьте иглу на полпути в микрокапиллярной стекла; быстро и аккуратно спаять его с помощью газовой горелки.
- Подключите микрокапиллярной стекла к microinjector и промыть стерильной водой три раза. Убедитесь, что жидкость течет через иглу.
- Заполните систему с дистиллированной водой.
Примечание: Убедитесь, что в системе существует никаких пузырей.
4. инъекции
- Ресуспензируйте подготовленный подвеска микрокапсулы (стерильного 0,9% NaCl, или любые другие средства массовой информации используются для инъекций, с концентрацией 0,5 до 6 миллионов микрокапсулы в микролитр) с помощью Ультразвуковая ванна на 1 мин.
Примечание: Поскольку микрокапсулы, как правило, осадок, во время следующей инъекции, встряхните флакон с микрокапсулами механически (с помощью ротора) или вручную каждые несколько минут, чтобы Ресуспензируйте их и предотвращать их агрегирования. - Место рыбы в чашке Петри с анестетиком (0,1 мл/Л масла гвоздики, взвешенных в воде) ~ 2-3 минут ждать пока рыба превращается на его стороне и перестает отвечать на легкий Пинч плавника.
- С помощью ложки, передача рыбы из анестетиков и осторожно поместите его на влажной губкой в боковой позиции с головой влево (для правша) или вправо (для левшей человека).
- Как раз перед инъекцией сосать 1-2 мм воздуха в стеклянный капилляр связаны с microinjector. Затем загрузите его с приблизительно 2 мкл дисперсной микрокапсулы.
Примечание: Перед инъекцией, микрокапсульная решения должны быть скорректированы до температуры, на котором хранятся рыбы. - Аккуратно стабилизируйте тело рыбы на губку с недоминирующей руки.
- Найти боковой линии рыб. Мысленно выделите сегмент, который простирается от крышечки до конца брюшной полости. Найти в середине этого сегмента. Положите иглы 1 мм ниже в вентральной направлении.
- Соскоб движением аккуратно переместите Рыба весы в сторону и сделать прокол. Вставьте иглу в тело под углом 45° к поверхности стола.
- Вставьте иглу к позвоночника до тех пор, пока он тщательно лежит против него.
- Выпуск примерно 1 мкл суспензии микрокапсулы в почках и медленно снять иглу.
Примечание: Чтобы найти надлежащее прокол сайт более легко, полезно практике найти ствол почек, к рыб, используя свет снизу, как показано на рис. 2A и 2B.
- Промывайте рыбу от головы до хвоста с потоком воды, чтобы удалить любые пролитой микрокапсулы в месте инъекции.
5. Визуализация в естественных условиях
- Используйте ножницы рассечение, чтобы удалить жаберной крышки из головы рыбы и оголять жабры рыбы. Промывайте жабры с водой.
- С помощью ложки, передача рыбы для микроскопа и поместите его на сцене флуоресцентный Микроскоп.
Примечание: Убедитесь, что жабры рыбы не высохнуть в течение последовательных процедур. Чтобы избежать этого, периодически смачивают их водой с помощью пипетки Пастера (примерно каждые 1-2 мин). - Затемнить номер и используя низкий масштаб (x 10 цель) осмотрите жабры найти флуоресцентные микрокапсулы.
Примечание: При процедуре используется для внедрения некоторых флуоресцентные частицы в рыбы сердечно-сосудистой системы, рекомендуется проверять жабры нескольких лиц для неожиданных флуоресцентные частицы до инъекции. Жабры данио рерио одичал типа не имеют аутофлюоресценция, но в некоторых случаях отдельные флуоресцентные частицы (как куски пищи или одноклеточные симбионтами) могут присутствовать на жабры. При необходимости, такие частицы могут быть признаны на основании их определенной формы (например, куски пищи имеют неправильную форму, в отличие от сферического микрокапсулы) или спектр флуоресценции (то есть, цвет).- Переключитесь выше величины (цель × 40) объектив и положение микрокапсульная или группы микрокапсулы в центре поля зрения.
- Поверните рычаг в порт с подключенного спектрометр. Запись спектрального сигнала.
- Поверните рычаг обратно в окуляр.
- Повторите измерения для различных микрокапсулы несколько раз.
- Трансфер рыбы в аквариуме с надлежащей аэрации для восстановления.
Примечание: С минимальной практике, это возможно для выполнения инъекций и сигнал записи с приблизительной скоростью 2-3 мин на рыбу. Измерение может быть повторен для отдельных несколько раз с использованием повторных доз низкой, безвредные анестезии или другой метод фиксации. Для долгосрочного наблюдения используйте систему с непрерывной анестезии12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Полученные результаты приходят от одного из трех основных категорий представленных протокола: формирование флуоресцентный микрочастиц путем инкапсуляции флуоресцентные краски (рис. 1), почки инъекции микрокапсулы с дальнейшей визуализации в Джилл капилляров (рис. 2 и 3) и, наконец, в естественных условиях спектральная записи SNARF-1 флуоресценции для мониторинга рН крови (рис. 4).
Слой за слоем подход с использованием покрытия шаблон СаСО3 ядер, ограждающих краску в несколько слоев противоположно взимается полимеров (ПАУ и PSS) и внешний слой Биосовместимых полимеров (PLL-g-PEG) является простой и экономически эффективный метод разрешение для инкапсуляции различных флуоресцентных зондов SNARF-1-декстрана, FITC-BSA или других (рис. 1A). В результате полые микрокапсулы о Микрометрический размер с стабильной полупроницаемой упругих оболочек и загружается с Люминесцентную краску получаются (рис. 1B). Микрокапсулы, сфабрикованы этой техники обычно неоднородной, с нормальным распределением размера частиц и характерные медианный размер в каждом пакете (рис. 1С).
Рисунок 1 : Слой за слоем синтез и характеристика полые полиэлектролит микрокапсулы, загружен с флуоресцентной краской. (A) схема микрокапсулы Ассамблеи (извлечь из аналогичной схемы опубликованных в Гуркова et al. 20164). (B) картину полые микрокапсулы загружен с Люминесцентную краску FITC-BSA. (C) размер характеристику партии микрокапсулы от Рисунок 1B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Надежные и эффективные микрочастица имплантации в системе кровообращения малых рыб может осуществляться вручную инъекции прямо в рыбы почек. Прокол в нужный сайт тела рыбы (ствол почек) имеет решающее значение для быстрой доставки микрочастиц путем ручной инъекции. Почек рыбы гемопоэтических органа и содержит пигментные меланофоров, и таким образом, она хорошо окрашена. Потому что это nestled между прозрачным палаты плавательный пузырь, это легко определить орган в нетронутыми животное с Слабая пигментация или путем просвечивания рыбки с помощью источника света снизу, как показано на рисунке 2A и 2B.
Рисунок 2 : Локализация правильного сайта для инъекций почек. (A) транс подсветка данио рерио демонстрирует локализации ствола почек (стрелка). (B) схема показывает, как определить надлежащее прокол сайта. Белый пунктирная линия указывает боковая линия абдоминальный сегмент рыбы. Стрелка указывает на сайте для прокола и правильное направление подачи к позвоночника. Плавательный пузырь обозначается зеленой линии. (C) визуализация данио рерио почек после удаления органов и стенки тела. Стрелка указывает на центральный балдж ствола почек. (D) сагиттальной гистологические раздел D. рерио иллюстрирует общее анатомии внутренних органов взрослых рыб (H & E пятно). (E) Микрофотография рыбы почек (пунктир) масштабируется от (D) с стрелкой к Люмене задняя кардинал вен. Звездочки показывают плавательный пузырь. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Чтобы проверить успех процедуры инъекции, быстрый визуальный осмотр жабры при низком увеличении (x10-20 цель) следует после резки рыбы жаберной крышки (рис. 3A). Несмотря на большую часть микрокапсулы, оставаясь на месте инъекции или разлив в полости тела (рис. 3B) если инъекции выполняется правильно, это можно наблюдать флуоресцентные микрокапсулы, свободно плавающих в капиллярах Гилл оголенный рыб жабры сразу после инъекции (рис. 3 c). Если не флуоресцентные частицы будут обнаружены в жабры, это можно повторять инъекции в пункционная же. Успешная доставка в кровь должна быть получена в примерно 70-90% всего вводили рыб.
Рисунок 3 : Почки инъекции микрокапсулы с дальнейшей визуализации в капиллярах Гилл. (A) общая схема микрокапсульная доставки в zebrafish кровоток. (B) флуоресцентного изображения данио рерио после инъекции микрокапсулы с зеленым красителем FITC-BSA (пункция сайт обозначается стрелкой). (C) эта картина жабры рыбы, масштабируются от (B), демонстрирует успешной доставке микрокапсулы впрыской почек (жабры одичал тип данио рерио имеют не аутофлюоресценция). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Во время инъекции непосредственно в ствол почек рыбы обширные кровоподтеки обычно образует под сайт прокол, указывает на повреждения паренхимы капилляров или почечных сосудов. Существует никакой утечки крови из организма, потому что прокол, по-видимому, быстро контракта. Несмотря на внутреннее кровотечение, люди все еще можете восстановить с примерно 80-90% выживших через процедуру (Таблица 1). Известно также, что рыб может регенерировать нефронов de novo после травмы13,14. Если более 20% рыбы умирают, один необходимо убедиться, что анестезии выполняется должным образом.
| Инкапсулированные Люминесцентная краска | n | Концентрация, микрокапсулы за мкл | Объем впрыска, мкл | Средний диаметр микрокапсулы, мкм | Успешная доставка в кровоток рыбы, % | Смертности после инъекции, % | |
| 1 ч | 1 день | ||||||
| Инъекция в багажнике почек | |||||||
| FITC-BSA | 36 | 4 x 10-6 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF-1-декстрана | 29 | 3-6 x 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| Ритц декстрана | 20 | 6 x 10-6 | 2 | 2,0 | 70 | 0 | 0 |
| 0,9% NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| Ретро орбиталь инъекций | |||||||
| FITC-BSA | 9 | 1 х 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| Ритц декстрана | 11 | 6 x 10-6 | 1 | 2,0 | 9 | 18 | 0 |
Таблицы 1. Безопасность и эффективность доставки микрокапсулы в кровоток данио рерио. Успех процедуры определяется наличие флуоресцентных материалов в капиллярах жабры рыбы.
Если концентрация вводят микрочастицы недостаточно, слишком мало частицы могут быть доступны для быстрого отображения в жабры рыбы. В то же время подвеска с слишком высокая концентрация может засорить иглы. В случае слой за слоем собрал микрокапсулы с средний диаметр ~ 2-5 мкм концентрация примерно 4 * 10-5-6 * 106 микрокапсулы за мкл является оптимальным для легкого обнаружения в жабры рыб после инъекции в рыбы почек (таблицы 2).
| Концентрация, микрокапсулы за мкл | Количество микрокапсулы в Микроскоп поля зрения (цель × 20) в жабры разных людей (n = 7 процентов концентрации) | ||||||
| 4 x 10-6 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 10-4 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 10-3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
В таблице 2. Запись из визуальный подсчет FITC-BSA-содержащих микрокапсулы в D. рерио жабры после инъекции (1.6 мкл) в ствол почек.
Предложенный метод имплантации микрочастицы в кровеносную систему рыбы может применяться в естественных условиях мониторинг pH крови данио рерио Микрокапсулированный флуоресцентный зонд, SNARF-1 (рис. 4). SNARF-1 имеет спектр с двумя пиками, соответствующих выбросов протонированных и депротонированная краситель (Рисунок 4A), таким образом калибровочных кривых соотношение между пиками на различных рН средства массовой информации могут быть нанесены (Рисунок 4B). Компоненты крови влияние индикации инкапсулированные SNARF-1 (рис. 4B), которая может оцениваться экспериментально одновременное измерение pH крови микрокапсул и рН метр с микроэлектродные стекла. Предполагаемого Калибровочная кривая для микрокапсулы в zebrafish крови следует заговор, сдвигая кривую буферы коэффициент, равный разнице рН измеряется экспериментально (см. Borvinskaya et al. 20175 для подробной информации).
РН крови в капиллярах Гилл данио рерио остается стабильной в течение по крайней мере несколько часов после инъекции микрокапсулы (рис. 4 c). В то же время короткие гиперкапнических воздействие приводит к статистически значимое снижение рН крови, который демонстрирует применимость метода в vivo исследований на мелких рыб.
Рисунок 4 : Пример мониторинга данио рерио крови РН по регистрации спектров флуоресценции Микрокапсулированный краска SNARF-1. (A) спектры подготовленных микрокапсулы загружен с SNARF-1 в буферах фосфат натрия при разных значениях рН. (B) калибровочные кривые подготовленных микрокапсулы pH фактора в буферы фосфат натрия и извлеченные данио рерио крови. Для всех измерений изображен среднее ± стандартное отклонение. (C) репрезентативного примера в vivo мониторинга данио рерио крови рН, инкапсулированные Люминесцентную краску SNARF-1 в zebrafish Гилл капилляров. В условиях контроля рН крови остается стабильным в течение 4 часов после инъекции микрокапсулы, в то время как 5 минут воздействия под тяжелой гиперкапнией (900-1000 мг/L растворенных CO2) вызывает подкисление крови рыб. Звездочка указывает статистически значимой разницы от параллельной контрольной группы с p < 0.01 (тест U Манна-Уитни). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Чтобы продемонстрировать инъекции микрочастиц в почках данио рерио, мы использовали полупроницаемой микрокапсулы, загружен с красителем индикатора. Таким образом в протоколе содержатся инструкции для изготовления микрокапсулы, используя слой за слоем Ассамблея противоположно заряженных полиэлектролитов7,8,,1516,17 ,18 (рис. 1A). Преимуществом этой технологии является легко выполнять с доступных лабораторного оборудования. В зависимости от условий и соединений используется сфабрикованные микрокапсулы может варьироваться от 0,5 до 100 мкм с полиэлектролит нанометров толщиной оболочки15. Синтез параметры описаны в этой рукописи результат в упругих микрокапсулы, состоящий из 12 слоев полимеров (в дополнение к окончательной биосовместимых слой) около 2-6 мкм в размер (рис. 1B и 1 C). Наиболее важным шагом в определении размеров микрокапсулы является формирование шаблонов microcores. Этот процесс включает спонтанного формирования кристаллов карбоната кальция, и таким образом, полученные частицы неоднородной. Следовательно характеристику распределения размеров микрокапсульная должны выполняться для каждого пакета.
Важный этап этого протокола является оптимизация доставки микрочастиц систему кровообращения у рыбок данио без использования методов микроманипуляции. Администрация целых ячеек путем инъекций ретро орбиталь ранее описана в деталях3. Однако по нашему опыту, это не легко для начинающих пользователей, чтобы получить эффективность инъекции, описанные авторами, потому что ретро орбиталь пазухи очень маленький и расположен рядом с глотки и жаберных дуг, которые легко случайно травмировать с иглой. С менее чем миллиметр требуется точность для инъекции, должным образом путем инъекций является довольно сложной задачей. Столь же быстро и более эффективной альтернативой (Таблица 1) является впрыснуть непосредственно в паренхимы почек рыбы. Во время инъекции игла механически ущерб почечной капилляры и кровеносные сосуды (например, крупнейший задняя кардинал вен), которая позволяет входа микрочастиц систему кровообращения (Рисунок 2E). Наконец, большой центральный балдж ствола почки в взрослых рыбок данио достаточно (до 2 мм) для ручной подачи без микрохирургической техники.
Правильное позиционирование Инъекционная игла имеет решающее значение для успешного администрирования вручную. Вы можете практиковать, нахождение почки ствола в интактных животных, просвечивающий рыб, используя свет снизу, как показано на рисунке 2A и 2B. Схема на рисунке 2B показано как правильно выполнять инъекции. Если процедура не сможет администрировать микрочастиц в поток крови, повторные инъекции могут быть сделаны на же проколов в короткие сроки с практически никакого влияния на выживаемость лиц.
Инъекции в багажнике почек взрослых рыбок данио (также успешно протестированы на взрослых гуппи Poecilia reticulata) является эффективным методом микрочастица доставки в кровоток рыбы с допустимой смертности животных; Однако это не идеально подходит для препарата из-за различий в объеме введенного. Слабым местом этого метода является значительной утечки раствора из почек в брюшную полость вследствие быстрого администрации. Тем не менее относительное количество вещества, вводится в кровь может быть примерно оценена с помощью визуализации в капиллярах Гилл (Таблица 2). Существует не строгое ограничение объема впрыска, но администрация более чем 1 мкл суспензии, как представляется, оказались неэффективными. Лучших стеклянные капилляры могут быть применены для микроинъекции; Однако, потому что большое количество микрокапсулы, как правило, подстрекать агрегации, мы рекомендуем использовать 31-29G (Ø 0,33-0,25 мм) стальные иглы, чтобы избежать засоров в просвет иглы.
Успех микрокапсульная доставки через почки инъекции в кровоток должно контролироваться с помощью быстрой проверки на наличие флуоресцентные частицы в жабры. Жабры, легкодоступных органов для наблюдений в естественных условиях . Гилл нитей представляют собой сеть капилляров покрыты тонким слоем эпителия дыхательных, которая особенно удобно прижизненные изображения крови течь в жабры (своего рода природные Оптические окна). Для выполнения наблюдений, хряща жаберной крышки можно вырезать подвергать нитей. Эта процедура является безопасной для рыб, которые могут жить с оголенный жабры в хорошо газированной воды без снижения продолжительности жизни. Кроме того жабры рыбы может рассматриваться под микроскопом просто нажав крышечки из пути19. В случае успешного инъекций флуоресцентный микрочастицы сразу же появляются в жабры (рис. 3). Обратите внимание, что имплантированных микрочастицы значительно растворяются в объем циркулирующей крови и уменьшение количества частиц достичь Гилл капилляров, таким образом достаточная концентрация микрочастиц должны быть выбраны для обнаружения в жабры рыб после впрыск в рыбы почек (Таблица 2).
Предлагаемая процедура имплантации может применяться в широком диапазоне исследований с участием различных видов рыбок. Несмотря на техника, разработана и оптимизирована для инъекций флуоресцентные микрочастиц систему кровообращения он может также применяться для имплантации микро/наночастиц неокрашенные или растворенных веществ; Однако в этом случае эффективность инъекции должны быть проверены иным способом. В настоящее время описанные меры являются оптимальными для таких целей как физиологического мониторинга с использованием различных оптических микро - или Наносенсоры, Визуализация сосудистую, доставки вакцин или лекарств на некоторых оптически видимым перевозчиков и имплантации генетически модифицированные клетки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Авторы признают значительно помощью Богдан Осадчий и Евгений Протасов (Иркутский государственный университет, Россия) в рамках подготовки видео протокола. Это исследование было поддержано Российского научного фонда (#15-14-10008) и российского фонда фундаментальных исследований (#15-29-01003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
