Eenvoudig en effectief beheer en visualisatie van deeltjes in de bloedsomloop van kleine vissen met behulp van nier injectie
Summary
Dit artikel demonstreert de beginselen van een snelle, minimaal invasieve injectie van fluorescerende microdeeltjes in de circulatory system van kleine vissen en de visualisatie in vivo van het microdeeltjes in vis bloed.
Abstract
De systemische toediening van micro-formaat deeltjes in een levend organisme kan worden toegepast voor therapieën visualisatie, drugs en levering van vaccin, implantatie van transgene cellen en kleine optische sensoren. Echter intraveneuze microinjections in kleine dieren, die meestal in biologische en veterinaire laboratoria worden gebruikt, zijn zeer moeilijk en vereist opgeleid personeel. Hierin tonen wij een robuuste en efficiënte methode voor het binnenbrengen van deeltjes in de bloedsomloop van volwassen zebravissen (Danio rerio) door injectie in de nier vis. Om te visualiseren de geïntroduceerde microdeeltjes in de therapieën, stellen wij voor een eenvoudige intravital beeldvormende techniek in de kieuwen van de vis. In vivo monitoring van de zebravis bloed pH werd uitgevoerd met behulp van een ingespoten microencapsulated TL probe, SNARF-1, om aan te tonen een van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek. Dit artikel bevat een gedetailleerde beschrijving van de inkapseling van pH-gevoelige kleurstof en toont aan de beginselen van de snelle injectie en visualisatie van de verkregen microcapsules voor in vivo opname van het fluorescerende signaal. De voorgestelde methode van injectie wordt gekenmerkt door een laag sterftecijfer (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur. Alle beschreven procedures kunnen worden uitgevoerd op andere kleine vissoorten, zoals guppies en medaka.
Introduction
Het beheer van micro-formaat deeltjes in een dierlijke organisme is een belangrijke taak op gebieden zoals drugs en vaccin levering1, therapieën visualization2transgene cel implantatie3en kleine optische sensor implantatie 4 , 5. de implantatie procedure voor microscale deeltjes in het vaatstelsel van kleine laboratoriumdieren is echter moeilijk, vooral voor delicate waterorganismen. Voor specimens van de populaire onderzoek zoals zebrafish, is het raadzaam dat deze procedures worden verduidelijkt met behulp van video protocollen.
Intracardiac en capillaire microinjections nodig opgeleid personeel en unieke microchirurgie voorzieningen voor de levering van microobjects in zebrafish bloed. Eerder, een retro-orbitaal Handleiding injectie3 werd voorgesteld als een gemakkelijke en effectieve methode voor het beheer van hele cellen. Echter in onze ervaring duurt vanwege de kleine oppervlakte van het oog capillaire netwerk, het veel praktijk om het gewenste resultaat van deze techniek.
Hierin beschrijven we een methode voor robuuste en efficiënte microparticle implantatie in de bloedsomloop door Handleiding injectie rechtstreeks in het nierweefsel van volwassen zebrafish, die rijk is aan haarvaten en renale vaartuigen. Deze techniek is gebaseerd op het video protocol voor cel transplantatie in de zebravis nier6, maar de traumatische en tijdrovende microchirurgische stappen werden uitgeschakeld. De voorgestelde methode wordt gekenmerkt door lage sterfte (0-20%) en hoog rendement (70-90% succes), en het is eenvoudig in te stellen met behulp van algemeen beschikbare apparatuur.
Een belangrijk onderdeel van het voorgestelde protocol is de visualisatie van de geïmplanteerde microdeeltjes (als ze TL of colorized zijn) in de haarvaten van gill, dat voorziet in de verificatie van de kwaliteit van de injectie, een ruwe relatieve beoordeling van het aantal ingespoten deeltjes, en de opsporing van de spectrale signaal voor fysiologische metingen vanuit het circulerende bloed. Als een voorbeeld van de mogelijke toepassingen van de beschreven techniek, wij laten zien dat het protocol voor in vivo metingen van zebravis bloed pH met behulp van een microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, oorspronkelijk voorgesteld in Borvinskaya et al. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
We gebruikten om aan te tonen de injectie van microdeeltjes in de zebravis nier, semi-permeabel microcapsules geladen met een indicator kleurstof. Dus bevat het protocol instructies voor de fabricage van de microcapsules met behulp van de vergadering van de laag-voor-laag van tegengesteld geladen polyelectrolytes7,8,15,16,17 ,18</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Auteurs erkennen sterk de hulp van Bogdan Osadchiy en Evgenii Protasov (Irkoetsk State University, Rusland) ter voorbereiding van het protocol van de video. Dit onderzoek werd gesteund door de Russische Science Foundation (#15-14-10008) en de Russische Stichting voor fundamenteel onderzoek (#15-29-01003).
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. . ImageJ User Guide – Version 1.44. , (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
