Enkel og effektiv Administration og visualisering af mikropartikler i kredsløbet af små fisk ved hjælp af nyre injektion
Summary
Denne artikel viser principperne for en hurtig, minimalt invasive injektion af fluorescerende mikropartikler i circulatory system af små fisk og i vivo visualisering af mikropartikler i fisk blod.
Abstract
Systemisk administration af mikro-størrelse partikler ind i en levende organisme kan anvendes til Vaskulaturen visualisering, narkotika og vaccine levering, implantation af transgene celler og bittesmå optiske sensorer. Dog intravenøs microinjections i små dyr, der oftest anvendes i biologiske og veterinære laboratorier, er meget vanskelig og kræver uddannet personale. Heri, vise vi en robust og effektiv metode for indførelse af mikropartikler i kredsløbet af voksen zebrafisk (Danio rerio) ved indsprøjtning i fisk nyre. For at visualisere den indførte mikropartikler i Vaskulaturen, foreslår vi en simpel intravital imaging teknik i fisk gæller. In vivo overvågning af zebrafisk blod pH blev udført ved hjælp af en injiceres microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, til at vise en af de mulige anvendelser af de beskrevne teknik. Denne artikel giver en detaljeret beskrivelse af indkapsling af pH-følsom farvestof og viser principperne om hurtig injektion og visualisering af de opnåede mikrokapsler for in vivo optagelse af fluorescerende signal. Den foreslåede metode til injektion er kendetegnet ved en lav dødelighed (0-20%) og høj effektivitet (70-90% succes), og det er let at bruge almindeligt udstyr. Alle beskrevne procedurer kan udføres på andre små fiskearter såsom guppyer og medaka.
Introduction
Administration af mikro-størrelse partikler i en animalske organisme er en vigtig opgave i områder som medicin og vaccine levering1, vaskulatur visualisering2, transgene celle implantation3og lille optisk sensor implantation 4 , 5. implantation procedure for individuel partikler i det vaskulære system af små laboratoriedyr er imidlertid vanskeligt, især for sarte organismer. Til populære forskning prøver som zebrafisk, anbefales det at disse procedurer afklares ved hjælp af video protokoller.
Intracardiac og kapillær microinjections kræver uddannet personale og unikke mikrokirurgi faciliteter for levering af microobjects i zebrafisk blod. Tidligere, en retro-orbital manuel injektion3 blev foreslået som en nem og effektiv metode til administration af hele celler. Imidlertid vores erfaring tager på grund af det lille område af øjet kapillære netværk, det meget praksis at opnå det ønskede resultat fra denne teknik.
Heri, beskrive vi en metode for robust og effektiv microparticle implantation i kredsløbet ved manuel indsprøjtning direkte ind i nyrevæv af voksen zebrafisk, som er rig på kapillærer og renal fartøjer. Denne teknik er baseret på video-protokollen til celle transplantation i zebrafisk nyre6, men de traumatiske og tidskrævende microsurgical skridt blev elimineret. Den foreslåede metode er kendetegnet ved lav dødelighed (0-20%) og høj effektivitet (70-90% succes), og det er let at bruge almindeligt udstyr.
En vigtig del af den foreslåede protokol er visualisering af den implanterede mikropartikler (hvis de er fluorescerende eller farvelagt) i gill kapillærer, som giver mulighed for kontrol af injektion kvalitet, en ru relativ vurdering af antallet af injiceres partikler, og påvisning af den spektrale signal for fysiologiske målinger direkte fra den cirkulerende blod. Som et eksempel på de mulige anvendelser af de beskrevne teknik, vi udviser i protokollen for i vivo målinger af zebrafisk blod pH ved hjælp af en microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, oprindeligt foreslået i Borvinskaya mfl. 20175.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at demonstrere indsprøjtning af mikropartikler i zebrafisk nyre, brugte vi semipermeabel mikrokapsler indlæst med en indikator farvestof. Protokollen indeholder således instrukser for fabrikation af mikrokapsler ved hjælp af samlingen lag på lag af oppositely ladede polyelectrolytes7,8,15,16,17 ,18 (<strong class="x…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender stærkt ved hjælp af Bogdan Osadchiy og Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Rusland) under forberedelse af video-protokollen. Denne forskning blev støttet af den russiske Science Foundation (#15-14-10008) og den russiske Foundation for grundforskning (#15-29-01003).
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, &. #. 1. 0. 4. 5. ;., Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. . ImageJ User Guide – Version 1.44. , (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
