सरल और प्रभावी प्रशासन और छोटी मछलियों के संचार प्रणाली में Microparticles के दृश्य गुर्दे इंजेक्शन का उपयोग
Summary
यह लेख छोटी मछलियों के संचार प्रणाली में और vivo दृश्य में मछली के खून में microparticles के एक त्वरित, मिनिमली इनवेसिव इंजेक्शन फ्लोरोसेंट microparticles के सिद्धांतों को दर्शाता है ।
Abstract
एक जीवित जीव में सूक्ष्म आकार के कणों के प्रणालीगत प्रशासन vasculature दृश्य, दवा और वैक्सीन वितरण, ट्रांसजेनिक कोशिकाओं और छोटे ऑप्टिकल सेंसर के आरोपण के लिए लागू किया जा सकता है । हालांकि, नसों में microinjections छोटे जानवरों, जो ज्यादातर जैविक और पशु चिकित्सा प्रयोगशालाओं में उपयोग किया जाता है, बहुत मुश्किल है और प्रशिक्षित कर्मियों की आवश्यकता होती है । इस के साथ साथ, हम वयस्क zebrafish के संचार प्रणाली में microparticles की शुरूआत के लिए एक मजबूत और कुशल विधि का प्रदर्शन (ढाणियो rerio) मछली गुर्दे में इंजेक्शन द्वारा । vasculature में शुरू microparticles कल्पना करने के लिए, हम मछली गिल में एक सरल intravital इमेजिंग तकनीक का प्रस्ताव । zebrafish रक्त पीएच के vivo निगरानी में एक इंजेक्शन microencapsulated फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर पूरा किया गया था, SNARF-1, वर्णित तकनीक के संभावित आवेदनों में से एक को प्रदर्शित करने के लिए. इस लेख पीएच के encapsulation के प्रति संवेदनशील डाई का एक विस्तृत वर्णन प्रदान करता है और जल्दी इंजेक्शन और फ्लोरोसेंट संकेत की vivo रिकॉर्डिंग में के लिए प्राप्त microcapsules के दृश्य के सिद्धांतों को दर्शाता है । इंजेक्शन की प्रस्तावित विधि एक कम मृत्यु दर (0-20%) और उच्च दक्षता (70-90% सफलता) की विशेषता है, और यह आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर संस्थान के लिए आसान है । सभी वर्णित प्रक्रियाओं ऐसी guppies और medaka के रूप में अंय छोटी मछली प्रजातियों, पर प्रदर्शन किया जा सकता है ।
Introduction
एक पशु जीव में सूक्ष्म आकार के कणों के प्रशासन दवा और वैक्सीन वितरण के रूप में ऐसे क्षेत्रों में एक महत्वपूर्ण कार्य है1, vasculature दृश्य2, ट्रांसजेनिक सेल आरोपण3, और छोटे ऑप्टिकल सेंसर आरोपण 4 , 5. हालांकि, छोटी प्रयोगशाला पशुओं के संवहनी प्रणाली में अतिसूक्ष्म कणों के लिए आरोपण प्रक्रिया मुश्किल है, नाजुक जलीय जीवों के लिए विशेष रूप से । zebrafish जैसे लोकप्रिय शोध नमूनों के लिए, यह सलाह दी जाती है कि वीडियो प्रोटोकॉल का उपयोग करके इन प्रक्रियाओं को स्पष्ट किया जाए ।
Intracardiac और केशिका microinjections zebrafish रक्त में microobjects के वितरण के लिए प्रशिक्षित कर्मियों और अद्वितीय microsurgery सुविधाओं की आवश्यकता होती है । पहले, एक रेट्रो कक्षीय मैनुअल इंजेक्शन3 पूरी कोशिकाओं के प्रशासन के लिए एक आसान और प्रभावी तरीका के रूप में सुझाव दिया गया था । हालांकि, हमारे अनुभव में, क्योंकि नेत्र केशिका नेटवर्क के छोटे से क्षेत्र में, यह इस तकनीक से वांछित परिणाम प्राप्त करने के लिए बहुत अभ्यास लेता है ।
इस के साथ साथ, हम मैनुअल इंजेक्शन द्वारा संचार प्रणाली में मजबूत और कुशल microparticle आरोपण के लिए एक विधि का वर्णन सीधे वयस्क zebrafish, जो केशिकाओं और गुर्दे वाहिकाओं में समृद्ध है के गुर्दे के ऊतकों में । इस तकनीक zebrafish गुर्दे6में सेल ट्रांसप्लांटेशन के लिए वीडियो प्रोटोकॉल पर आधारित है, लेकिन दर्दनाक और समय लेने वाली microsurgical कदम खत्म कर दिया गया । प्रस्तावित विधि कम मृत्यु दर (0-20%) और उच्च दक्षता (70-90% सफलता) की विशेषता है, और यह आमतौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग कर संस्थान के लिए आसान है ।
प्रस्तावित प्रोटोकॉल का एक महत्वपूर्ण हिस्सा प्रत्यारोपित microparticles के दृश्य है (यदि वे फ्लोरोसेंट या रंग) में गिल केशिकाओं, जो इंजेक्शन की गुणवत्ता के सत्यापन के लिए अनुमति देता है, की संख्या का एक मोटा रिश्तेदार आकलन इंजेक्शन कणों, और परिसंचारी रक्त से सीधे शारीरिक माप के लिए वर्णक्रमीय संकेत का पता लगाने. वर्णित तकनीक के संभावित अनुप्रयोगों का एक उदाहरण के रूप में, हम vivo माप में के लिए प्रोटोकॉल प्रदर्शित zebrafish रक्त पीएच एक microencapsulated फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर, SNARF-1, मूलतः Borvinskaya एट अल में सुझाव दिया । २०१७5.
Protocol
Representative Results
Discussion
zebrafish गुर्दे में microparticles के इंजेक्शन का प्रदर्शन करने के लिए, हम अर्द्ध पारगंय microcapsules एक संकेतक डाई के साथ भरी हुई थी । इस प्रकार, प्रोटोकॉल microcapsules के निर्माण के लिए निर्देश शामिल है परत द्वारा विपरीत आरोप polyelectroly…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक बहुत वीडियो प्रोटोकॉल की तैयारी में Bogdan Osadchiy और Evgenii Protasov (इर्कुत्स्क राज्य विश्वविद्यालय, रूस) की मदद स्वीकार करते हैं । इस शोध को रूसी विज्ञान फाउंडेशन (#15-14-10008) और रूसी फाउंडेशन फॉर बेसिक रिसर्च (#15-29-01003) ने समर्थन दिया था ।
Materials
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
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