Summary
Denne artikkelen viser prinsippene for en rask, minimal invasiv injeksjon av fluorescerende microparticles i circulatory system av små fisk og i vivo -visualisering av microparticles i fisk blod.
Abstract
Systemisk administrasjonen av mikro-størrelse partikler i en levende organisme kan brukes for blodkar visualisering, narkotika og vaksine levering, implantasjon av transgene celler og små optiske sensorer. Imidlertid intravenøs microinjections til små dyr som er mest brukt i biologisk og veterinary laboratorier, er svært vanskelig og krever opplært personale. Her viser vi en robust og effektiv metode for innføring av microparticles i sirkulasjonssystemet av voksen sebrafisk (Danio rerio) ved injeksjon i fisk nyre. For å visualisere de introdusert microparticles i er blodkar, foreslår vi en enkel intravital tenkelig teknikk i fisk gjellene. I vivo overvåking av sebrafisk blod pH ble gjennomført med en injisert microencapsulated fluorescerende sondere, SNARF-1, å demonstrere en av de mulige anvendelser av beskrevet teknikken. Denne artikkelen gir en detaljert beskrivelse av innkapsling av pH-sensitive fargestoff og demonstrerer prinsippene for rask injeksjon og visualisering av de fått microcapsules for in vivo -opptak av fluorescerende. Den foreslåtte metoden av injeksjon er preget av en lav dødelighet (0-20%) og høy effektivitet (70-90% suksess), og det er lett å innføre bruk vanlig. Alle beskrevet prosedyrer kan utføres på andre små fiskearter, som guppies og medaka.
Introduction
Administrasjon av mikro-størrelse partikler i en dyr organisme er en viktig oppgave i slike områder som narkotika og vaksine levering1, blodkar visualisering2, transgene celle implantasjon3og liten optisk sensor implantasjon 4 , 5. men implantasjon prosedyren for Mikroskala partikler i vaskulære systemet av små forsøksdyr er vanskelig, spesielt for delikat vannlevende organismer. Det anbefales for populære forskning prøver som sebrafisk, som disse prosedyrene avklares med video-protokollene.
Intracardiac og kapillært microinjections krever opplært personale og unike mikrokirurgi fasiliteter for levering av microobjects til sebrafisk blod. Tidligere ble en retro-orbital manuell injeksjon3 foreslått som en enkel og effektiv metode for administrasjon av hele celler. Men i vår erfaring tar på grunn av det lite området av øyet capillary nettverket, det mye praksis for å oppnå ønsket resultat fra denne teknikken.
Her, beskriver vi en metode for robust og effektiv microparticle implantasjon i sirkulasjonssystemet ved manuell injeksjon direkte i nyre vev av voksen sebrafisk, som er rik på capillaries og nyre fartøy. Denne teknikken er basert på video protokollen for cellen transplantasjon i sebrafisk nyre6, men traumatisk og tidkrevende Mikrokirurgiske trinnene ble eliminert. Den foreslåtte metoden er preget av lav dødelighet (0-20%) og høy effektivitet (70-90% suksess), og det er lett å innføre bruk vanlig.
En viktig del av foreslåtte protokollen er visualisering av den implantert microparticles (hvis de er fluorescent eller fargelegges) i gill kapillærene, som gir mulighet for verifisering av injeksjon kvaliteten, en grov relative vurdering av antall injisert partikler, og oppdagelsen av spectral signalet for fysiologiske målinger direkte fra sirkulerende blod. Eksempel av de mulige anvendelser av beskrevet teknikken vi viser protokollen for i vivo målinger av sebrafisk blod pH bruker en microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, opprinnelig foreslått i Borvinskaya et al. 20175.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle prosedyrer ble utført i samsvar med EU-direktivet 2010/63/EU for dyreforsøk og er godkjent av det dyr fag forskning komiteen av Institutt for biologi ved Irkutsk State University.
1. fabrikasjon av Microcapsules
Merk: Microcapsules bærer en fluorescerende farge tilberedes med en lag-på-lag-samling av motsatt ladet polyelectrolytes7,8. Alle prosedyrer ble utført ved romtemperatur.
- For å syntetisere porøse CaCO3 microcores vedlagt fluorescerende fargestoff, bland 2 mL løsningen SNARF-1-dekstran (de fleste polymer-bundet fluorescerende farge som FITC-BSA kan brukes) i en konsentrasjon av ~ 2 mg/mL med 0,6 mL hver av 1 mol/L løsninger av CaCl2 og Na2CO3 under rask omrøring.
Merk: Ta hensyn til forskjellige problemområdene av fluorescerende fargestoffer til photobleaching; Hvis en lys-sensitive fluorescerende sonde (som SNARF-1) brukes, må manipulasjon og lagring av microparticles utføres med som lite lys som mulig. - Etter 5-10 s av agitasjon, overføre suspensjon til 2 mL microcentrifuge rør og sentrifuge for 15 s 10 000-12.000 g til pellets CaCO3 microcores.
- Forkaste nedbryting, vaske kjernene med ~ 2 mL deionisert vann og resuspend pellet ved å riste.
- Gjenta sentrifugering-vask tre ganger i totalt. Etter den siste sentrifugering, forkaste nedbryting.
- Inkuber microcores i 1 min i ultralydbad å redusere sine aggregering.
Advarsel: Ikke glem å beskytte ører med hodetelefoner. - For å sette inn det første polymere laget under maler, resuspend kjernene i ~ 2 mL i en 4 mg/mL løsning av poly(allylamine hydrochloride) (PAH) i 1 mol/L NaCl.
- Vær microcores løsningen for ~ 5 min med konstant risting.
- Etter 15 s sentrifugering, forkaste nedbryting med den ubundne PAH. Vask det dekket microcores med deionisert vann minst 3 ganger gjennom flere sentrifugering og vaske trinnene. Etter den siste sentrifugering, forkaste nedbryting.
- Inkuber microcores i 1 min i ultralydbad å redusere sine aggregering.
Merk: Hvis anvendt fluorescerende fargestoff er kationisk, start fra poly (natrium 4-styrenesulfonate) (PSS) i 1 mol/L NaCl (se trinn 1.7).
- Gjenta trinn 1.6 med ~ 2 mL en 4 mg/mL av PSS (også med 1 mol/L NaCl) for å sette inn det andre polymere laget på maler.
- Gjenta trinn 1.6 og 1,7 seks ganger innskudd 12 polymere lag.
Merk: Det er ikke anbefalt å ta en lang pause (~ 12 h eller mer) i prosedyren til ~ 3-5 lag har blitt avsatt fordi CaCO3 microcores uten dekning kan tendens til å recrystallize. Merk at PSS dekning forårsaker en høyere samling av microcores, og det lange pausen anbefales bare når PAH eller poly-L-lysine podet med polyetylenglykol (PLL-g-PEG) er det ytterste laget. - Inkuber dekket microcores i 2 mg/mL PLL-g-pinne (~ 1 mL per microtube) minst 2 h.
- Vask microcores med vann via sekvensiell sentrifugering og rørets trinnene. Etter den siste sentrifugering, forkaste nedbryting.
- For å få hul microcapsules, løses CaCO3 maler ved å legge til 2 mL 0.1 mol/L ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) løsning (justert til pH 7.1 med NaOH) til den dekket microcores.
- Etter ~ 5 min med inkubering, sentrifuge microcapsules for 45 s og Forkast nedbryting med EDTA.
- Gjenta trinn 1.10-1.10.1 to ganger.
- Vask microcapsules med 0,9% NaCl tre ganger gjennom flere sentrifugering trinn i 45 s etterfulgt av vaske trinnene. Etter siste sentrifugering trinn, forkaste nedbryting.
Merk: Den siste microcapsule løsningen for injeksjon holdes sterilt (for eksempel ved å legge ampicillin, 0,1 mg/mL), og media skal biokompatible med gjenstand for etterforskning (isotonic media med nøytral pH). - Beregn konsentrasjonen av de forberedt microcapsules i en hemocytometer under fluorescens mikroskop. Ta en rekke bilder av microcapsules, måle diameteren på om hundre microcapsules bruker ImageJ9 eller tilsvarende programvare og undersøke størrelsesDistribusjon bruker et histogram.
- Store innhentet innkapslet sonde i mørket.
Merk: etter flere vask i sterilt 0,9% NaCl, microcapsules kan lagres i flere måneder på 4 ° C. Det anbefales ikke å fullstendig tørke av microcapsules under lagring.
2. utarbeidelse av optisk konfigurering og kalibrering av Microencapsulated SNARF-1
Merk: Grov pH-målinger med microencapsulated SNARF-1 kan gjøres ved hjelp av bilder i to kanaler med en fluorescerende mikroskop7, men i denne protokollen en kanal fluorescerende mikroskop koblet til en fiber spectrometer ble brukt.
- Plasser det nødvendige settet med fluorescens filtre for å fluorescerende mikroskopet etter karakteristikkene av anvendt fluorescerende fargestoff og aktivere lysrøret.
- Trekk ut spaken okularene.
FORSIKTIG: Overflødig lys kan skade spectrometer matrix. Kontroller derfor at spaken er i "okularet" modus når spectrometer ikke brukes. - Koble en ende av spectrometer og den andre enden til en collimator. Bruker adaptere, plasser collimator i fokus for kameraet røret eller andre tilgjengelige porter av fluorescerende mikroskopet.
- Slå på spectrometer. Kjøre programmet spectrometer kontroll og forberede spectrometer målinger.
- Trekk ut spaken okularene.
- Plasser ~ 5 µL av microcapsule suspensjon (~ 10 000 microcapsules per µL i deionisert vann) på en microscope skyve kalibrering av microcapsule bunken og tørr fall i et mørkt sted (for eksempel i en termostat på 35 ° C).
- For å kalibrere de spektrale egenskapene av microencapsulated SNARF-1, kan du bruke en rekke buffere med ulike pH-verdier innenfor ~ 6-9. Slipp ~ 10 µL av en buffer på de tørket microcapsules med SNARF-1-dekstran og dekke det med en dekkglassvæske.
- Sett av objektglass på mikroskopet scenen. Finn microcapsules bruker et × 40 mål.
- Slå mikroskop spaken til kameraet-porten. Registrere deres fluorescens med spectrometer. Drei spake tilbake til okularene.
Merk: Kontroller at spectral signalet er langt utenfor bakgrunn, og sikre at microcapsules i synsfelt ikke er i en boble (ved å sette forstørring hvis nødvendig). Unngå langvarig belysning av de samme microcapsules. SNARF-1 er følsom for photobleaching. - Gjenta trinn 2.2.3 for forskjellige microcapsules 10 - 15 ganger.
- Beregne fluorescens høyeste forholdstallene (for eksempel R eller Scilab) for alle registrerte spectra og bestemme regresjonslinjen mellom median forhold (for hver buffer) og middels pH bruker følgende formel:
Merk: SNARF-1 har et spekter med to topper tilsvarer utslipp av protonerte og deprotonated fargestoff, og forholdet mellom toppene er mottakelig for pH i mediet. I denne studien brukes forholdet mellom fluorescens intensiteten for 605 og 660 nm. Disse bølgelengder er valgt avhengig av filteret sett brukt. en og b er koeffisienter bestemmes av ikke-lineær regresjon (for eksempel ved hjelp av R). 0,15 og 1.1 er henholdsvis minste og største verdiene i jeg605/I660 observert under kalibreringen. - Samle 10 µL av fisk blod fra ca 5 voksen dyr. Sted fisk i en Petriskål med 1 µL/mL vann suspensjon av fedd olje for anestesi og vente til dyret viser på sin side og svarer til pinches av fin (vanligvis ~ 2-3 min). Overføre fisken på et glass lysbilde. Avskåret fisk halen med lancet og samle ca 2 µL av fisk blod fra halen venen.
Merk: For å forhindre blodpropp, behandle i snitt med heparin (5000 U/mL) og bruk heparinized glass kapillærene og microcentrifuge rør for å samle blod.- Dryppe ca 10 µL av blod med en pipette onto drikkepengene av microelectrode og bestemme pH bruker en pH-meter.
- Slipp blod på et lysbilde med tørket microcapsules og registrere forholdet mellom fluorescens intensiteten som kalibrering bufferne (trinn 2.2-2.3).
- Justere lineær koeffisient kalibreringskurven å gjøre kurven samsvarer med målene i fisk blodet (for mer detaljer se Borvinskaya et al. 20175).
3. forberedelser for injeksjon
- Slipp stål nålen fra spissen av insulin pennen (eller sprøyten) ved å fjerne plast med skarpe lancet.
Merk: Noen tynn nål (Ø0.33 mm eller mindre) eller glass kapillær (vanligvis Ø1 mm) kan være forberedt på microinjection10,11. - Sett inn nålen halvveis i glass microcapillary; raskt og forsiktig loddetinn det med en gass-lommelykt.
- Koble glass microcapillary til microinjector og skylle den med sterilt vann tre ganger. Sikre at væsken flyter gjennom nålen.
- Fylle systemet med destillert vann.
Merk: Kontroller at det ikke er noen bobler i systemet.
4. injeksjon
- Resuspend forberedt suspensjon av microcapsules (i sterilt 0,9% NaCl eller andre medier brukes for injeksjoner, med en konsentrasjon på 0,5-6 millioner microcapsules per mikroliter) i 1 min i ultralydbad.
Merk: Siden microcapsules har tendens til å fremkalle, under følgende injeksjon, riste ampullen med microcapsules mekanisk (med en rotor) eller manuelt noen få minutter å resuspend dem og hindre deres aggregering. - Legg fisken i en Petriskål med bedøvelse (0,1 mL/L fedd olje suspendert i vann) for ~ 2-3 min. Vent til fisken blir på siden og slutter å svare på en lys klype fin.
- Bruke en skje, overføre fisken ut av anesthetic og forsiktig plassere den på en fuktig svamp i en lateral posisjon med hodet mot venstre (for høyrehendt person) eller mot høyre (for venstrehendt person).
- Like før injeksjon, suge 1-2 mm luft inn i glasset kapillær forbundet med microinjector. Deretter Last med ca 2 µL av spredt microcapsules.
Merk: Før injeksjon, microcapsule løsningen må justeres temperaturen som fisken holdes. - Forsiktig stabilisere kroppen av fisken på svamp med ikke-dominante hånd.
- Finne sidelinjen av fisk. Mentalt Velg et segment som strekker seg fra bløtdyr til slutten av bukhule. Finne midt i dette segmentet. Tre pinne 1 mm lavere i ventrale retning.
- Med en skraping bevegelse, forsiktig flytte fisken skalerer til side og gjøre en punktering. Sette inn nålen inn i kroppen i en vinkel på 45° til tabellen overflaten.
- Presse nålen mot ryggraden til den nøye hviler mot den.
- Slipp ca 1 µL av microcapsules' suspensjon i nyre, og sakte trekke nålen.
Merk: Du finner de riktige punktering lettere, er det nyttig å praksis å finne bagasjerommet nyrene ved transilluminating fisk med bunnen lys, som vist i figur 2A og 2B.
- Skyll fisken fra hode til hale med en strøm av vann for å fjerne alle sølt microcapsules på injeksjonsstedet.
5. i Vivo visualisering
- Bruk disseksjon saksen fjerne gill dekselet fra fisk hodet og denude fisk gjellene. Skyll gjellene med vann.
- Bruke en skje, overføre fisken et mikroskop lysbilde og plassere den på scenen av fluorescerende mikroskopet.
Merk: Kontroller at gjellene av fisken ikke tørr under påfølgende prosedyrer. For å unngå dette, periodisk fukte dem med vann med en Pasteur pipette (ca hver 1-2 min). - Mørk rommet og bruke lav forstørrelse (x 10 mål) kontroller gjellene finne fluorescerende microcapsules.
Merk: Hvis prosedyren brukes for innføring av noen fluorescerende partikler i fisk sirkulasjonssystemet, anbefales å inspisere gjellene av flere personer for uventede fluorescerende partikler før injeksjoner. Gjellene av vill-type sebrafisk har ikke autofluorescence, men i noen tilfeller sporadiske fluorescerende partikler (som maten stykker eller encellede symbionter) kan være til stede på gjellene. Hvis nødvendig, slike partikler kan gjenkjennes basert på deres spesifikke figur (for eksempel maten stykker har uregelmessig form, i motsetning til sfærisk microcapsules) eller fluorescens spektrum (dvs. farger).- Bytte linsen til en høyere styrke (× 40 mål), og Plasser en microcapsule eller en microcapsules i midten av synsfeltet.
- Slå spaken til porten med en tilkoblet spectrometer. Registrere spectral signalet.
- Drei spake tilbake til i okularet.
- Gjenta målene for forskjellige microcapsules flere ganger.
- Overføre fisken å akvariet med riktig lufting for utvinning.
Merk: Med minimal trening er det mulig å utføre injeksjon og signal opptak på en ca 2-3 minutter per fisk. Målingen kan gjentas én personlige flere ganger med bruk av gjentatte lave, ufarlig doser av anestesi eller en annen metode for fiksering. For langsiktige observasjon, bruk et system med kontinuerlig anestesi12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Innhentet resultatene kommer fra en av de tre hovedkategoriene presentert protokollen: dannelsen av fluorescerende microparticles av innkapsling av en fluorescerende farge (figur 1), nyre injeksjon av microcapsules med ytterligere effekt i Gill kapillærene (figur 2 og 3) og, til slutt, i vivo spectral opptak av SNARF-1 fluorescens overvåke blod pH-verdier (Figur 4).
Lag-på-lag tilnærming ved hjelp av malen CaCO3 kjernene omsluttende fargestoff av flere lag med motsatt belastet polymerer (PAH og PSS) og en ytterste laget av en biokompatible polymer (PLL-g-PEG) er en enkel og kostnadseffektiv metode tillater å kapsle inn ulike fluorescerende sonder som SNARF-1-dekstran, FITC-BSA eller andre (figur 1A). Som et resultat, hentes hul microcapsules av micrometric størrelse med stabil halvt gjennomtrengelig elastisk skall og lastet med fluorescerende fargestoff (figur 1B). Microcapsules fabrikkert av denne teknikken er vanligvis ikke-uniform, med en normalfordeling partikkelstørrelse og karakteristiske median størrelse i hver gruppe (figur 1С).
Figur 1 : Lag-på-lag syntese og karakterisering av hul polyelectrolyte microcapsules lastet med et fluorescerende fargestoff. (A) av en microcapsules forsamling (trukket fra et lignende oppsett publisert i Gurkov et al. 20164). (B) bilde av hul microcapsules lastet med fluorescerende farge FITC-BSA. (C) størrelse karakteristikk av gruppen av microcapsules fra figur 1B. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Robust og effektiv microparticle implantasjon i sirkulasjonssystemet av små fisk kan utføres ved manuell injeksjon direkte i fisk nyre. Punktering i riktig for fisk kroppen (bagasjerommet nyre) er avgjørende for rask levering av microparticles ved manuell injeksjon. Fisk nyre er et blodkreft organ og inneholder pigmentert melanophores, og dermed er det vel farget. Fordi det ligger mellom gjennomsiktig kamre svømmeblæren, er det lett å identifisere orgelet i intakt dyr med svak pigmentering eller ved transillumination av små fisk med bunnen lyskilde, som vist i figur 2A og 2B.
Figur 2 : Lokalisering av i stedet for nyre injeksjon. (A) Trans-belysning av sebrafisk demonstrerer lokalisering av bagasjerommet nyrene (pil). (B) ordningen illustrerer hvordan å identifisere webområdet riktig punktering. Den hvite stiplede linjen angir sidelinjen av abdominal segmentet av fisk. Pilen viser området for punktering og riktig retning av injeksjon mot ryggraden. Svømmeblæren angis av den grønne linjen. (C) visualisering av sebrafisk nyre etter fjerning av organer og kroppen veggen. En pil peker til sentrale bule av bagasjerommet nyret. (D) en sagittal histologiske del av D. rerio illustrerer de generelle anatomien i de innvendige organene av voksen fisken (H & E flekken). (E) mikroskop-bilde av en fisk nyre (prikket) skalert fra (D) med en pil som peker til lumen i bakre kardinal venen. Stjernene angir svømmeblæren. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
For å sjekke suksessen til injeksjon prosedyren, bør en rask visuell inspeksjon av gjellene ved lav forstørrelse (x10-20 mål) gjøres etter klipping fisk gill dekselet (figur 3A). Til tross for de fleste av microcapsules gjenstående på injeksjonsstedet eller smitte til kroppens hulrom (figur 3B), hvis injeksjon utføres riktig, er det mulig å observere de fluorescerende microcapsules fritt flytende i gill kapillærene av den avdekt fisk gjellene umiddelbart etter injeksjon (Figur 3 c). Hvis ingen fluorescerende partikler oppdages i gjellene, er det mulig å gjenta injeksjon i den samme punktering. Vellykket levering i blodet skal oppnås i ca 70-90% av totale injisert fisken.
Figur 3 : Nyre injeksjon av microcapsules med ytterligere effekt i gill kapillærer. (A) den generelle ordningen med microcapsule levering i sebrafisk blodet. (B) fluorescerende bilde av en sebrafisk etter injeksjon av microcapsules med grønne FITC-BSA fargestoff (punktering området er angitt med en pil). (C) dette bildet av gjellene av fisk, skaleres fra (B) viser den suksessfulle leveransen av microcapsules av nyre injeksjon (gjellene av vill-type sebrafisk har ingen autofluorescence). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Under injeksjon direkte inn fisk bagasjerommet nyre danner omfattende blåmerker normalt under det punktering området, indikerer skader parenchyma kapillærene eller nyre fartøyene. Det er ingen blod lekkasje ut av kroppen fordi punktering vises raskt kontrakt. Til tross for indre blødninger, kan enkeltpersoner fortsatt gjenopprette med ca 80-90% gjenlevende gjennom prosedyren (tabell 1). Det er også kjent at fiskearter kan regenerere nephrons de novo etter skade13,14. Hvis mer enn 20% av fisk er døende, må man sikre at anesthetization utføres riktig.
| Innkapslede fluorescerende farge | n | Konsentrasjon, microcapsules per µL | Injeksjon volum, µL | Gjennomsnittlig diameter på microcapsules, µm | Vellykket levering i fisk blodet, % | Dødelighet etter injeksjon, % | |
| 1 h | 1 dag | ||||||
| Injeksjon i bagasjerommet nyre | |||||||
| FITC-BSA | 36 | 4 x 106 | 1.6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF-1-dekstran | 29 | 3-6 x 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC-dekstran | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0,9% NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| Retro-orbital innsetting | |||||||
| FITC-BSA | 9 | 1 x 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC-dekstran | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
Tabell 1. Sikkerheten og effektiviteten av levering av microcapsules i sebrafisk blodet. Suksessen til prosedyren bestemmes av tilstedeværelse av fluorescerende materialet i fisk gill kapillærene.
Hvis konsentrasjonen av den injiserte microparticles er ikke nok, kan det hende at for få partikler tilgjengelig for visualiseres raskt i fisk gjellene. Samtidig, kan en suspensjon med for høy konsentrasjon tette nålen. I lag-på-Lag sammensatte microcapsules med median diameter ~ 2-5 µm er en konsentrasjon av ca 4 * 105-6 * 106 microcapsules per µL optimal for enkel oppdagelsen i fisk gjellene etter injeksjon i fisk nyre (tabell 2).
| Konsentrasjon, microcapsules per µL | Antall microcapsules i et mikroskop synsfelt (× 20 mål) i gjellene av ulike individer (n = 7 per konsentrasjon) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabell 2. Posten av visuelle telling av FITC BSA-inneholder microcapsules i D. rerio gjellene etter injeksjon (1.6 µL) i bagasjerommet nyrene.
Den foreslåtte metoden av microparticles' implantasjon i fisk sirkulasjonssystemet kan brukes i vivo overvåking av sebrafisk blod pH av microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1 (Figur 4). SNARF-1 har et spekter med to topper tilsvarer utslipp av protonerte og deprotonated fargestoff (figur 4A), dermed kalibreringen kurver av forholdet mellom toppene på ulike pH av media kan tegnes (figur 4B). Komponentene i blodet påvirke avlesning av innkapslede SNARF-1 (figur 4B), som kan evalueres eksperimentelt ved samtidig måling av blod pH av microcapsules og en pH-meter med et glass microelectrode. En antatte kalibreringskurven for microcapsules i sebrafisk blod skal tegnes ved skiftende bufferne kurven av koeffisient tilsvarende pH forskjellen målt eksperimentelt (se Borvinskaya et al. 20175 for detaljer).
Blod pH i sebrafisk gill kapillærene holder seg stabil i flere timer etter injeksjon av microcapsules (figur 4C). Samtidig fører en kort hypercapnic eksponering til en statistisk signifikant reduksjon av blod pH, som viser anvendelse av metoden for i vivo forskning på små fisker.
Figur 4 : Representativt eksempel på overvåking sebrafisk blod РН av registrering av til fluorescens spectra microencapsulated fargestoff SNARF-1. (A) spektra av de forberedt microcapsules lastet med SNARF-1 i natrium fosfat buffere på ulike pH. (B) kalibrering kurver av forberedt pH-sensitive microcapsules natrium fosfat buffere og utdraget sebrafisk blod. For alle målinger, er gjennomsnittlig ± standardavviket avbildet. (C) et representativt eksempel av i vivo sebrafisk blod рН av innkapslede fluorescerende SNARF-1 fargestoff i sebrafisk gill kapillærer. I kontroll forhold fortsatt blod pH stabil under 4 timer etter injeksjon av microcapsules, mens 5 minutter eksponering under alvorlig hypercapnia (900-1000 mg/L av oppløst CO2) forårsaker forsuring fisk blod. Stjerne angir statistisk signifikant forskjell fra parallell kontrollgruppen med p < 0,01 (Mann-Whitney U test). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For å demonstrere injeksjon av microparticles i sebrafisk nyre, brukte vi halvt gjennomtrengelig microcapsules lastet med en indikator fargestoff. Dermed inneholder protokollen instruksjoner for fabrikasjon av microcapsules ved hjelp av lag-på-lag montering av motsatt ladet polyelectrolytes7,8,15,16,17 ,18 (figur 1A). En fordel med denne teknologien er at det er enkelt å utføre med tilgjengelig laboratorieutstyr. Avhengig av forholdene og forbindelser som brukes, kan de ferdige microcapsules være fra 0,5 til 100 µm med nanometer tykke polyelectrolyte shell15. Syntese parameterne som beskrives i dette manuskriptet resultatet i elastisk microcapsules bestående av 12 lag (i tillegg til det endelige biokompatible laget) av polymerer ca 2-6 µm i størrelse (figur 1B og 1 C). Det viktigste å bestemme størrelsen på microcapsules er dannelsen av malen microcores. Denne prosessen innebærer spontane dannelsen av kalsiumkarbonat krystaller, og derfor innhentet partiklene er ikke-uniform. Derfor skal karakteristikk av størrelsesDistribusjon microcapsule utføres for hver gruppe.
Den viktige fasen av denne protokollen er optimalisering av levering av microparticles til sebrafisk sirkulasjonssystemet uten bruk av micromanipulation teknikker. Administrasjon av hele celler av retro-orbital innsetting har tidligere blitt beskrevet i detalj3. Men i vår erfaring er det ikke lett for nybegynnere å få Injeksjonseffektiviteten beskrevet av forfatterne fordi retro-orbital sinus er meget små og ligger nær svelg og gill bueganger som er lett å utilsiktet skade med en nål. Siden mindre enn en millimeter nøyaktighet er påkrevd for injeksjoner, injeksjonsbruk riktig er ganske vanskelig oppgave. En like rask og mer effektiv alternativ (tabell 1) er å injisere direkte inn fisk nyre parenchyma. Under injeksjon skader nålen mekanisk nyre blodkar og blod fartøy (f.eks største bakre kardinal venen) hvilke innrømmer inngangen til microparticles i sirkulasjonssystemet (figur 2E). Til slutt, den sentrale bule av bagasjerommet nyrene i voksen sebrafisk er stor nok (opptil 2 mm) for en manuell injeksjon uten Mikrokirurgiske utstyr.
Riktig plassering av injeksjon nålen er avgjørende for en vellykket manuell administrasjon. Du kan øve finne bagasjerommet nyrene i intakt dyr av transilluminating fisk med bunnen lys, som vist i figur 2A og 2B. Oppsettet i figur 2B demonstrerer hvordan riktig utføre injeksjon. Hvis prosedyren ikke administrere microparticles i blodet, gjøres re injeksjon på den samme punktering innen en kort tidsramme med nesten ingen effekt på overlevelse av enkeltpersoner.
Injeksjon i bagasjerommet nyre av voksen sebrafisk (også testet på voksne guppy Poecilia reticulata) er en effektiv metode for microparticle levering i fisk blodet med en tillatte dyr dødelighet; men er det ikke perfekt egnet for narkotika administrasjon på grunn av variasjoner i injisert volumet. Det svake punktet i denne teknikken er en betydelig lekkasje av løsningen av nyrene i magen på grunn av rask administrasjonen. Likevel kan en relativ mengde stoffet injiseres inn i blodet være grovt estimert bruke visualisering i gill kapillærene (tabell 2). Det er ingen streng begrensning av injeksjon, men av mer enn 1 µL av suspensjon synes å være ineffektiv. Fineste glass kapillærene kan brukes for microinjection; men fordi mange microcapsules tendens til å egge aggregering, anbefaler vi bruk av 31-29G (Ø 0,33-0,25 mm) stål nåler å unngå tresko i p-lumen.
Suksessen til microcapsule levering gjennom nyre injeksjon i blodet bør overvåkes med rask inspeksjon for tilstedeværelsen av fluorescerende partikler i gjellene. Gjellene er lett tilgjengelig organer for i vivo observasjoner. Gill filamenter er et nettverk av blod kapillærer dekket av et tynt lag av respiratoriske epitel, som gjør intravital imaging blod flyte i gjellene spesielt praktisk (en slags naturlige optisk vindu). For å utføre observasjon, kan brusk gill dekselet bli kuttet for å avsløre filamenter. Denne fremgangsmåten er trygt for fisk, som kan leve med avdekt gjellene på bra karbonisert vann uten en nedgang i forventet levealder. Gjellene av stor fisk kan videre undersøkes under et mikroskop ved å skyve bløtdyr av måten19. Ved en vellykket injeksjon vises fluorescerende microparticles umiddelbart i gjellene (Figur 3). Merk at implantert microparticles er betydelig oppløst i sirkulerende blod volumet, og et redusert antall partikler nå gill kapillærene, dermed tilstrekkelig konsentrasjonen av microparticles bør velges til oppdaging i fisk gjellene etter injeksjon i fisk nyre (tabell 2).
Foreslåtte prosedyren for implantasjon kan brukes i en rekke studier som involverer ulike arter av små fisk. Til tross for teknikken har blitt utviklet og optimalisert for injeksjon av fluorescerende microparticles i sirkulasjonssystemet, den kan også brukes for implantasjon av ikke-farget mikro/nanopartikler eller oppløst stoffer; men bør i dette tilfellet effektiviteten av injeksjon kontrolleres på en annen måte. Som beskrives fremgangsmåten er optimal for slike formål som fysiologiske overvåking bruke forskjellige optisk mikro - eller nanosensors, visualisering av blodkar, levering av vaksiner eller narkotika på noen optisk synlige bærere og implantering av genmodifiserte celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne bekrefter sterkt hjelp av Bogdan Osadchiy og Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Russland) i utarbeidelsen av video protokollen. Denne forskningen ble støttet av den russiske Science Foundation (#15-14-10008) og russiske Foundation for grunnleggende forskning (#15-29-01003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
