Cet article illustre les principes d’une injection rapide et mini-invasive de microparticules fluorescentes dans le circulatory system de petits poissons et de la visualisation en vivo des microparticules dans le sang du poisson.
L’administration systémique de taille micro particules dans un organisme vivant peut être appliquée pour la visualisation du système vasculaire, drogue et administration de vaccins, implantation de cellules transgéniques et de minuscules capteurs optiques. Toutefois, des microinjections intraveineuse en petits animaux, qui sont principalement utilisés dans les laboratoires biologiques et vétérinaires, sont très difficiles et nécessitent un personnel formé. Ici, nous démontrons une méthode robuste et efficace pour l’introduction de microparticules dans le système circulatoire du adult poisson zèbre (Danio rerio) par injection dans le rein de poissons. Pour visualiser les microparticules introduites dans le système vasculaire, nous proposons une technique d’imagerie intravitale simple dans les branchies des poissons. Surveillance in vivo du poisson-zèbre pH sanguin a été accompli à l’aide d’une injection fluorescentes microencapsulés probe, SNARF-1, afin de démontrer une des applications possibles de la technique décrite. Cet article fournit une description détaillée de l’encapsulation de colorant sensibles au pH et illustre les principes de l’injection rapide et visualisation des microcapsules obtenues pour in vivo d’enregistrement du signal fluorescent. La méthode proposée d’injection se caractérise par un taux de mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible. Toutes les procédures décrites peuvent être exécutées sur d’autres espèces de petits poissons, comme les guppys et chez les sujets exposés.
L’administration de taille micro particules dans l’organisme animal est une tâche importante dans des domaines tels que la drogue et vaccin livraison1, système vasculaire visualisation2, implantation de cellules transgéniques3et implantation de minuscules capteurs optiques 4 , 5. Toutefois, la procédure d’implantation pour les particules de micro-échelle dans le système vasculaire des petits animaux de laboratoire est difficile, surtout pour les organismes aquatiques sensibles. Pour les échantillons de recherche populaires comme le poisson-zèbre, il est conseillé que ces procédures de préciser à l’aide de protocoles vidéo.
Microinjections intracardiaques et capillaires nécessitent un personnel formé et des installations de microchirurgie unique pour la livraison de microobjects dans le sang du poisson-zèbre. Auparavant, un rétro-orbitaire injection manuelle3 a été proposé comme une méthode simple et efficace pour l’administration de cellules entières. Cependant, dans notre expérience, à cause de la petite surface du réseau capillaire oeil, il faut beaucoup de pratique pour atteindre les résultats escomptés de cette technique.
Ici, on décrit une méthode pour l’implantation de microparticules robustes et efficaces dans le système circulatoire par injection manuelle directement dans le tissu rénal du poisson-zèbre adulte, qui est riche en capillaires et de vaisseaux rénaux. Cette technique est basée sur le protocole vidéo greffe de cellules dans le poisson-zèbre rein6, mais les opérations microchirurgicales traumatiques et beaucoup de temps ont été éliminées. La méthode proposée se caractérise par une mortalité faible (0-20 %) et un rendement élevé (70-90 % de réussite) et il est facile d’instituer à l’aide de matériel couramment disponible.
Une partie importante du protocole proposé est la visualisation de l’implanté microparticules (s’ils sont fluorescents ou colorisée) dans les capillaires de gill, qui permet la vérification de la qualité de l’injection, une évaluation approximative relative du nombre de injection de particules et la détection du signal spectral pour mesures physiologiques directement à partir de la circulation sanguine. Par exemple des applications possibles de la technique décrite, nous démontrons le protocole pour des mesures in vivo du poisson-zèbre pH du sang à l’aide d’une sonde fluorescente microencapsulée, SNARF-1, initialement suggéré dans Borvinskaya et al. 20175.
Pour illustrer l’injection de microparticules dans les reins de poisson-zèbre, nous avons utilisé semi-perméable microcapsules chargées avec un colorant indicateur. Ainsi, le protocole contient des instructions pour la fabrication de microcapsules à l’aide de l’Assemblée de couche par couche de charge opposée polyélectrolytes7,8,15,16,17 ,<…
The authors have nothing to disclose.
Auteurs reconnaissent grandement l’aide de Bogdan Osadchiy et Evgenii Protasov (Université d’état d’Irkoutsk, Russie) dans l’élaboration du protocole vidéo. Cette recherche a été financée par la Fondation russe de la Science (#15-14-10008) et la Fondation russe pour la recherche fondamentale (#15-29-01003).
SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |