Summary
Denne artikel viser principperne for en hurtig, minimalt invasive injektion af fluorescerende mikropartikler i circulatory system af små fisk og i vivo visualisering af mikropartikler i fisk blod.
Abstract
Systemisk administration af mikro-størrelse partikler ind i en levende organisme kan anvendes til Vaskulaturen visualisering, narkotika og vaccine levering, implantation af transgene celler og bittesmå optiske sensorer. Dog intravenøs microinjections i små dyr, der oftest anvendes i biologiske og veterinære laboratorier, er meget vanskelig og kræver uddannet personale. Heri, vise vi en robust og effektiv metode for indførelse af mikropartikler i kredsløbet af voksen zebrafisk (Danio rerio) ved indsprøjtning i fisk nyre. For at visualisere den indførte mikropartikler i Vaskulaturen, foreslår vi en simpel intravital imaging teknik i fisk gæller. In vivo overvågning af zebrafisk blod pH blev udført ved hjælp af en injiceres microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, til at vise en af de mulige anvendelser af de beskrevne teknik. Denne artikel giver en detaljeret beskrivelse af indkapsling af pH-følsom farvestof og viser principperne om hurtig injektion og visualisering af de opnåede mikrokapsler for in vivo optagelse af fluorescerende signal. Den foreslåede metode til injektion er kendetegnet ved en lav dødelighed (0-20%) og høj effektivitet (70-90% succes), og det er let at bruge almindeligt udstyr. Alle beskrevne procedurer kan udføres på andre små fiskearter såsom guppyer og medaka.
Introduction
Administration af mikro-størrelse partikler i en animalske organisme er en vigtig opgave i områder som medicin og vaccine levering1, vaskulatur visualisering2, transgene celle implantation3og lille optisk sensor implantation 4 , 5. implantation procedure for individuel partikler i det vaskulære system af små laboratoriedyr er imidlertid vanskeligt, især for sarte organismer. Til populære forskning prøver som zebrafisk, anbefales det at disse procedurer afklares ved hjælp af video protokoller.
Intracardiac og kapillær microinjections kræver uddannet personale og unikke mikrokirurgi faciliteter for levering af microobjects i zebrafisk blod. Tidligere, en retro-orbital manuel injektion3 blev foreslået som en nem og effektiv metode til administration af hele celler. Imidlertid vores erfaring tager på grund af det lille område af øjet kapillære netværk, det meget praksis at opnå det ønskede resultat fra denne teknik.
Heri, beskrive vi en metode for robust og effektiv microparticle implantation i kredsløbet ved manuel indsprøjtning direkte ind i nyrevæv af voksen zebrafisk, som er rig på kapillærer og renal fartøjer. Denne teknik er baseret på video-protokollen til celle transplantation i zebrafisk nyre6, men de traumatiske og tidskrævende microsurgical skridt blev elimineret. Den foreslåede metode er kendetegnet ved lav dødelighed (0-20%) og høj effektivitet (70-90% succes), og det er let at bruge almindeligt udstyr.
En vigtig del af den foreslåede protokol er visualisering af den implanterede mikropartikler (hvis de er fluorescerende eller farvelagt) i gill kapillærer, som giver mulighed for kontrol af injektion kvalitet, en ru relativ vurdering af antallet af injiceres partikler, og påvisning af den spektrale signal for fysiologiske målinger direkte fra den cirkulerende blod. Som et eksempel på de mulige anvendelser af de beskrevne teknik, vi udviser i protokollen for i vivo målinger af zebrafisk blod pH ved hjælp af en microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1, oprindeligt foreslået i Borvinskaya mfl. 20175.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle procedurer blev gennemført i overensstemmelse med EU direktiv 2010/63/EU for dyreforsøg og er blevet godkendt af dyr fag forskning Udvalget af biologisk Institut i Irkutsk State University.
1. fabrikation af mikrokapsler
Bemærk: Mikrokapsler transporterer et fluorescerende farvestof er udarbejdet ved hjælp af en lag-på-lag forsamling af oppositely ladede polyelectrolytes7,8. Alle procedurer blev udført ved stuetemperatur.
- For at syntetisere porøse CaCO3 microcores omslutter den fluorescerende farvestof, Bland 2 mL af SNARF-1-dextran (de fleste polymer-bundet fluorescerende farvestof som FITC-BSA kan bruges) i en koncentration på ~ 2 mg/mL med 0,6 mL hver af 1 mol/L løsninger af CaCl2 og Nielsen2CO3 under hurtig omrøring.
Bemærk: Opmærksomme på de forskellige følsomheder af fluorescerende farvestoffer til photobleaching; Hvis et lysfølsomt fluorescerende sonde (ligesom SNARF-1) bruges, skal manipulation og opbevaring af mikropartikler udføres med som lille lys som muligt. - Efter 5-10 s agitation, overføre suspension til 2 mL microcentrifuge rør og centrifugeres i 15 s på 10.000-12.000 g at sammenpresse CaCO3 microcores.
- Supernatanten, vaske kerner med ~ 2 mL deioniseret vand og resuspenderes ved omrystning.
- Gentag proceduren centrifugering-vask tre gange i alt. Efter den sidste centrifugering, supernatanten.
- Inkubér microcores for 1 min i et ultralydsbad til at reducere deres sammenlægning.
Advarsel: Glem ikke at beskytte ører med hovedtelefoner. - For at deponere det første polymere lag på skabelonerne, resuspend borekerner i ~ 2 mL af 4 mg/mL opløsning af poly(allylamine hydrochloride) (PAH) i 1 mol/L NaCl.
- Holde microcores i løsning for ~ 5 min. under konstant omrystning.
- Efter 15 s af centrifugering, supernatanten med den ubundne PAH. Vaske den overdækket microcores med deioniseret vand mindst 3 gange gennem flere centrifugering og vaske trin. Efter den sidste centrifugering, supernatanten.
- Inkubér microcores for 1 min i et ultralydsbad til at reducere deres sammenlægning.
Bemærk: Hvis den anvendes fluorescerende farvestof er kationiske, start fra poly (natrium 4-styrenesulfonate) (PSS) i 1 mol/L NaCl (Se trin 1.7).
- Gentag trin 1,6 med ~ 2 mL af 4 mg/mL opløsning af PSS (også indeholdende 1 mol/L NaCl) for at deponere det andet polymere lag på skabelonerne.
- Gentag trin 1,6 og 1,7 seks gange til at deponere 12 polymere lag.
Bemærk: Det anbefales ikke at tage en lang pause (~ 12 h eller mere) lag i proceduren indtil ~ 3-5 er blevet deponeret fordi CaCO3 microcores uden dækning kan have tendens til at recrystallize. Bemærk, at PSS dækning medfører en højere sammenlægning af microcores, og den lange pause er tilrådeligt kun når PAH eller poly-L-lysin podet med polyethylen glycol (PLL-g-PLØK) er det yderste lag. - Inkuber den overdækket microcores i 2 mg/mL PLL-g-PEG (~ 1 mL pr microtube) i mindst 2 timer.
- Vask microcores med vand via sekventielle centrifugering og resuspension trin. Efter den sidste centrifugering, supernatanten.
- For at opnå hule mikrokapsler, opløse CaCO3 skabeloner ved at tilføje 2 mL 0,1 mol/L ethylendiamintetra syre (EDTA) opløsning (indstillet til pH 7.1 med NaOH) til den overdækkede microcores.
- Efter ~ 5 min inkubation, centrifugeres mikrokapsler for 45 s og kassér supernatanten med EDTA.
- Gentag trin 1.10-1.10.1 to gange.
- Vaske mikrokapsler med 0,9% NaCl tre gange gennem flere centrifugering skridt inden for 45 s fulgt ved at vaske trin. Efter den sidste centrifugering trin, supernatanten.
NOTE: Den endelige microcapsule injektionsvæske skal holdes sterilt (for eksempel ved at tilføje ampicillin, 0,1 mg/mL), og medierne bør biokompatible med henblik på undersøgelse (isotonisk medier med neutral pH). - Skøn af den koncentration af de forberedte mikrokapsler i en hemocytometer under et fluorescens mikroskop. Tage en række billeder af mikrokapsler, måle diameteren af om hundrede mikrokapsler bruger ImageJ9 eller tilsvarende software, og undersøge størrelse distribution ved hjælp af et histogram.
- Butik den opnåede indkapslet sonden i mørke.
Bemærk: efter flere vask i steril 0,9% NaCl, mikrokapsler kan opbevares i flere måneder ved 4 ° C. Komplet tørring af mikrokapsler under opbevaringen kan ikke anbefales.
2. fremstilling af optiske opsætning og kalibrering af Microencapsulated SNARF-1
Bemærk: Ru pH målinger med microencapsulated SNARF-1 kan gøres ved hjælp af billeder i to kanaler med en fluorescerende mikroskop7, men i denne protokol, en one-kanal fluorescerende mikroskop tilsluttet en fiber spektrometer blev anvendt.
- Placer fluorescens filtre til fluorescerende mikroskopet efter forholdene i den anvendte fluorescerende farvestof kræves sæt og tænde lysstofrør.
- Trække ud i håndtaget til okularerne.
Forsigtig: Overskydende lys kan beskadige spektrometer matrix. Således, Sørg for, at håndtaget er i tilstanden "okularet" når spektrometeret ikke bruges. - Tilslut den ene ende af den optiske fibre til spektrometret og anden enden til en kollimator. Bruge adaptere, placere kollimatoren i fokus for kamera tube eller andre tilgængelige port af fluorescerende mikroskop.
- Drej på spektrometret. Køre programmet spektrometer kontrol og spektrometret til målinger.
- Trække ud i håndtaget til okularerne.
- For kalibrering af microcapsule partiet, placere ~ 5 µL af microcapsule suspension (~ 10 000 mikrokapsler pr. µL i ionbyttet vand) på et objektglas, og tørre drop i et mørkt sted (for eksempel i en termostat ved 35 ° C).
- Hvis du vil kalibrere spectral Karakteristik af den microencapsulated SNARF-1, skal du bruge en række buffere med forskellige pH-værdier i intervallet ~ 6-9. Drop ~ 10 µL af en buffer på de tørrede mikrokapsler med SNARF-1-dextran og dække det med en coverslip.
- Placer glas dias på stadiet mikroskop. Find mikrokapsler ved hjælp af en × 40 mål.
- Drej mikroskop løftestang til kamera-porten. Registrere deres fluorescens med spektrometeret. Drej håndtaget tilbage til okularerne.
Bemærk: Sørg for den spektrale signal er langt ud over baggrundsværdien, og sikre at mikrokapsler i synsfeltet ikke er i en boble (ved at skifte til en lavere forstørrelse, hvis nødvendigt). Undgå længere illumination af de samme mikrokapsler. SNARF-1 er følsomme over for photobleaching. - Gentag trin 2.2.3 for forskellige mikrokapsler 10 - 15 gange.
- Beregne fluorescens toppen nøgletal (f.eks. ved hjælp af R eller Scilab) for alle registrerede spectra og bestemme regressionslinjen mellem median ratio (for hver buffer) og mellemstore pH ved hjælp af følgende formel:
Bemærk: SNARF-1 har et spektrum med to spidser, der svarer til udledningen af protonated og deprotonated dye, og forholdet mellem toppene er lydhør over for pH i mediet. I denne undersøgelse bruges forholdet mellem fluorescens-intensiteten for 605 og 660 nm. Disse bølgelængder er valgt afhængigt af det filter, der bruges. a og b er koefficienter, der fastsættes af ikke-lineær regression (f.eks. ved hjælp af R). Værdier 0,15 og 1.1 er henholdsvis de minimale og maksimale værdier af jeg605/I660 observeret under kalibreringen. - Indsamle omkring 10 µL af fisk blod fra ca 5 voksne dyr. Plads fisk i en petriskål med 1 µL/mL vand suspension af Fed olie for anæstesi og vente, indtil dyret tænder på sin side og svarer ikke til pinches af fin (normalt ~ 2-3 min). Overføre fisken på et glas dias. Afbrød fiskehale med en lancet og indsamle ca 2 µL af fisk blod fra hale vene.
Bemærk: For at forhindre blodpropper, behandle snit med heparin (5000 U/mL) og bruge heparinized glas kapillærer og microcentrifuge rør til at indsamle blod.- Drypper omkring 10 µL af blod med en pipette på spidsen af mikroelektrode og bestemme pH med et pH-meter.
- Dråbe blod på et dias med tørrede mikrokapsler og registrere forholdet mellem fluorescens-intensiteten som beskrevet for kalibrering buffere (trin 2.2-2.3).
- Justere den lineær udvidelseskoefficient på kalibreringskurven for at kurven passer målinger i fisk blod (for flere detaljer se Borvinskaya et al. 20175).
3. forberedelse til injektion
- Frigive jern nålen fra spidsen af insulin pennen (eller sprøjte) ved at fjerne plastik med en skarp lancet.
Bemærk: En tynd nål (Ø0.33 mm eller mindre) eller glas kapillær (normalt Ø1 mm) kan være forberedt på mikroinjektion10,11. - Indsætte nålen halvvejs i glas microcapillary; hurtigt og forsigtigt lodde det ved hjælp af en gas fakkel.
- Tilsluttes microinjector glas microcapillary og skyl det med sterilt vand tre gange. Sikre, at væsken løber gennem nålen.
- Fyld systemet med destilleret vand.
Bemærk: Sørg for der er ingen bobler i systemet.
4. indsprøjtning
- Resuspend rede suspension af mikrokapsler (i steril 0,9% NaCl, eller andre medier bruges til injektioner, med en koncentration på 0,5-6 millioner mikrokapsler pr. microliter) ved hjælp af ultralyd badet i 1 minut.
Bemærk: Da mikrokapsler tendens til at udfælde, under følgende injektionen, ryste hætteglasset med mikrokapsler mekanisk (ved hjælp af en rotor) eller manuelt hver par minutter resuspend dem og forhindre deres akkumulering. - Læg fisken i en petriskål med bedøvelsesmiddel (0,1 mL/L af Fed olie suspenderet i vand) til ~ 2-3 min. vent indtil fisken tænder på sin side og svarer ikke til en lys knivspids af fin.
- Ved hjælp af en ske, overføre fisk ud af narkose og Anbring det forsigtigt på en fugtig svamp i sideleje med hovedet mod venstre (for højrehåndede person) eller mod højre (for venstrehåndede person).
- Lige før injektionen, suge 1-2 mm luft i glasset kapillær forbundet med microinjector. Derefter, indlæse det med ca. 2 µL af de spredte mikrokapsler.
Bemærk: Før injektionen, microcapsule løsning skal justeres til den temperatur, som fiskene holdes. - Forsigtigt stabilisere kroppen af fisk på svamp med ikke-dominerende hånd.
- Find sidelinjen af fisk. Mentalt Vælg et segment, der strækker sig fra laag til slutningen af bughulen. Find midten af dette segment. Sætte nålen 1 mm lavere i den ventrale retning.
- Med en skrabning bevægelse, forsigtigt flytte fisk skalaer til side, og gøre en punktering. Indsætte nålen ind i kroppen i en vinkel på 45° med bordpladen.
- Skubbe nål mod rygsøjlen, indtil det omhyggeligt hviler mod det.
- Frigiver ca 1 µL af mikrokapsler suspension til nyrerne, og langsomt hæve nålen.
Bemærk: For at finde webstedet korrekt punktere mere let, det er nyttigt at praksis at finde trunk nyre af transilluminating fisk ved hjælp af en bunden light, som vist i figur 2A og 2B.
- Skyl fiskene fra hoved til hale med en strøm af vand for at fjerne enhver spildt mikrokapsler på injektionsstedet.
5. in Vivo visualisering
- Bruge dissektion saks til at fjerne gælledækket fra fisk hoved og denude fisk gæller. Skyl gæller med vand.
- Ved hjælp af en ske, overføre fisken på et objektglas, og placere den på scenen i fluorescerende mikroskop.
Bemærk: Sørg for, at gællerne af fisk ikke udtørre under successive procedurer. For at undgå dette, periodisk fugte dem med vand ved hjælp af Pasteurs pipette (ca hver 1-2 min). - Mørkere rummet og ved hjælp af lav forstørrelse (x 10 mål) inspicere gæller til at finde de fluorescerende mikrokapsler.
Bemærk: Når proceduren bruges til indførelsen af nogle fluorescerende partikler i fisk kredsløbssygdomme, anbefales det at inspicere gællerne af flere personer for uventede fluorescerende partikler før injektioner. Gællerne af vildtype zebrafisk har ikke autofluorescence, men i nogle tilfælde sporadiske fluorescerende partikler (ligesom maden stykker eller encellede symbionter) kan være til stede på gællerne. Hvis nødvendigt, sådanne partikler kan genkendes baseret på deres specifikke form (f.eks. fødevarer stykker har uregelmæssig form, i modsætning til sfæriske mikrokapsler) eller fluorescens spektrum (dvs. farve).- Skifte linsen til en højere størrelsesorden (× 40 mål), og Placer en microcapsule eller en gruppe af mikrokapsler i midten af synsfeltet.
- Drej håndtaget til port med en tilsluttet spektrometer. Optage den spektrale signal.
- Drej håndtaget tilbage til okularet.
- Gentag målingen for forskellige mikrokapsler flere gange.
- Overføre fisken til akvarium med ordentlig udluftning til nyttiggørelse.
Bemærk: Med minimal praksis er det muligt at udføre injektion og signal optagelse med en omtrentlig hastighed på 2-3 min. pr. fisk. Målingen kan gentages for en individuel flere gange med brug af gentagne lav, harmløs doser af anæstesi eller en anden metode til fiksering. For langsigtet observation, skal du bruge et system med kontinuerlig anæstesi12.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De opnåede resultater kommer fra en af de tre hovedkategorier af præsenteres protokollen: dannelsen af fluorescerende mikropartikler af indkapsling af et fluorescerende farvestof (figur 1), nyre injektion af mikrokapsler med yderligere visualisering i Gill kapillærer (figur 2 og 3) og endelig, i vivo spektrale optagelsen af SNARF-1 fluorescens at overvåge blod pH niveauer (figur 4).
Lag på lag tilgang med belægning af skabelon CaCO3 kerner omslutter farvestoffet af flere lag af oppositely opkrævet polymerer (PAH og PSS) og en yderste lag af et biokompatibelt polymer (PLL-g-PLØK) er en enkel og omkostningseffektiv metode gør det muligt for at indkapsle forskellige fluorescerende sonder SNARF-1-dextran, FITC-BSA eller andre (figur 1A). Som et resultat, er hule mikrokapsler af micrometric størrelse med stabil semipermeabel elastisk skaller og lastet med den fluorescerende farvestof opnået (figur 1B). Mikrokapsler fabrikeret af denne teknik er typisk ikke ensartet, med en normal fordeling af partikelstørrelsen og karakteristiske median størrelse i hver batch (figur 1С).
Figur 1 : Lag-på-lag syntese og karakterisering af hule polyelectrolyte mikrokapsler fyldt med et fluorescerende farvestof. (A) ordning af en mikrokapsler Forsamling (trukket fra en lignende ordning offentliggjort i Gurkov et al. 20164). (B) billede af hule mikrokapsler fyldt med fluorescerende farvestof FITC-BSA. (C) størrelse karakterisering af parti af mikrokapsler fra figur 1B. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Robust og effektiv microparticle implantation i kredsløbet af små fisk kan udføres ved manuel indsprøjtning direkte i fisk nyre. Punktering i ordentlig stedet for fisk krop (trunk nyre) er afgørende for hurtig levering af mikropartikler ved manuel injektion. Fisk nyre er en hæmatopoietisk orgel og indeholder pigmenterede melanophores, og dermed, det er godt farvet. Fordi det er beliggende mellem gennemsigtig kamre af svømme blæren, er det nemt at identificere organet i det intakte dyr med svag pigmentering eller ved gennemlysning af små fisk ved hjælp af en bunden lyskilde, som vist i figur 2A og 2B.
Figur 2 : Lokalisering af det ordentlige site for nyre injektion. (A) Trans-belysning af zebrafisk viser lokalisering af trunk nyre (pil). (B) ordningen illustrerer, hvordan til at identificere webstedet korrekt punktere. Den hvide stiplede linje angiver sidelinjen af den abdominale segment af fisk. Pilen angiver webstedet for punktering og den korrekte retning af injektion mod rygsøjlen. Svømme blæren er udpeget af den grønne linje. (C) visualisering af zebrafisk nyre efter fjernelse af organer og kroppen væggen. En pil peger på den centrale bule i trunk nyrerne. (D) en sagittal histologiske sektion af D. rerio illustrerer den generelle anatomi af de indre organer hos de voksne fisk (H & E pletten). (E) Mikrograf af en fisk nyre (prikket) skaleres fra (D) med en pil, der peger til lumen af de bageste kardinal vene. Stjerner angiver svømme blæren. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
For at kontrollere succes af proceduren indsprøjtning, bør en hurtig besigtigelse af gæller på lav forstørrelse (x10-20 mål) ske efter opskæring fisk gælledækket (figur 3A). Trods det meste af mikrokapsler resterende på injektionsstedet eller breder sig i kroppen hulrum (figur 3B), hvis injektionen udføres korrekt, det er muligt at observere de fluorescerende mikrokapsler frit svævende i gill kapillærerne af den blottet fisk gæller umiddelbart efter injektion (figur 3 c). Hvis ingen fluorescerende partikler er påvist i gællerne, er det muligt at gentage injektion i den samme punktering. Vellykket levering til blodbanen bør opnås i ca 70-90% af den samlede injiceres fisk.
Figur 3 : Nyre injektion af mikrokapsler med yderligere visualisering i gill kapillærer. (A) den samlede ordning af microcapsule levering i zebrafisk blodbanen. (B) fluorescerende billedet af en zebrafisk efter injektion af mikrokapsler med grønne FITC-BSA farvestof (punktering site er angivet med en pil). (C) dette billede af gællerne af fisk, skaleres fra (B), viser den succesrige levering af mikrokapsler af nyre injektion (gællerne af vildtype zebrafisk har ingen autofluorescence). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Under injiceres direkte i fisk trunk nyre danner omfattende blå mærker normalt under webstedet punktering med angivelse af skader på parenkym kapillærer eller de renale fartøjer. Der er ingen blod lækage ud af kroppen, fordi punktering synes at hurtigt kontrakt. På trods af indre blødninger, kan enkeltpersoner stadig gendanne med ca. 80-90% overlever gennem proceduren (tabel 1). Det er også kendt at fiskearter kan regenerere nephrons de novo efter skade13,14. Hvis mere end 20% af fisk er ved at dø, skal man sikre, at anesthetization er udført korrekt.
| Indkapslede fluorescerende farvestof | n | Koncentration, mikrokapsler pr. µL | Injektionsvolumen, µL | Gennemsnitlig diameter af mikrokapsler, µm | Vellykket levering til blodbanen fisk % | Dødelighed efter injektion, % | |
| 1 h | 1 dag | ||||||
| Injektion i trunk nyre | |||||||
| FITC-BSA | 36 | 4 x 106 | 1,6 | 2.7 | 94 | 8 | 3 |
| SNARF-1-dextran | 29 | 3-6 x 105 | 1-2 | 5.1 | 72 | 7 | 12 |
| RITC-dextran | 20 | 6 x 106 | 2 | 2.0 | 70 | 0 | 0 |
| 0,9% NaCl | 41 | - | 1-2 | - | - | 5 | 0 |
| Retro-orbital injektion | |||||||
| FITC-BSA | 9 | 1 x 105 | 2 | 4.2 | 11 | 22 | 0 |
| RITC-dextran | 11 | 6 x 106 | 1 | 2.0 | 9 | 18 | 0 |
Tabel 1. Sikkerheden og effektiviteten af levering af mikrokapsler i zebrafisk blodbanen. Resultat af indgrebet er bestemt af tilstedeværelsen af de fluorescerende materialer i fisk gill kapillærer.
Hvis koncentrationen af det injicerede mikropartikler er utilstrækkelig, kan også få partikler findes visualiseres hurtigt i fisk gæller. På samme tid, kan en suspension med en for høj koncentration tilstoppe nålen. I tilfælde af lag på lag forsamlede mikrokapsler med median diameter ~ 2-5 µm er en koncentration på ca 4 * 105-6 * 106 mikrokapsler pr. µL optimal for ubesværet detection i fisk gæller efter indsprøjtning i fisk nyre (tabel 2).
| Koncentration, mikrokapsler pr. µL | Antallet af mikrokapsler i et mikroskop synsfelt (× 20 mål) i gællerne af forskellige individer (n = 7 pr. koncentration) | ||||||
| 4 x 106 | > 100 | > 100 | 0 | > 100 | ≈ 70 | ≈ 50 | > 100 |
| 4 x 105 | ≈ 10 | ≈ 20 | 0 | 0 | ≈ 20 | ≈ 40 | ≈ 15 |
| 4 x 104 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| 4 x 103 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
Tabel 2. Optag af visuelle optællingen af FITC-BSA-holdige mikrokapsler i D. rerio gæller efter injektion (1,6 µL) i trunk nyre.
Den foreslåede metode af mikropartikler implantering i fisk kredsløbssygdomme kan anvendes i vivo overvågning af zebrafisk blod pH ved microencapsulated fluorescerende sonde, SNARF-1 (figur 4). SNARF-1 har et spektrum med to toppe svarende til emission af protonated og deprotonated farvestoffet (figur 4A), dermed kalibreringen kurver af forholdet mellem toppene på forskellige pH medier kan være afbildet (figur 4B). Komponenter af blod påvirke udlæsning af indkapslede SNARF-1 (figur 4B), som kan evalueres eksperimentelt ved samtidig måling af pH i blodet af mikrokapsler og et pH-meter med en glas mikroelektrode. En formodede kalibreringskurven for mikrokapsler i zebrafisk blod skal afbildes ved at flytte buffere kurve med den koefficient, der svarer til pH måles eksperimentelt (Se Borvinskaya et al. 20175 for detaljer).
PH i blodet i zebrafisk gill kapillærer forbliver stabil i mindst flere timer efter injektion af mikrokapsler (figur 4 c). På samme tid fører en kort udsættelse for hypercapnic til et statistisk signifikant fald i pH i blodet, som demonstrerer anvendeligheden af metoden for i vivo forskning på små fisk.
Figur 4 : Repræsentativt for overvågning af zebrafisk blod РН ved registrering af fluorescens-spektre af microencapsulated farvestof SNARF-1. (A) spektre af de forberedte mikrokapsler fyldt med SNARF-1 i natrium fosfat buffere på forskellige pH. (B) kalibreringskurverne af de forberedte pH-følsom mikrokapsler i natrium fosfat buffere og udpakkede zebrafisk blod. For alle målinger, er gennemsnit ± standardafvigelse afbildet. (C) et repræsentativt eksempel på i vivo overvågning af zebrafisk blod рН af indkapslede fluorescerende SNARF-1 farvestof i zebrafisk gill kapillærer. I kontrol betingelser forbliver pH i blodet stabil i løbet af 4 timer efter injektion af mikrokapsler, mens 5 minutter eksponering under svær hyperkapni (900-1000 mg/L af opløste CO2) forårsager forsuring af fisk blod. Stjerne angiver statistisk signifikant forskel fra den parallelle kontrolgruppe med p < 0,01 (Mann-Whitney U test). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at demonstrere indsprøjtning af mikropartikler i zebrafisk nyre, brugte vi semipermeabel mikrokapsler indlæst med en indikator farvestof. Protokollen indeholder således instrukser for fabrikation af mikrokapsler ved hjælp af samlingen lag på lag af oppositely ladede polyelectrolytes7,8,15,16,17 ,18 (figur 1A). En fordel ved denne teknologi er, at det er let at udføre med tilgængelige laboratorieudstyr. Forhold og forbindelser, der anvendes, kan de opdigtede mikrokapsler spænder fra 0,5 til 100 µm med nanometer tyk polyelectrolyte shell15. Syntese parametre er beskrevet i dette manuskript resultat i elastisk mikrokapsler bestående af 12 lag (ud over den endelige biokompatible lag) af polymerer ca 2-6 µm i størrelse (figur 1B og 1 C). Det vigtigste skridt i fastsættelse af størrelsen af mikrokapsler er dannelsen af skabelon microcores. Denne proces indebærer den spontane dannelse af calciumcarbonat krystaller, og derfor opnåede partiklerne er ikke ensartet. Derfor, en karakterisering af microcapsule størrelse distribution skal udføres for hver batch.
En vigtig etape i denne protokol er optimering af leveringen af mikropartikler i zebrafisk kredsløbssygdomme uden brug af micromanipulation teknikker. Administration af hele celler af retro-orbital injektion er tidligere blevet beskrevet i detaljer3. Imidlertid vores erfaring er det ikke let for nybegyndere at opnå injektion effektiviteten beskrevet af forfatterne fordi retro-orbital sinus er meget små og ligger tæt på svælg og gælle buer, som let kan ved et uheld komme til skade med en nål. Siden mindre end en millimeter nøjagtighed er påkrævet for injektioner, at indsprøjte ordentligt er en temmelig vanskelig opgave. En lige så hurtig og mere effektiv alternativ (tabel 1) er at injicere direkte ind i fisk nyre parenkym. Under injektionen skader nålen mekanisk renal kapillærer og blodkar (f.eks. den største posterior kardinal vene), som giver mulighed for indgangen af mikropartikler i kredsløbssygdomme (figur 2E). Endelig, den centrale bule i trunk nyrerne i voksen zebrafisk er stor nok (op til 2 mm) til en manuel injektion uden microsurgical udstyr.
Den korrekte placering af injektion nålen er afgørende for en vellykket manuel administration. Du kan øve dig at finde trunk nyre i intakte dyr af transilluminating fisk ved hjælp af en bunden light, som vist i figur 2A og 2B. Ordningen i figur 2B viser, hvordan man korrekt udføre injektionen. Hvis proceduren ikke administrere mikropartikler i blodbanen, kan reinjektion foretages på den samme punktering inden for en kort tidsramme med næsten ingen indflydelse på overlevelsesraten for enkeltpersoner.
Injektion i trunk nyre af voksen zebrafisk (også med succes afprøvet på voksne guppy Poecilia reticulata) er en effektiv metode til microparticle levering til fisk blodbanen med en tilladte dyr dødelighed; Det er dog ikke velegnet for drug administration på grund af variationer i den injicerede volumen. Et svagt punkt i denne teknik er en væsentlig lækage af løsning ud af nyre i maven på grund af den hurtige administration. Ikke desto mindre, en relativ mængde stof sprøjtes ind i blodbanen kan groft skønnes ved hjælp af visualisering i gill kapillærer (tabel 2). Der er ingen strenge begrænsning af Injektionsvolumen, men administrationen af mere end 1 µL af suspensionen synes at være ineffektive. De fineste glas kapillærer kan anvendes til mikroinjektion; men fordi et stort antal mikrokapsler tendens til at anspore til sammenlægning, anbefaler vi brug af 31-29G (Ø 0,33-0,25 mm) stål nåle til at undgå træsko i nål lumen.
Succesen af microcapsule levering gennem nyrerne injektion i blodbanen bør overvåges ved hjælp af hurtig kontrol for tilstedeværelse af de fluorescerende partikler i gællerne. Gæller er let tilgængelige organer til i vivo observationer. Gill filamenter er et netværk af Blodkapillærer er dækket af et tyndt lag af respiratoriske epitel, hvilket gør intravital billeddannelse af blodet flyde i gællerne især praktisk (en slags naturlige optiske vindue). For at udføre observationen, kan brusk gællelåget skæres for at udsætte filamenter. Denne procedure er sikker for fisk, der kan leve med blottet gæller i godt beluftet vand uden et fald i levealder. Derudover kan gællerne af store fisk undersøges under et mikroskop simpelthen ved at skubbe laag ud af den måde19. I tilfælde af en vellykket injektion fremstår fluorescerende mikropartikler umiddelbart i gællerne (figur 3). Bemærk, at implanterede mikropartikler er betydeligt opløst i den cirkulerende blodvolumen, og et reduceret antal partikler nå gill kapillærer, dermed tilstrækkelig koncentration af mikropartikler bør vælges til påvisning i fisk gæller efter indsprøjtning i fisk nyre (tabel 2).
Den foreslåede procedure til implantation kan anvendes i en bred vifte af undersøgelser, hvor forskellige arter af små fisk. Trods den teknik har udviklet og optimeret til injektion af fluorescerende mikropartikler i kredsløbet, det kan også anvendes til implantering af ikke-farvet micro/nanopartikler eller opløste stoffer; men i dette tilfælde effektiviteten af injektion bør kontrolleres på anden måde. I øjeblikket beskrives trinnene er optimal for sådanne formål som fysiologiske overvågning ved hjælp af forskellige optiske mikro - eller sensorer, visualisering af Vaskulaturen, levering af vacciner eller medicin på nogle optisk synlige luftfartsselskaber og implantation af genetisk modificerede celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne anerkender stærkt ved hjælp af Bogdan Osadchiy og Evgenii Protasov (Irkutsk State University, Rusland) under forberedelse af video-protokollen. Denne forskning blev støttet af den russiske Science Foundation (#15-14-10008) og den russiske Foundation for grundforskning (#15-29-01003).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SNARF-1-dextran, 70000 MW | Thermo Fisher Scientific | D3304 | Fluorescent probe. Any other appropriate polymer-bound fluorescent dye can be used as a microcapsule filler |
| Albumin-fluorescein isothiocyanate conjugate (FITC-BSA) | SIGMA | A9771 | Fluorescent probe |
| Rhodamine B isothiocyanate-Dextran (RITC-dextran) | SIGMA | R9379 | Fluorescent probe |
| Calcium chloride | SIGMA | C1016 | CaCO3 templates formation |
| Sodium carbonate | SIGMA | S7795 | CaCO3 templates formation |
| Poly(allylamine hydrochloride), MW 50000 (PAH) | SIGMA | 283215 | Cationic polymer |
| Poly(sodium 4-styrenesulfonate), MW 70000 (PSS) | SIGMA | 243051 | Anionic polymer |
| Poly-L-lysine [20 kDa] grafted with polyethylene glycol [5 kDa], g = 3.0 to 4.5 (PLL-g-PEG) | SuSoS | PLL(20)-g[3.5]-PEG(5) | Final polymer to increase the biocompatibility of microcapsules |
| Sodium chloride | SIGMA | S8776 | To dissolve applied polymers |
| Water Purification System | Millipore | SIMSV0000 | To prepare deionized water |
| Magnetic stirrer | Stegler | For CaCO3 templates formation | |
| Eppendorf Research plus pipette, 1000 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Eppendorf Research plus pipette, 10 µL | Eppendorf | Dosing solutions | |
| Pipette tips, volume range 200 to 1000 µL | F.L. Medical | 28093 | Dosing solutions |
| Pipette tips, volume range 0.1-10 μL | Eppendorf | Z640069 | Dosing solutions |
| Mini-centrifuge Microspin 12, High-speed | BioSan | For microcapsule centrifugation-washing procedure | |
| Microcentrifuge tubes, 2 mL | Eppendorf | Z666513 | Microcapsule synthesis and storage |
| Shaker Intelli-mixer RM-1L | ELMY Ltd. | To reduce microcapsule aggregation | |
| Ultrasonic cleaner | To reduce microcapsule aggregation | ||
| Head phones | To protect ears from ultrasound | ||
| Ethylenediaminetetraacetic acid | SIGMA | EDS | To dissolve the CaCO3 templates |
| Monosodium phosphate | SIGMA | S9638 | Preparation of pH buffers |
| Disodium phosphate | SIGMA | S9390 | Preparation of pH buffers |
| Sodium hydroxide | SIGMA | S8045 | To adjust the pH of the EDTA solution and buffers |
| Thermostat chamber | To dry microcapsules on glass slide | ||
| Hemocytometer blood cell count chamber | To investigate the size distribution and concentration of the prepared microcapsules | ||
| Fluorescent microscope Mikmed 2 | LOMO | In vivo visualization of microcapsules in fish blood | |
| Set of fluorescent filters for SNARF-1 (should be chosen depending on the microscope model; example is provided) | Chroma | 79010 | Visualization of microcapsules with fluorescent probes |
| Fiber spectrometer QE Pro | Ocean Optics | Calibration of microcapsules under microscope | |
| Optical fiber QP400-2-VIS NIR, 400 μm, 2 m | Ocean Optics | To connect spectrometer with microscope port | |
| Collimator F280SMA-A | Thorlabs | To connect spectrometer with microscope port | |
| Glass microscope slide | Fisherbrand | 12-550-A3 | Calibration of microcapsules under microscope |
| Coverslips, 22 x 22 mm | Pearl | MS-SLIDCV | Calibration of microcapsules under microscope |
| Glass microcapillaries Intra MARK, 10 µL | Blaubrand | BR708709 | To collect fish blood |
| Clove oil | SIGMA | C8392 | Fish anesthesia |
| Lancet No 11 | Apexmed international B.V. | P00588 | To cut the fish tail and release the steel needle from the tip of insulin autoinjector |
| Heparin, 5000 U/mL | Calbiochem | L6510-BC | For treating all surfaces that come in contact with fish blood during fish blood collection |
| Seven 2 Go Pro pH-meter with a microelectrode | Mettler Toledo | To determine fish blood pH | |
| Insulin pen needles Micro-Fine Plus, 0.25 x 5 mm | Becton, Dickinson and Company | For injection procedure. Any thin needle (Ø 0.33 mm or less) is appropriate | |
| Glass capillaries, 1 x 75 mm | Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co | 9201075 | For injection procedure |
| Gas torch | To solder steel needle to glass capillary | ||
| Microinjector IM-9B | NARISHIGE | For precise dosing of microcapsules suspension | |
| Petri dishes, 60 mm x 15 mm, polystyrene | SIGMA | P5481 | For manipulations with fish under anesthesia |
| Plastic spoon | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Damp sponge | For manipulations with fish under anesthesia | ||
| Dissection scissors | Thermo Scientific | 31212 | To remove the gill cover from the fish head |
| Pasteur pipette, 3.5 mL | BRAND | Z331767 | To moisten fish gills |
References
- Rivas-Aravena, A., Sandino, A. M., Spencer, E. Nanoparticles and microparticles of polymers and polysaccharides to administer fish vaccines. Biol. Res. 46 (4), 407-419 (2013).
- Yashchenok, A. M., Jose, J., Trochet, P., Sukhorukov, G. B., Gorin, D. A. Multifunctional polyelectrolyte microcapsules as a contrast agent for photoacoustic imaging in blood. J. Biophotonics. 9 (8), 792-799 (2016).
- Pugach, E. K., Li, P., White, R., Zon, L. Retro-orbital injection in adult zebrafish. J. Vis. Exp. (34), e1645 (2009).
- Gurkov, A., Shchapova, Е, Bedulina, D., Baduev, B., Borvinskaya, E., Timofeyev, M. Remote in vivo stress assessment of aquatic animals with microencapsulated biomarkers for environmental monitoring. Sci. Rep. 6, e36427 (2016).
- Borvinskaya, E., Gurkov, A., Shchapova, E., Baduev, B., Shatilina, Z., Sadovoy, A., et al. Parallel in vivo monitoring of pH in gill capillaries and muscles of fishes using microencapsulated biomarkers. Biol. Open. 6 (5), 673-677 (2017).
- Diep, C. Q., Davidson, A. J. Transplantation of cells directly into the kidney of adult zebrafish. J. Vis. Exp. (51), e2725 (2011).
- Kreft, O., Javier, A. M., Sukhorukov, G. B., Parak, W. J. Polymer microcapsules as mobile local pH-sensors. J. Mater. Chem. 17 (42), 4471-4476 (2007).
- Sadovoy, A., Teh, C., Korzh, V., Escobar, M., Meglinski, I. Microencapsulated bio-markers for assessment of stress conditions in aquatic organisms in vivo. Laser Phys. Lett. 9 (7), 542-546 (2012).
- Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - Version 1.44. , imagej.nih.gov/ij/docs/guide/ (2012).
- Poland, R. S., Bull, C., Syed, W. A., Bowers, M. S. Rodent brain microinjection to study molecular substrates of motivated behavior. J. Vis. Exp. (103), e53018 (2015).
- Liu, L., Duff, K. A technique for serial collection of cerebrospinal fluid from the cisterna magna in mouse. J. Vis. Exp. (21), e960 (2008).
- Johnston, L., Ball, R. E., Acuff, S., Gaudet, J., Sornborger, A., Lauderdale, J. D. Electrophysiological recording in the brain of intact adult zebrafish. J. Vis. Exp. (81), e51065 (2013).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the adult zebrafish kidney. J. Vis. Exp. (54), e2839 (2011).
- McKee, R. A., Wingert, R. A. Zebrafish renal pathology: Emerging models of acute kidney injury. Curr Pathobiol Rep. 3 (2), 171-181 (2015).
- Donath, E., Sukhorukov, G. B., Caruso, F., Davi, S. A., Möhwald, H. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes. Angew. Chem. Int. Ed. 37 (17), 2201-2205 (1998).
- Antipov, A. A., Shchukin, D., Fedutik, Y., Petrov, A. I., Sukhorukov, G. B., Möhwald, H. Carbonate microparticles for hollow polyelectrolyte capsules fabrication. Colloids Surf. A. 224, 175-183 (2003).
- Gaponik, N., Radtchenko, I. L., Gerstenberger, M. R., Fedutik, Y. A., Sukhorukov, G. B., Rogach, A. L. Labeling of biocompatible polymer microcapsules with near-infrared emitting nanocrystals. Nano Lett. 3 (3), 369-372 (2003).
- Volodkin, D. V., Larionova, N. I., Sukhorukov, G. B. Protein encapsulation via porous CaCO3 microparticles templating. Biomacromolecules. 5 (5), 1962-1972 (2004).
- Tzaneva, V., Perry, S. F. A Time differential staining technique coupled with full bilateral gill denervation to study ionocytes in fish. J. Vis. Exp. (97), e52548 (2015).
